Métodos y criterios de análisis de variedades promisorias de Musáceas

Transcripción

1 Métodos y criterios de análisis de variedades promisorias de Musáceas Ing. Wilfredo Flores del Valle GUÍA PRÁCTICA PARA INICIATIVAS AGROINDUSTRIALES 1

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3 PROYECTO FTG 7010/2007: Mejoramiento de la calidad de vida en las comunidades rurales de cuatro países de América Latina y el Caribe a través de innovaciones tecnológicas en la producción, procesamiento agroindustrial y mercadeo del plátano. Métodos y criterios de análisis de variedades promisorias de Musáceas Ing. Wilfredo Flores del Valle

4 Ficha técnica: Flores, W. Recopilación de métodos y criterios de análisis de variedades promisorias de musáceas. Proyecto Fontagro FTG-7010/2007. CITA. Bioversity Internacional. San José Costa Rica Musáceas Análisis físicos, químicos valor funcional Agradecimiento: Al personal del Programa de Desarrollo Agroindustrial Rural (DAIR CITA), en especial a Vidal González y Adriana Vargas Vargas por sus aportes en la edición de este documento. 4

5 Contenido 1. Introducción Análisis fisico-químicos de especies promisorias Características Post-cosecha en la Cosecha Evaluación de las características post-cosecha en la cosecha Evaluación de la vida verde Evaluación de la Calidad de la Fruta Durante la Maduración Evaluación de los cambio en el contenido total de sólidos solubles Evaluación de los cambios en el ph Acidez total titulable (Método AQCITA-M011) Azúcares por HPLC (Método AQCITA-M006) Almidones por método enzimático (Método AQCITA-M018) Cenizas (Método AQCITA-M004) Fibra dietética total por método enzimático (Método AQCITA-M007) Grasa cruda por extracto etéreo (Método AQCITA-M0005) Humedad (sólidos totales) (Método AQCITA-M002) Proteína o nitrógeno total por método Kjeldahl utilizando equipo Foss Tecator (Método AQCITA-M003) Carbohidratos totales (por diferencia) Carbohidratos disponibles (por diferencia) Calorías Calorías por grasa BIBLIOGRAFÍA

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7 I. Introducción. Las musáceas se consumen crudos en su estado maduro o cocidos en diferentes recetas tradicionales, tanto verdes como maduros, y una muy pequeña porción se procesan agroindustrialmente para obtener productos con una vida útil más prolongada. Sin embargo, los productos procesados artesanalmente y culinariamente forman parte de la dieta de los millones de personas de las zonas productoras de plátanos y bananos (musáceas) alrededor del mundo. La agroindustrialización es una manera de preservar los plátanos. Pero la cantidad, la manera y la conveniencia de procesar variedades promisorias de musáceas son relativamente desconocidas, y por lo tanto se deben de evaluar para determinar su calidad y conveniencia para agroindustrializar (Dadzie & Orchard, 1997). En este documento se muestran los métodos y criterios para la caracterización agroindustrial de variedades promisorias de musáceas adoptados por el Programa de Desarrollo Agroindustrial Rural del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) de la Universidad de Costa Rica. Existen varios criterios para la evaluación de variedades promisorias de banano y plátano, dentro de los que se pueden enumerar los siguientes (Dadzie & Orchard, 1997): Características post-cosecha durante la cosecha. Vida verde y vida anaquel. Calidad de la fruta durante la maduración. Calidad sensorial. Calidad durante la cocción. Calidad durante el procesamiento agroindustrial. Contenido de almidón resistente. Contenido de carotenoides. Capacidad antioxidante hidrofílica. Contenido de polifenoles totales. Daño mecánico. 7

8 Desórdenes fisiológicos. Enfermedades post-cosecha. Para efectos de la caracterización agroindustrial de musáceas no tradicionales, dentro del Proyecto de Investigación: Alternativas Agroindustriales para Musáceas No Tradicionales, se evaluarán las características post-cosecha durante la cosecha, la vida verde, la calidad de la fruta durante la maduración y algunos aspectos de la calidad durante el procesamiento. 8

9 ii. Análisis fisico-químicos de especies promisorias. 2.1 Características Post-cosecha en la Cosecha. Las características poscosecha esenciales durante la cosecha, para la selección de banano e híbridos de plátano son (Dadzie & Orchard, 1997): Características del racimo y fruto. Calidad post-cosecha de los atributos. La evaluación de las características de los racimos y frutos, tales como peso, longitud, circunferencia y volumen son importantes criterios de selección luego de la cosecha. La selección de nuevos híbridos de musáceas por las características en la cosecha puede ser importante en el diseño de envases para la fruta, lo que aumentaría el manejo eficiente y el transporte. Además es importante la madurez del fruto en la cosecha. Evaluar atributos de calidad post-cosecha como la cáscara, pulpa, color, firmeza, sólidos solubles totales, humedad y el contenido de materia seca; son importantes para determinar la maduración del fruto y también y también puede complementar los estudios de evaluación sensorial (Dadzie & Orchard, 1997) Evaluación de las características post-cosecha en la cosecha. Según Dadzie y Orchard (año), para reducir la variación y obtener datos consistentes, es esencial que todas las mediciones se tomen de los dedos de la segunda mano de los racimos recién cosechados fisiológicamente maduros (con la fruta verde). Sin embargo, si no hay suficientes muestras, las de la tercera mano se pueden incluir. 9

10 Características del racimo y fruto en la cosecha El peso del racimo (Kg). El peso del racimo se determina pesando individualmente el racimo (generalmente con dos decimales). Número de manos. El número de manos se obtiene contando el número de manos de cada racimo. Número de dedos. El número de manos se obtiene contando el número de dedos por mano, de cada racimo. Peso del fruto (g). El peso del fruto se determina pesando el fruto individualmente en una balanza (generalmente con dos decimales). Longitud de los frutos (cm) En general, la longitud del fruto se determina mediante la medición de la curva exterior de las frutas individuales con una cinta, de extremo a extremo. Sin embargo, algunos investigadores determinan la longitud de los dedos de banano mediante la medición de la curva interior del fruto, de la unión del tallo y pulpa a la punta de la fruta. Otros miden en línea recta desde el tallo de la fruta a la punta. Sea cual sea el método, es importante reportarlo (Dadzie & Orchard, 1997). Grosor o circunferencia del fruto (cm) El perímetro o circunferencia del fruto está determinado por la medición individual del fruto con una cinta métrica en el punto medio más amplio de cada fruto. Volumen del fruto (cm 3 ) El volumen del fruto se obtiene por el desplazamiento de volumen directo o mediante el pesaje de los frutos bajo el agua de la siguiente manera: Pesar un contenedor de agua (usualmente dos decimales) con espacio suficiente para sumergir el fruto. Sumergir el fruto cuando el contenedor está aún en la balanza. Para evitar la formación de burbujas de aire en la superficie del fruto, que causa errores en la lectura, colocar una gotas de un agente humectante o detergente en el agua para reducir la tensión 10

