Dr. Eduardo Rodriguez Aplicaciones biotecnológicas Fisiología Bacteriana

Transcripción

1 Búsqueda de nuevos antibióticos Ingeniería metabólica de policétidos Dr. Eduardo Rodriguez Aplicaciones biotecnológicas Fisiología Bacteriana

2 Fisiología Bacteriana Aplicaciones Biotecnológicas Productos Naturales (metabolitos secundarios) Búsqueda Nuevos Compuestos Biosíntesis de Compuestos Policétidos Ingeniería de Metabólica de Policétidos

3 Productos Naturales: Metabolitos Secundarios Productos Naturales producidos por Plantas, Hongos o Bacterias que no son escenciales para el crecimiento pero que otorgan alguna ventaja adaptativa a su productor

4 Productos Naturales: Clasificación Estructural kanamycin - Policetónicos (PK) Acidos Carboxílicos (esteres de CoA) - Pétidos Sintesis No Ribosomales (NRPS) Aminoácidos - Terpenoides Isoprenos - Alcaloides Triptofano - Carbohidratos Azúcares - Hibridos: PK-NRP; NRP-Isoprenoides

5 Actividades Biológicas kanamycin Antibioticos (penicilina G, kanamicina, erythromycin, tetracycline,) Antiparasitarios (avermectin) Anticancerigenos (epothilone D, rebecamicina, doxorubicina, C-1027) Immunosupresores (rapamycin, cyclosporin) Reductores de Colesterol (Lovastatin) Captadores de luz (Caroteno), resistencia a UV y anti-insectisida (Maysina)

6 Mayores Productores de Compuestos Naturales: Actinomycetes Genilloud (2010) J Ind Microbiol Biotechnol

7 Género Streptomyces Producen 55% ATB de uso medicinal Incluyen: Policetónicos Macrólidos y Aromáticos, Peptidos de Síntesis no Ribosomal, β-lactámicos, Policetónico- NRPS hibridos, Cumarinas y Polipirroles.

8 Productos Naturales: Antibióticos Christoffersen (2006) NATURE BIOTECHNOLOGY 24(12)

9 Fisiología Bacteriana Aplicaciones Biotecnológicas Productos Naturales (metabolitos secundarios) Búsqueda Nuevos Compuestos Biosíntesis de Compuestos Policétidos Ingeniería de Metabólica de Policétidos

10 Aislamiento de Productos Naturales: Nuevas estructuras? Walsh (2003) Nat Review Micro 66 (1)

11 Aislamiento Tradicional de Productos Naturales Muestra de suelo - Optimizar crecimiento de microorganismos - Preparar extractos celulares - Ensayar contra cepas testigos - Purificar compuesto activo Fuentes alternativas Bacterias no cultivable Ensayos diferenciables - Nuevas técnicas de cultivo: enriquecimiento - Aislamiento de AND: Expresión de rutas en bacterias cultivables - Ingeniería metabólica en bacterias cultivables

12 Género Streptomyces

13 Análisis de genomas de actinomicetes Aigle y col. (2014 J Ind Microbiol Biotechnol 41:

14 Análisis de genomas de actinomicetes Wong and Khosla. Current Opinion in Chemical Biology 2012, 16:

15 Enriquecimiento de muestras del suelo Capilar lleno de buffer que contiene un atrayente para los actinomicetos móviles Granos de polen que flotan en una suspensión de suelo como cebos para actinomicetos móviles Muestra de suelo incubada con carbonato de calcio para enriquecer la población de Actinokineospora spp. Crecimiento de actinomicetos a partir de restos radiculares de plantas para Actinomycetos endofíticos Hayakawa (2008) Actinomycetologica 22:12 19