11 superficial. Mantener el fruto alejado de los lados o fondo del contenedor, sosteniéndolo bajo el agua con un peso (determinar el peso en la balanza antes de su uso).leer el peso del contenedor más el agua, más el fruto sumergido (con el peso). La diferencia en gramos entre los dos pesos es igual al volumen de la fruta en centímetros cúbicos (cm 3 ). Densidad del fruto. La densidad o gravedad específica del fruto se obtiene simplemente dividiendo el peso del fruto en el aire entre el volumen del fruto. Peso de la pulpa y la cáscara (unidades). El peso de la pulpa y cáscara se determinan después de que los dedos han sido pelados manualmente y separados de la pulpa. Cáscara y pulpa de pesan por separado (por lo general se utilizan dos decimales). Relación pulpa/cáscara. La pulpa y la cáscara se separan, se pesan individualmente y se expresa como relación pulpa/cáscara (es decir, el peso de la pulpa divido entre el peso de la cáscara). Grosor de la cáscara y la pulpa (unidades). Pelar a mano cada fruto luego de haberlo cortado por la mitad transversalmente, luego medir el grosor de la cáscara y el grosor de la pulpa por separado, utilizando un vernier. 2.2 Análisis Vida verde. El banano y el plátano suelen ser cosechados en el estado verde de madurez y se almacenan. Durante el almacenamiento se mantienen firmes y verdes sin cambios significativos en el color, textura o la composición, por un largo período de tiempo (dependiendo de la temperatura, la humedad y la edad en la cosecha), antes del inicio de la maduración. El período bien definido después de la cosecha, durante el cual las frutas permanecen verdes y firmes, se conoce como la vida pre-climaterio o vida verde (Dadzie & Orchard, 1997). La selección de los híbridos que poseen una vida verde duradera, es decir, que permanecen verdes durante mucho tiempo luego de la cosecha, o que maduran lentamente, facilita la comercialización de la fruta y reduce las pérdidas post-cosecha (Dadzie & Orchard, 1997). 11

12 Evaluación de la vida verde. La evaluación de la vida verde consiste en los siguientes métodos y procedimientos (Dadzie & Orchard, 1997): Marcar las plantas en el campo inmediatamente después de la emergencia de la flor (anotar fecha de la floración) y calcular el número de días desde la floración hasta la cosecha, para obtener estimaciones precisas de la edad de los racimos. Cosechar los racimos de diferentes edades, desmanar y empacar en cajas (forradas con film de polietileno perforado) por duplicado y almacenar por separado a dos temperaturas, 14±1 C y 27±1 C. La humedad relativa debe estar bien controlada (por ejemplo, 90-95%), para prevenir la pérdida severa de agua o deshidratación de los frutos, que podría desencadenar la producción de etileno, y por tanto, la maduración prematura. Antes de almacenar, tomar muestras representativas de las frutas y evaluar el color y firmeza de la cáscara y la pulpa y además los sólidos solubles totales. La vida verde puede ser evaluada de la siguiente manera: a) Inspeccionar visualmente el color de la cáscara de las frutas a cada temperatura de almacenamiento al menos dos veces todos los días. b) Tomar muestras representativas de la fruta almacenada para cada temperatura (a intervalos regulares) y medir las tasas de respiración, producción de etileno, firmeza de la pulpa y sólidos solubles totales. c) Cualquier fruta a la que se le detecte un comienzo de la maduración debe ser removida del almacenamiento (ya que el etileno producido por una fruta daría lugar a la maduración en el resto de los frutos). d) Una vez que comienza la maduración de los extremos del fruto, la vida verde se calcula como el período (en días) entre la cosecha y el comienzo de la maduración. La vida verde de los bananos y plátanos generalmente está relacionada con la edad del racimo. 12

13 2.3 Evaluación de la Calidad de la Fruta Durante la Maduración. Durante la maduración de plátanos y bananos se dan muchos cambios físicos y químicos post-cosecha, que son los que determinan la calidad de la fruta que compra el consumidor. Al conocer la etapa de maduración de las musáceas, es posible programar las operaciones de recolección, manipulación y comercialización de manera eficiente (Dadzie & Orchard, 1997). La maduración de las frutas es el resultado de una gran cantidad de cambios que probablemente ocurren unos independientemente de otros. La siguiente es una lista de algunos de los principales cambios que ocurren durante la maduración de plátanos y bananos (Dadzie & Orchard, 1997): Cambios en la masa de los racimos. Cambios de color en la cáscara y la pulpa. Conversión de almidones en azúcares. Cambios en el contenido total de sólidos solubles. Cambios en el ph y la acidez titulable de la pulpa. Cambios en el porcentaje de humedad en las cáscaras y la pulpa. Para la evaluación de los cambios que ocurren durante la maduración de plátanos y bananos, se tomaron racimos fisiológicamente maduros de la planta (un racimo de cada variedad a evaluar), se desmanaron, y se empacaron en cajas de cartón corrugado (de las usadas para su comercialización en fresco) bien identificadas, un racimo desmanado por caja; todo esto en la plantación. Luego se trasladaron los racimos desde la plantación hasta las instalaciones del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA). Una vez en el CITA, se sacaron las manos de cada caja y se sumergieron en la solución de etileno ETHREL 48 SL (1mL por cada litro de agua) durante cinco minutos. A las cajas de cartón corrugado se les hizo una cama de papel periódico sobre la que se colocan las manos que fueron sumergidas en THREL 48 SL, se cubren con papel periódico y las tapas de la caja. Posteriormente se estiban y se mantienen en un lugar acondicionado para la maduración a temperatura ambiente y con una humedad relativa del 90 al 95%. A partir del momento en que se ponen a madurar, se comienzan a hacer las pruebas que serán descritas a continuación, tomando como día cero el día en que se sumergieron las manos de los racimos en la solución de etileno y así sucesivamente. 13