16 Estrategia de screening diferencial Young y col (2006) AAC 50(2): ; Wang y col (2007) PNAS 104(18):

17 Estrategia de screening diferencial: Mycobacterias Pyridomycin Estudios bioquímicos y estructurales muestran que pyridomycin inhibe la enoilreductasa InhA directamente como un inhibidor competitivo del sitio de unión NADH y de esta manera se inhibe la síntesis de ácidos micólicos en M. tuberculosis. Hartkoorn y col. (2012) EMBO Mol Med 4,

18 Búsqueda a partir de Nuevos Nichos: Esponjas marinas

19 Cultivo de microorganismos no cultivables: ichip Ling y col Nature 517:

20 Cultivo de microorganismos no cultivables: ichip Ling y col Nature 517:

21 NRP: Teixobactin Ling y col Nature 517:

22 Fisiología Bacteriana Aplicaciones Biotecnológicas Productos Naturales (metabolitos secundarios) Búsqueda Nuevos Compuestos Biosíntesis de Compuestos Policétidos Ingeniería de Metabólica de Policétidos

23 Biosíntesis Ac. Grasos y Policétidos FAS Doxociclina PKS 6-deoxyerythronolide B

24 FAS vs PKS

25 Clasificación Estructural de FAS Tipo I Iterativa Tipo II Iterativa

26 Clasificación Estructural y Mecanística de PKSs Tipo I Iterativa Tipo I Modular No Iterativa Tipo II Iterativa Tipo III

27 Interacción ACP con Dominios de PKS PKS Tipo I PKS Tipo II Walsh, Antibiotics ASM Press Ed 2003

28 Activación de las PKS Walsh, Antibiotics ASM Press Ed 2003

29 Tipos de PKSs Jenke-Kodama and Dittmann, Phitchesmistry 2009

30 PKS Tipo I Modular Iterativa Yadav et al, PLOS 2010

31 PKS Tipo II Iterativa: policétidos aromáticos Hertweck Angew Chem Int Ed 2009

32 Policetónicos aromáticos de Hongos Crowford and Townsen Nat Rev Micro 2010

33 PKS Tipo III iterativa de Plantas Hertweck Angew Chem Int Ed 2009

34 Modificaciones Post Chalcona Sintasa Grotewold Ann Rev Plant Biol 2006

35 PKS Tipo I Modular No Iterativa: macrólidos Gulder et al, Top Curr Chem 2011

36 Diversidad estructural de los policétidos Policetido sintasa o PKS - U. inicio y elongación - Longitud cadena - Grado de reducción - Estereoquímica Diversidad Modificaciones post-pks - Aromatizaciones - Acilaciones - Alquilaciones - Oxidaciones - Glicosilaciones

37 Fisiología Bacteriana Aplicaciones Biotecnológicas Productos Naturales (metabolitos secundarios) Búsqueda Nuevos Compuestos Biosíntesis de Compuestos Policétidos Ingeniería de Metabólica de Policétidos

38 Química medicinal tradicional ª Generación 2ª Generación 3ª Generación

39 Cluster de Genes PK/NRP FK520

40 Precursores de Policetónicos Walton et al, J Ind Micro Biotech 2005

41 Dominio Aciltransferasa: AT Jenke-Kodama and Dittmann, Phitchesmistry 2009

42 Precursores de FAS vs PKS Iniciadores Elongantes Walsh, Antibiotics ASM Press Ed 2003

43 Biosíntesis de eritromicina 6-dEB sintasa (DEBS) - Saccharopolispora erythraea

44 Biosíntesis Combinatoria McDaniel et al PNAS 2000

45 Biosíntesis Combinatoria McDaniel et al PNAS 2000

46 Streptomyces as heterologous host Rodriguez et al, Meth Enzy 2009

47 Modificaciones Post-PKS Más comumes: Alquilaciones Oxidaciones / reducciones Glicosilaciones Metilaciones Alogenaciones Compuestos Bioactivos Interación con el target celular Mejoran Propiedades Farmacologicas