14 Evaluación de los cambios en la masa de los racimos. Para medir los cambios que se presentan en la masa de los racimos de las diferentes variedades evaluadas dentro de las cajas durante el proceso de maduración, se midió la misma en una balanza granataria. Se tomó cada caja, que representaba un racimo, y se pesó. Esto se realizó cada día, a partir del día cero y hasta el día ocho, nueve o diez, según el caso, que es cuando los ºBrix comienzan a descender (señal inequívoca de la senescencia de la fruta). Más adelante se describirá el método de evaluación de sólidos solubles (ºBrix). Una vez que se midió la masa de los racimos se procedió a tomar una muestra (un dedo) al azar, y se midió la masa de esta muestra para ser tomada en cuenta a la hora de calcular el cambio en la masa de los racimos. De igual manera se pesan las cajas utilizadas para este mismo cálculo. a. Color de la pulpa y de la cáscara. La desaparición o pérdida del color verde y la aparición del color amarillo durante la maduración es un fenómeno característico de los plátanos y bananos. La pérdida de la coloración verde se debe a la degradación de la estructura de la clorofila. Los cambios externos que se dan durante la maduración usualmente reflejan cambios en el color de la pulpa (Dadzie & Orchard, 1997). Para evaluar los cambios en la coloración de la cáscara se tomaron fotografías, todos los días, de la muestra tomada para cada variedad evaluada. De esta manera se elaboró una tabla de comparación de color, en donde se notan los cambios de color empezando por el día cero y terminando en el día ocho, nueve o diez, según sea el caso. A la hora de tomar las fotografías se utilizó un fondo blanco con una escala en centímetros para notar la diferencia de tamaño entre muestras. La evaluación de los cambios de color se hizo practicando un corte transversal de las muestras de cada variedad en estudio, para luego tomar fotografías de estos cortes de la misma manera descrita para la evaluación de los cambios de color en las cáscaras (no se utilizó escala métrica). El color de los bananos y plátanos probablemente contribuye a la evaluación de la calidad por parte del consumidor más que cualquier otro factor. Por lo tanto la cáscara y pulpa son importantes criterios de selección después de la cosecha. El color del fruto puede ser un indicador del estado de deterioro, infesta de una enfermedad y / o contaminación. La aceptabilidad de los bananos y plátanos en el mercado es significativamente influenciada por el color de la 14

15 fruta. El color de la cáscara, usualmente, es el principal criterio post-cosecha utilizado por los investigadores, productores y consumidores para determinar si el fruto es maduro o inmaduro. El banano o el plátano, deben ser verdes o amarillos, cualquier color diferente puede ser difícil de vender (por ejemplo: plátano rojo). Por lo tanto, el color es fundamental, ya que la primera evaluación de la calidad de los plátanos o bananos es visual. Los consumidores asocian el color de la cáscara con los gustos, usos o propósitos específicos (Dadzie & Orchard, 1997). Según Dadzie y Orchard (1997), comunicar la percepción del color requiere una evaluación, descripción y un medio para transmitir los resultados de una manera sistemática. Escalas de color o instrumentos de medición de color son herramientas utilizadas para este propósito. Calibración del colorímetro Calibrar el colorímetro como se indica en el manual del usuario antes de cada sesión de medición. Se deben seguir las directrices para la medición del color que sean propias del instrumento que se utiliza. Medición del color de la cáscara y la pulpa utilizando el colorímetro El color de la cáscara y la pulpa de los bananos y plátanos se puede medir utilizando un colorímetro (CR-100 o CR-200) con una cabeza de 8 mm. Para medir el color de la piel, se coloca la cabeza de medición en la superficie del fruto (superficie de la cáscara) y tomar aproximadamente 2-3 lecturas y determinar la media. Para medir el color de la pulpa, se debe cortar la fruta transversalmente en el punto medio y colocar la cabeza de medición en el centro o lóculo y tomar una única lectura. Las mediciones de color se registran utilizando la escala Hunter L*, a* y b*. La coordenada L es una medida de luminosidad (blanco-negro y los rangos se encuentran desde L=0 (no reflexión), hasta L=100 (reflexión difusa perfecta). La escala de a va desde los valores negativos para el verde hasta los valores positivos para el rojo y la escala b incluye los valores negativos para el azul y los positivos para el amarillo. Los valores de L*, a* y b* deben convertirse en matiz, valor y croma. En algunos colorímetros los valores se convierten automáticamente. 15

16 b. Firmeza de la pulpa. La textura o firmeza de la pulpa de los bananos y plátanos es un atributo importante en la evaluación de las características post-cosecha, en la cosecha. También puede ser utilizado como un índice de madurez y puede facilitar la comparación de la tasa de ablandamiento de los nuevos híbridos con la de sus padres. La evaluación de la firmeza es importante en la evaluación de la susceptibilidad de la fruta al daño físico o mecánico o al manejo post-cosecha. La textura de los bananos y plátanos es un atributo compuesto como resultado de una combinación de varios factores como la turgencia de agua y componentes estructurales de las células y los tejidos. Cualquier evaluación individual por sí sola puede proporcionar una información limitada de estas propiedades de textura. La mayoría de los aparatos de medición rutinarios, determinan aspectos como compresibilidad, deformación o ruptura de la muestra a analizar. Un indicador de la firmeza es la fuerza necesaria para provocar la penetración de una sonda estándar a una distancia específica dentro del producto. Algunas de las herramientas habitualmente utilizadas para medir la firmeza de la pulpa son el penetrómetro de mano o un penetrómetro montado sobre un soporte, o bien el penetrómetro en combinación con un taladro Tipos de penetrómetro Los tipos de penetrómetro disponibles incluyen: Penetrómetro Effegi.Probador de la presión Magness-Taylor. Calibración del penetrómetro El penetrómetro se debe comprobar cada día antes de su uso. El émbolo debe ser introducido alrededor de diez veces para asegurarse que está funcionando con regularidad, de lo contrario los valores iniciales pueden ser mayores que las lecturas subsiguientes. El penetrómetro se usa esencialmente para la medición de la resistencia de la fruta a una constante de fuerza. Por lo tanto, para obtener lecturas precisas de la firmeza de la fruta, es esencial que el método empleado en la operación de un penetrómetro sea estandarizado de la siguiente manera: Al utilizar un penetrómetro de mano, sostener la muestra firmemente con una mano contra una superficie firme. 16

17 Al utilizar un penetrómetro montado sobre un soporte o el penetrómetro en combinación con un taladro (para propiciar una fuerza de aplicación constante) para medir la fuerza de ruptura de las secciones transversales de los tejidos de la pulpa, se debe colocar la muestra en una lámina de acrílico o una plataforma similar con un agujero ligeramente más grande que el diámetro de la sonda. Esto para reducir el riesgo de dañar la sonda o medidor de fuerza. La profundidad a la que el émbolo se inserta en el fruto debe ser constante. Los émbolos tienen un círculo inscrito en el eje de aproximadamente 7,9 mm desde la punta. El émbolo debe insertarse en la fruta hasta no más de esta línea inscrita, para prevenir que el jugo se derrame en el instrumento y el operador. La velocidad a la que se inserta el penetrómetro en la pulpa debe ser constante. Debe tomar alrededor de dos segundos insertar el émbolo en la pulpa hasta la línea inscrita en el émbolo. Inclusive siguiendo estas instrucciones, puede haber diferencias en las lecturas obtenidas por diferentes operadores. Lo ideal es que la misma persona, entrenada, realice las operaciones para obtener resultados comparables y consistentes. Instrucciones para la medición de la firmeza de la pulpa La firmeza de la pulpa de banano y plátano se determina en secciones transversales del fruto, de la siguiente manera: Se debe realizar un corte transversal en el punto medio, de 1 cm de tejido de la fruta (es decir, que contiene tanto la cáscara como la pulpa). Colocar la muestra en una plataforma de polimetilmetacrilato o similar. Medir la fuerza requerida para penetrar en el tejido de la pulpa a 1 cm, con una sonda cilíndrica con un diámetro de 6mm, montado sobre un dinamómetro electrónico Salter de 0-10 Kg. El valor registrado es la fuerza máxima necesaria para que la pulpa ceda ante la sonda. La firmeza de la pulpa suele ser reportada en kilogramos fuerza (kgf) o Newton (N) (1 kgf = 9,80665 N). 17

18 La temperatura de las muestras puede afectar las mediciones por lo que es recomendable estandarizarlas. El diámetro de la sonda del penetrómetro debe ser reportado. c. Sólidos solubles totales. Los frutos, incluyendo banano y plátano, contienen muchos compuestos solubles en agua como azúcares, ácidos, vitamina C, aminoácidos y algunas pectinas. Estos compuestos solubles forman los sólidos solubles contenidos en la fruta. En la mayoría de los frutos maduros, el azúcar es el principal componente de estos sólidos solubles (Dadzie & Orchard, 1997). Los sólidos solubles totales (SST) son una característica post-cosecha importante, puesto que la cantidad de SST o azúcar en los frutos aumenta a medida que estos maduran, por lo que el contenido de sólidos solubles del fruto puede ser un índice útil de la madurez o de la etapa de madurez (Dadzie & Orchard, 1997). El refractómetro es el instrumento utilizado para medir el contenido total de sólidos solubles de los frutos. Tipos de refractómetros Los tipos más comunes de refractómetros utilizados para evaluar el contenido de sólidos solubles totales de frutos como bananos y plátanos son los refractómetros de mano. Estos suelen tener un rango de grados brix ( Brix) de 0 20 % ó 0-32% con graduaciones de 0,2% ó 0,5% Hay varios tipos de refractómetros en el mercado, incluyendo: ATAGO 0-20% ó 0-32%. Bellingham & Stanley 0-28%. Erma 0-20%. Elección de un refractómetro Al elegir un refractómetro es importante que: La escala sea de fácil lectura. Que exista un buen contraste entre las partes claras y oscuras del campo de visión y que las líneas de demarcación estén fijas y definidas. 18

19 El instrumento puede ser fácil y correctamente calibrado y desajustarse fácilmente. El instrumento es robusto. Calibración del refractómetro La lectura de los grados brix ( Brix) o el % total de sólidos solubles se altera ligeramente con la temperatura. El instrumento está calibrado para ser utilizado a 20 C, por lo tanto idealmente el instrumento y el jugo del fruto deben estar a esta temperatura. Algunos modelos tienen controles de temperatura automáticos. Instrucciones para calibrar el refractómetro Colocar unas gotas de agua destilada en la superficie del prisma. Cerrar la cubierta del prisma, asegurarse de que no haya burbujas atrapadas en la película de agua y apuntar el refractómetro a una fuente de luz. Un campo circular se observa a través del lente con una escala vertical a un lado, con divisiones de 0,2 ó 0,5% sólidos solubles. Con líquido en el prisma, el campo se divide en zonas claras y zonas oscuras. El punto en que la línea de demarcación entre las partes cruza la escala vertical da la lectura de Brix o una estimación de SST%. Con agua destilada, la lectura debe ser 0%. La línea puede ser ajustada en la escala vertical por medio de perillas ubicadas por encima o por debajo de la caja del prisma. Después de calibrar el refractómetro con agua destilada, es importante verificar su exactitud a altos valores de Brix utilizando soluciones de sacarosa recién hechas y con concentraciones de sacarosa conocidas, por ejemplo 12% m/v de sacarosa (12 g de sacarosa en 88 ml de agua destilada). Si la línea de demarcación en la escala del refractómetro es distinta, puede deberse a: Grandes burbujas de aire atrapadas en la película de jugo. Una cantidad muy grande de jugo puede ser necesaria para asegurar que el prisma este cubierto completamente. Humedad en el sistema óptico del refractómetro. El refractómetro deber ser secado a C. Se debe procurar limpiar siempre y cuidadosamente la superficie del 19