48 Ingeniería de policétidos glicosilados

49 Bioingeniería de Metabolitos Secundarios Thibodeaux et al Nature 2007

50 Bioingeniería de Metabolitos Secundarios Thibodeaux et al Nature 2007

51 Bioingeniería de Metabolitos Secundarios Thibodeaux et al Nature 2007

52 Bioingeniería de Metabolitos Secundarios Thibodeaux et al Nature 2007

53 Bioingeniería de Metabolitos Secundarios Thibodeaux et al Nature 2007

54 Biosíntesis de Eritromicina Conversión de 6-dEB en eritromicina A Hidroxilaciones Glicosilaciones (micarose y desosamine) Metilación

55 Operón micarosa: conversión de 6-dEB a MEB Peiru et al, Appl Env Micro 2005

56 Operón desosamina: conversión de MEB a EriC Peiru et al, Appl Env Micro 2005

57 Producción de Eritromicina en E. coli Movilizar las vías de decoración del 6-dEB: Micarosa (6 genes) Desosamina (6 genes) Comunes (2 genes) Hidroxilasas (2 genes) Peiru et al, Appl Env Micro 2005

58 Producción de Eritromicina en E. coli a partir de propionato Peiru et al, Appl Env Micro 2005

59 Cluster de genes de biosíntesis de megalomicina Peiru et al, Appl Env Micro 2005

60 Actividad biológica de las megalomicinas Megalomicinas (M. megalomicea) Propiedades antivirales y antiparasitarias distintivas Nuevas drogas terapéuticas - Potencial farmacológico - Baja toxicidad Escasa disponibilidad y falta de herramientas genéticas

61 Producción de Megalomicina en E. coli Operon megosamina : megbvi megdii megdiii megdiv megdv megdvi megdi Useglio et al Appl Env Micro 2010

62 Producción de Análogos de Megalomicina TDP-L-megosamine OH O O OH OH HO O O N(CH 3 ) 2 H 3 C HO N(CH 3 ) 2 O OTDP MegDI MegDVI OH O O OH O O HO O N(CH 3 ) 2 OH N(CH 3 ) 2 O TLC EriA Meg-EriA O O OCH 3 O O OCH 3 O OH O OH Erythromycin A Megosaminyl-Ery A N N N(CH 3 ) 2 OH O OH OH HO O O N(CH 3 ) 2 OH O OH O O HO O O OH N(CH 3 ) 2 Azi Meg-Azi O O OCH 3 O O OCH 3 O Azithromycin OH O OH Megosaminyl-Azithromycin Useglio et al No publicado

63 Producción de Análogos de Megalomicina Useglio et al No publicado

64 Ciclo de vida de Plasmodium falciparum

65 Actividad biológica de meg-ea y meg-azi Actividad antibacteriana Levemente menor a la de EA y Azi Actividad antimalárica Frente a cultivos in vitro de eritrocitos infectados con P. falciparum Frente a P. berghei en el estadío exoeritrocitico del ciclo de vida. Aumento de efectividad luego de una exposición corta (48hs) Permanecen efectivos a cc. micromolares luego de una exposición prolongada (120hs) Meg-Azi: IC 50 de 6.9 µm Azi: IC 50 de 40 µm Meg-Azi nuevo mecasnimo de acción? Posibilidad de desarrollar un macrolido megosaminilado que no presente actividad antibacteriana y estudiar sus propiedades como antimalárico

66 Producción de nuevos análogos: Macrólidos alternativos En todos los casos la actividad antibacteriana disminuía con respecto a la de Azi.

67 Producción de nuevos análogos

68 Resumen Productos Naturales Búsqueda de nuevos compuestos Definición y Clasificación Biosíntesis de Policétidos y Clasificación de las PKSs PKS Tipo I PKS Tipo II PKS Tipo III Biosíntesis de Péptidos No Ribosomales (NRP) PKS/NRPS Híbridas Biosíntesis de Precursores Modificaciones post-pks Generación de análogos Expresión heteróloga