20 prisma del refractómetro con papel suave o pañuelo entre cada lectura. Después del uso lavar el prisma con agua destilada y secar bien con un papel suave y guardarlo en un lugar seguro. Medición de sólidos solubles totales Puede medirse la gravedad específica del jugo utilizando un hidrómetro o puede medirse el índice de refracción utilizando un refractómetro, que es la herramienta más común. Medición del índice de refracción del jugo de la pulpa utilizando un refractómetro El índice de refracción de los bananos o plátanos se mide de la siguiente manera: Mezclar en un homogenizador de alta velocidad (licuadora), 30 g de pulpa de la sección transversal del fruto, en 90 ml de agua destilada durante 2 minutos y filtrar. Colocar una gota del líquido filtrado en el prisma de un refractómetro con un rango de grados brix de 0-20% a 20 C. Apuntar el refractómetro hacia una fuente de luz y leer el porcentaje total de sólidos solubles. El resultado se debe multiplicar por 3, debido a que inicialmente la pulpa se diluyó tres veces con agua destilada. El % SST contenido en el jugo de la fruta varía dentro de la fruta en función del grado de madurez, por ejemplo en los bananos y plátanos, el centro por lo general tiene mayor contenido de azúcar, por lo tanto, para obtener con precisión el %SST, es necesario tomar muestras significativas que contengan el centro y demás tejidos de la pulpa. Limitaciones La temperatura puede afectar las mediciones del total de sólidos solubles y debe ser estandarizada. Se asume que el componente predominante en la solución del jugo de frutas evaluado es sacarosa o azúcar. Sin embargo, otros componentes como ácidos, vitamina C, aminoácidos y algunas pectinas pueden estar presentes (Dadzie & Orchard, 1997). 20

21 d. ph y acidez total titulable. Los valores de ph dan una medida de alcalinidad o acidez del producto, mientras que la acidez brinda una medida de la cantidad de ácido presente. Además se puede considerar como un indicador de la madurez de la fruta. Los ácidos hacen una importante contribución a la calidad post-cosecha de la fruta por el balance entre los azúcares y el contenido ácido; por lo tanto, la evaluación de la acidez, posterior a la cosecha, es importante en la evaluación del sabor de la fruta. En la mayoría de plátanos y bananos hay un rápido descenso en el ph de la pulpa conforme la fruta va madurando. Por lo tanto, la medición del ph de la pulpa es utilizada como índice de madurez (Dadzie & Orchard, 1997). El valor del ph del filtrado obtenido de la pulpa se determina utilizando un ph-metro. Calibración del ph El ph jugo de la pulpa se puede medir con un medidor digital o uno de mesa. Se recomienda seguir las instrucciones del fabricante y utilizar las soluciones de ph 4 y 7 para calibrar. Medición del ph del jugo de la pulpa El ph de la pulpa de los bananos y plátanos se mide de la siguiente manera: Pesar 30 g de plátanos o bananos y colocarlos en un homogeneizador de alta velocidad (licuadora) y añadir 90 ml de agua destilada y mezclar durante 2 minutos, luego filtrar (por ejemplo, a través de un filtro de papel). Lavar el electrodo de ph con agua destilada y luego colocarlo en el filtrado. Esperar a que la lectura se estabilice. Anotar el valor del ph del filtrado. Lavar el electrodo con agua destilada y almacenar según lo recomendado por el fabricante. Si no se cuenta con un medidor de ph, se puede utilizar el papel indicador universal. Sumergir el papel en el filtrado y comparar el cambio de color con la tabla indicada en el empaque del papel indicador. Identificar el color correspondiente y anotar el ph. 21

22 Acidez titulable El método consiste en la valoración de los ácidos presentes en un extracto acuoso de la muestra, con NaOH 0,1mol/L. La acidez puede ser expresada convencionalmente en g de ácido por 100g o 100mL del alimento. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes, se encuentran en el documento anexo AQCITA-M011-ACIDEZ.pdf. En la determinación de la acidez total titulable del plátano y banano, el ácido presente predominante es el ácido málico, por lo que se supone que el ácido málico es el único ácido presente (Dadzie & Orchard, 1997). e. Humedad y contenido de materia seca (%) de la cáscara y la pulpa. La humedad y el contenido de materia seca (%) de la cáscara y la pulpa son criterios de calidad importantes después de la cosecha, para la selección de nuevos híbridos de banano y plátano, ya que proporcionan una medida del contenido de agua. Además proveen de información para determinar si un mayor rendimiento se debe a mayor contenido de agua o si es producto de un aumento real de peso cosechado (Dadzie & Orchard, 1997). La evaluación del contenido de materia seca es esencial, ya que la tasa de respiración acompañada de la pérdida de agua que se produce en el plátano y banano durante la maduración, sobre todo en la etapa del climaterio provoca una reducción neta en la proporción de materia seca de la fruta. Además puede proporcionar información útil sobre las diferencias en el contenido de humedad entre los híbridos de plátano y sus padres (Dadzie & Orchard, 1997). El método consiste en la medición de la pérdida de masa debida a la evaporación de agua en una estufa de vacío. El vacío permite trabajar a temperaturas menores a 100ºC para de esta manera evitar algún tipo de descomposición en determinados tipos de muestra (como por ejemplo las muestras ricas e azúcares como plátanos y bananos). Con este método, la pérdida de masa puede no ser una causa medida verdadera del agua en la muestra, ya que puede incluir la pérdida de compuestos volátiles, o porque el agua combinada y absorbida son difíciles de eliminar. Lo importante es mantener las mismas condiciones de secado siempre. 22

23 La pérdida de masa se ve influenciada por el tamaño de la partícula, la cantidad de muestra, el tipo de cápsula y la distribución de la muestra en cápsula. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes, se encuentra en el documento anexo AQCITA-M002-HUMEDAD.pdf. f. Determinación del contenido de carotenoides totales. Los carotenoides totales serán determinados siguiendo el método AQCITA-M035 del Laboratorio de Química del CITA, el cual toma como referencia los ensayos realizados por Britton et al. (1995) y Rodríguez-Amaya (1999). Este método se basa en la extracción de los carotenoides de una muestra previamente homogenizada, en donde se realiza la saponificación a temperatura ambiente por 24 h con una mezcla de éter etílico y KOH alcohólico al 5%, para eliminar la interferencia de la clorofila y de la grasa, y en oscuridad para evitar la degradación de los carotenoides. Luego, se realiza una filtración y se continúa el procedimiento con el filtrado obtenido. La extracción se realiza con varios solventes: acetona, éter, hexano 1:1 y finalmente, n-hexano; esto con el fin de extraer la máxima cantidad de carotenoides. Finalmente, se determina la absorbancia del extracto a 450nm por medio de espectrometría UV-visible, de tal forma que se cumpla la ley de Beer. El contenido de carotenoides se expresa en micro gramos de beta caroteno / g de muestra. Esta determinación se realiza por triplicado, con el fin de evaluar el valor nutricional y funcional del mismo. g. Determinación de la capacidad antioxidante hidrofílica (ORAC hidrofílico). La determinación de la capacidad antioxidante se llevará a cabo siguiendo el método ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), el cual toma como referencia la metodología aplicada por Ou et al. (2001) y Huang et al. (2002). Mediante un análisis espectrofluorométrico se sigue la cinética de la reacción de la fluoresceína, ésta última disminuye la lectura en la absorbancia al ser atacada por un radical libre. La muestra con compuestos antioxidantes contrarresta el ataque del radical libre y protege la fluoresceína. Para el estudio se emplea una solución de Trolox (análogo soluble en agua de la vitamina E) como solución patrón de antioxidante y una solución AAPH (2,2-azobis (2 amino propano) diclorhidrato), la cual posee un enlace doble de 23

24 nitrógeno y actúa como fuente de radicales libres. La capacidad antioxidante se expresa en micro moles de equivalentes de Trolox por g de muestra. La capacidad antioxidante se determina por triplicado, con el fin de evaluar el valor nutricional y funcional de la musácea.h. Determinación del contenido de polifenoles totales. La determinación del contenido de polifenoles totales se realizará utilizando el método establecido por el Laboratorio de Química del CITA AQCITA-M036, el cual está basado en el método de Slinkard y Singleton (1977) modificado por Georgé et al. (2005). En este método, la determinación de polifenoles se realiza por espectroscopía UV-visible, siguiendo la reacción de óxido/reducción de los polifenoles con el reactivo Folin-Ciocalteu. La primera etapa consiste en la preparación de un extracto cetónico al tratar la muestra homogenizada con acetona:agua 70:30; una alícuota de este extracto se trata con el reactivo Folin-Ciocalteu y se determina la absorbancia (A 1 ) a 760nm. Del mismo extracto cetónico se toma una alícuota que se diluye en agua, la que luego es pasada por cromatografía de columna (cartucho Oasis), se trata con el reactivo Folin-Ciocalteu y se determina la absorbancia (A 2 ). La diferencia entre A 1 y A 2 corresponde a los polifenoles, ya que A 1 contempla la absorbancia dada tanto por los polifenoles como por las interferencias de vitamina C y azúcares. Los polifenoles quedan retenidos en la columna de cartucho Oasis. Las absorbancias obtenidas deben ser tales que cumplan la Ley de Beer. El contenido de polifenoles se reporta como mg de ácido gálico/ g muestra, compuesto con el cual se prepara la curva patrón. Los polifenoles totales se determinan por triplicado. i. Almidón resistente y almidón disponible El almidón resistente (AR) y almidón disponible (AD) se determinan con el método enzimático desarrollado por Megazyme (Anónimo, 2004), que consiste en la determinación de la glucosa liberada al hidrolizar el almidón disponible en la primera parte del análisis y luego la glucosa liberada al solubilizar el almidón cristalino (resistente). Con los valores por medio de este método se calcula el almidón total (suma del almidón resistente y disponible). Conociendo la concentración de glucosa en la solución final el cálculo del almidón resistente, disponible y total se llevó a cabo con las siguientes fórmulas. 24

25 % AR=Conc. X F x 1/1000 x 100/w x 162/180 % AD= Conc. x F x 1/1000 x 100/w x 162/180 % AT= % AR + % AD Donde Conc: en ug en 0,1 ml F: factor de dilución en el caso de llevar a 100 ml es 100/0,1, si se toma directo es 10,3/0,1 W: es peso en mg seco e el peso* (100-% humedad)/100 Método de determinación de almidón resistente, disponible y total. Megazyme. Preparación de las muestras Plátano fresco: Del plátano troceado se tomó una muestra de aproximadamente 500 g empacados al vacío para liofilizar y otra de 100 g igualmente al vacío para determinar la humedad del plátano fresco. Preparación de reactivos - Hidróxido de sodio 4 M Disolver 160 g de hidróxido de sodio en un litro de agua destilada, trasvasar cuantitativamente a un balón aforado de 1 L y aforar. - Buffer de maleato de sodio 0,1 M ph 6,0 Disolver 23,2 g de ácido maleico en 1600 ml de agua grado I. Ajustar el ph a 6,0 con NaOH 4 M. Posteriormente adicionar 0,6 g de cloruro de calcio y 0,4 g de azida de sodio y ajustar a 2 L con agua grado I. - Hidróxido de potasio Disolver 112,2 g de KOH en 900 ml de agua desionizada y ajustar a 1 L con agua desinizada en un balón aforado de 1 L. - Buffer de acetato de sodio 1,2 M ph 3,8 Adicionar 69,9 ml de ácido acético glacial a 800 ml de agua destilada, ajustar el ph a 3,8 con NaOH 4 M y llevar a 1 L en un frasco volumétrico. - Buffer de acetato de sodio 0,1 M ph 4,5 25

26 Mezclar 5,8 ml de ácido acético glacial con 900 ml de agua destilada, ajustar el ph a 4,5 con NaOH 4 M, trasvasar a un balón de 1 L y aforar con agua destilada. - Disolución de Etanol 50% Disolver 500 ml de etanol del 95 % de pureza con agua destilada, trasvasar cuantitativamente a un balón de 1 L y aforar con agua destilada. - Amiloglucosidasa diluida 300 U/mL Disolver 2 ml de amiloglucosidasa (AMG) concentrada en 22 ml de buffer de maleato de sodio 0,1 M (ph 6,0), dividir esta disolución en porciones de 5 ml, colocar en recipientes de polipropileno y congelar. - Disolución de amilasa pancreática con AMG Esta disolución debe prepararse inmediatamente antes de usar. Suspender 1,0 g de amilasa pancreática en 100 ml de buffer de maleato de sodio 0,1 M ph 6,0, se agita por 30 min sobre una plantilla de agitación a toda velocidad. Una vez cumplido el tiempo adicionar 2 ml de AMG diluida y mezclar bien. Trasvasar esta disolución a 2 botellas de centrifuga con igual cantidad de líquido. Centrifugar por 10 min a 2000 rpm y decantar inmediatamente. - Glucose-oxidase-peroxidase-aminoantipyrinereagent (GOPOD) Diluir cuantitativamente con agua bidestilada a 1 L el contenido del vial de buffer concentrado y con este disolver el contenido del vial de reactivo liofilizado, y llevar nuevamente a un balón aforado de 1 L. Separar el reactivo en frascos de nalgene de aproximadamente 250 ml y mantener en refrigeración (4 ºC). Hidrólisis y solubilización de almidón disponible Pesar una muestra de 100 ± 5 mg en un tubo de ensayo con una tapa. Adicionar 4,00 ml de la disolución de amilasa pancreática con AMG. Sellar cada tubo con teflón, luego se tapan y posteriormente colocar cinta sobre la tapa. Mezclar en vortex a velocidad entre 5-6 por 15 s. Colocar en un baño con agitación horizontal de 200 strokes a 37 ºC y se dejaron por 16 h. Una vez cumplidas las 16 h, se remueven los tubos del baño, secar y destapar, adicionar 4,00 ml de alcohol, agitar vigorosamente en vortex por 15 s a velocidad 6. 26

27 Centrifugar los tubos sin tapa por 20 min a 2000 rpm. Decantar inmediatamente y cuidadosamente (separando los líquidos supernatantes), resuspender el precipitado con 2,00 ml de alcohol de 50%, mezclar en vortex por 15 s a velocidad 6 inmediatamente antes de meterlos a la centrifuga y centrifugar por 20 min a 2000 rpm. Decantar inmediatamente y cuidadosamente (separando los líquidos supernatantes) y repetir los dos últimos pasos una vez más. Hidrólisis del almidón resistente Adicionar al tubo con el sólido una barra magnética (8 mm x 15 mm) y 2,00 ml de KOH 2 M, agitar por 20 min en plantilla de agitación a velocidad máxima en un baño de hielo. Adicionar 8,00 ml del buffer de acetato de sodio 1,2 M (ph 3,8) e inmediatamente 0,1 ml de AMG 3300 U/mL, mezclar en vortex por 15 s a veloc 5-6 y colocar en un baño a 50 ºC por 30 min. Procurar mezclar con vortex por 15 s a veloc 5-6 intermitentemente. Determinación del almidón resistente Transferir cuantitativamente el contenido del tubo a un balón de 100,00 ml, aforar con agua bidestilada y centrifugar una alícuota de 45 ml a 3000 rpm por 10 min. Transferir una alícuota de 0,1 ml del líquido superrnatante a un tubo con 3,00 ml del reactivo GODOP, agitar en vortex por 15 s a veloc 5-6 e incubar a 50 ºC por 20 min. Medir la absorbancia de cada disolución a 510 nm contra un blanco. Reactivo blanco y estándares de glucosa Blanco: mezclar 0,1 ml del buffer de acetato 0,1 M ph 4,5 con 3,00 ml del reactivo GODOP, agitar en vortex por 15 s a veloc 5-6 y se incubó a 50 ºC por 20 min. Estándares de glucosa: disolver y trasvasar cuantitativamente 0,1 g de estándar de glucosa en un balón aforado de 100,00 ml y aforar con agua bidestilada (disolución madre de glucosa). De la disolución madre tomar alícuotas de 2,00; 4,00; 6,00 y 8,00 ml y se llevaron a 10,00 ml en balones aforados con agua bidestilada. Tratarlos con 3,00 ml del reactivo GODOP, agitar en vortex por 15 s a veloc 5-6 y se incuban a 50 ºC por 20 min. 27

28 Medición de almidón disponible (no resistente) Combinar los líquidos supernatantes obtenidos de los lavados con etanol de 95 % y de 50 % para cada muestra. Trasvasar cuantitativamente los lavados a un balón de 100,00 ml y aforar con buffer de acetato de sodio 0,1 M ph 4,5. Incubar una alícuota de 0,1 ml con 10 µl de solución de amiloglucisidasa diluida (300 U/mL) por 20 min a 50 ºC. Agregar 3,00 Ml del reactivo GODOP e incubar por 20 min a 50 ºC. Medir la absorbancia a 510 nm. Evaluación de los cambio en el contenido total de sólidos solubles. Las frutas como los plátanos y bananos pueden tener varios componentes que son solubles en agua, tales como azúcares, ácidos, vitamina C, aminoácidos y algunas pectinas. Estos compuestos solubles forman parte del contenido de sólidos solubles en la fruta. En la mayoría de las frutas, incluyendo plátanos y bananos, los azúcares son el componente principal de los sólidos solubles. Los cambios en la cantidad de sólidos solubles puede variar entre distintos cultivares y entre distintas etapas de madurez (Dadzie & Orchard, 1997). El contenido total de sólidos solubles es muy importante en la evaluación de variedades promisorias de plátano y banano ya que usualmente aumenta conforme la fruta va madurando. Esto debido a la hidrólisis de los almidones en azúcares como sacarosa, glucosa y fructosa, que son los responsables de endulzar la fruta. Generalmente, el contenido de sólidos solubles va aumentando hasta llegar a un pico y luego comienza a disminuir. Esta disminución se debe a la conversión de los azúcares de la pulpa en alcohol (Dadzie & Orchard, 1997). El refractómetro es el instrumento utilizado para la medición del contenido total de sólidos solubles en las frutas. Usualmente se usan refractómetros portátiles con rangos de grados Brix (ºBrix) de 0 a 32%. Se midió haciendo un corte transversal de la muestra de plátano o banano, luego se hizo un raspado de la pulpa (del corte hecho anteriormente). La pulpa obtenida por raspado se colocó en el prisma del refractómetro, se puso el cobertor y se dirigió hacia una fuente de luz para leer 28

29 el porcentaje total de sólidos solubles. También se pueden encontrar otros métodos descritos en la literatura para determinar el contenido total de sólidos solubles, como el descrito anteriormente en el punto por Dadzie & Orchard. Evaluación de los cambios en el ph. El ph se mide con un ph-metro digital, portátil o fijo. Primero se debe calibrar con las especificaciones del fabricante, generalmente se usan soluciones de ph 4 y ph 7. El procedimiento seguido fue procesar en una licuadora 10 gramos de pulpa del plátano o banano en 90mL de agua destilada, hasta obtener una mezcla lo más homogénea posible en un tiempo de procesamiento no mayor a dos minutos. Luego se lavó con agua destilada el electrodo y se sumergió en la solución de almacenaje recomendada por el fabricante. Otro método se describió en el punto , así como el uso del papel indicador universal. Acidez total titulable (Método AQCITA-M011). La determinación de la acidez titulable de la pulpa de plátanos y bananos aumenta conforme progresa la maduración (Dadzie & Orchard, 1997). El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M011-ACIDEZ.pdf. Azúcares por HPLC (Método AQCITA-M006). El método consiste en la extracción de los azúcares de la muestra y la inyección del extracto en la columna apropiada para obtener la separación de los azúcares presentes. La cuantificación e identificación de los azúcares se realiza inyectando patrones de concentración conocida de los mismos, los cuales se utilizan para calibrar el equipo en cuanto a concentraciones así como para la identificación por los tiempos de retención. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M006-AZÚCARES.pdf. 29

30 Almidones por método enzimático (Método AQCITA-M018). El contenido de almidón se determina mediante su hidrólisis a unidades de glucosa utilizando la enzima α-amiloglucosidasa (E.C ) y posteriormente se determina la concentración de glucosa por medio de una reacción con la enzima glucosa oxidasa. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M018-ALMIDON.pdf. Cenizas (Método AQCITA-M004). Consiste en la medición de la masa del residuo inorgánico que queda después de incinerar la muestra a temperaturas que oscilan entre 500 y 600ºC. Este residuo, que es lo que se llama cenizas, consiste en óxidos y sales y contiene aniones tales como fosfatos, cloruros, sulfatos y otros haluros, y cationes como sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro y manganeso. Las sales orgánicas se descomponen durante la incineración, perdiéndose la parte carbonada. El metal de estas sales forma óxidos o reacciona con otros metales de la matriz. Algunos metales como cadmio y plomo, se volatilizan durante la calcinación. El ámbito de concentraciones en el que deben ser aplicadas es el usual para cada tipo de muestra, y se contemplan diferencias en el peso de muestra y en tratamientos específicos definidos en la bibliografía. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M004-CENIZAS.pdf. Fibra dietética total por método enzimático (Método AQCITA-M007). El objetivo del análisis es la determinación de la fibra dietética total en banano y plátano, por su alto contenido de almidones. La fibra dietética total (FDT) está constituida por todos los polisacáridos y lignina que no pueden ser hidrolizados en el proceso de digestión del ser humano. El método recomendado para la determinación de la FDT se basa en una hidrólisis enzimática de almidón y proteína (hidrólisis parcial), la cual se realiza en tres etapas, utilizando Termoamyl (α-amilasa estable al calor), proteasa y amiloglucosidasa. La fibra dietética soluble se precipita con etanol, obteniéndose por medio de filtración y repetidos lavados del precipitado de la FDT. A este residuo se le analiza proteína y ceniza para 30

31 realizar las respectivas correcciones. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M007-FIBRA DIETÉTICA.pdf. Grasa cruda por extracto etéreo (Método AQCITA-M0005). El método consiste en la extracción del material seco con un solvente tal como el éter de petróleo o el éter etílico en un aparato de extracción, intermitente o continuo, como son los extractores Soxhlet y Goldfish respectivamente. Con este método sólo se puede determinar el contenido en lípidos libres ya que los componentes lipídicos combinados solo se extraen con solventes más polares (alcohol) o luego de una hidrólisis que los convierta en libres. El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M005-GRASA CRUDA.pdf. Humedad (sólidos totales) (Método AQCITA-M002). El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M002-HUMEDAD.pdf. Proteína o nitrógeno total por método Kjeldahl utilizando equipo Foss Tecator (Método AQCITA-M003). El método de Kjeldahl para determinación de nitrógeno se adapta a un amplio rango de alimentos. Lo que varía, entre los diferentes tipos de materiales, es la masa de la muestra. La obtención del contenido de proteína a partir de Nitrógeno es un procedimiento ampliamente usado en el análisis rutinario de alimentos. Generalmente, para muestras que no contienen grandes cantidades de compuestos nitrogenados no proteicos (amonio, aminoácidos libres, urea, entre otros) es aceptable asumir que todo el nitrógeno es de origen proteico. El método de Kjeldahl se caracteriza por el uso de ácido sulfúrico concentrado hirviendo para la destrucción oxidativa de las sustancias orgánicas de la muestra, con la consecuente reducción de nitrógeno orgánico a amonio. El amonio se destila con previa adición de un álcali no volátil y es retenido en ácido bórico. 31

32 Para facilitar la digestión se emplea sulfato de cobre (III) como catalizador y sulfato de potasio para aumentar el punto de ebullición de la mezcla. El porcentaje de nitrógeno obtenido puede convertirse a proteína cruda multiplicando por un factor que dependerá del tipo de alimento del que se trate (6,25 en el caso de frutas frescas como plátano y banano). El procedimiento completo, cálculos y otros datos importantes se encuentran en el documento anexo AQCITA-M003-PROTEINA.pdf. Carbohidratos totales (por diferencia). La cantidad de carbohidratos totales se obtiene por diferencia realizando el siguiente cálculo: Carbohidratos disponibles (por diferencia). La cantidad de carbohidratos disponibles se obtiene por diferencia realizando el siguiente cálculo: Calorías. Se calcula realizando alguno de los siguientes cálculos, según corresponda: 32

33 Calorías por grasa. Se calcula realizando alguno de los siguientes cálculos, según corresponda: 33