Práctica 6 : FOTOSÍNTESIS Y TRANSPIRACIÓN

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1 Práctica 6 : FOTOSÍNTESIS Y TRANSPIRACIÓN I.- Objetivos Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: * Describir el rol de la luz y los pigmentos en la fotosíntesis. * Identificar la clorofila y otros pigmentos presentes en las hojas por medio de las técnicas de cromatografía. * Explicar el efecto de la luz sobre la tasa fotosintética con base en la producción de O 2 y consumo de CO 2 * Cuantificar el efecto de la luz sobre el proceso de transpiración II.- Introducción Las células llevan a cabo diversos procesos para mantener su funcionamiento normal, muchos de los cuales requieren de energía. A través del proceso de la fotosíntesis, los organismos autótrofos (cianobacterias, algas y plantas) capturan la energía libre del ambiente y en presencia de CO 2 y H 2 O, la convierten en energía química que se almacena en forma de azúcares u otras moléculas orgánicas. El proceso de fotosíntesis es uno de los muchos fenómenos de la naturaleza que tiene una influencia directa sobre la mayoría de los seres vivos ya que la biomasa vegetal obtenida por la fotosíntesis es la única fuente de materia orgánica que pueda servir de alimento y fuente de energía a todos los organismos vivos. Desde el punto de vista bioquímico, el proceso de fotosíntesis, es un proceso complejo de reacciones químicas que se inicia con la captación de energía por parte de pigmentos fotosintéticos que absorben fotones de luz en un rango de longitudes de onda específicas del espectro visible. El proceso general de fotosíntesis se puede resumir de la siguiente forma: 12H 2 O + 6CO 2 + luz C 6 H1 2 O 6 + 6O 2 + 6H 2 O (1) En las células eucariotas, la fotosíntesis ocurre en el interior del cloroplasto, el cual está formado por una matriz relativamente homogénea (estroma) delimitada por una doble membrana. En la matriz se observan un conjunto de sacos aplanados (tilacoides) dispuestos en forma apilada, que en conjunto se conoce como grana. En el interior de los tilacoides se encuentran una serie de pigmentos que tienen la propiedad de absorber fotones de luz en el espectro de longitudes de onda de la luz visible, y transfieren esa energía a una serie de moléculas que participan en las reacciones de la fotosíntesis (fotosistemas). Se han caracterizado tres grupos principales de pigmentos fotosintéticos: clorofila, ficobilinas y carotenoides (carotenos y xantofilas) Cada uno de éstos grupos incluyen diferentes tipos de pigmentos que absorben luz a diferentes longitudes de onda. También difieren en el grado de solubilidad al agua o grado de polaridad. Aunque la clorofila a (o bacterioclorofila en procariotas) es fundamental para el funcionamiento del fotosistema, todos los organismos autótrofos contienen una mezcla de más de una clase de pigmento, cada uno con un espectro de absorción, y función, diferente. La clorofila b, clorofila c, carotenoides y

2 ficobilinas son pigmentos accesorios cuya función es ampliar el espectro de absorción de los pigmentos primarios y como sistemas de protección frente a la luz excesiva. El siguiente cuadro es un resumen de algunas características de los pigmentos fotosintéticos más comunes Cuadro 1: Características de los pigmentos fotosintéticos más comunes en los organismos autótrofos Pigmento Color Polar Longitud de onda de absorción Clorofila Clorofila a Azul-verde no 430 nm; 662 nm Clorofila b Amarillo-verde no 453 nm ; 642 nm Clorofila c Verde claro no 430 Carotenoides Caroteno Anaranjado no 450 nm; Xantófilas amarillo no 530 nm Ficobilinas Ficoeritrina rojo si 590 nm Ficocianina azul si 625 nm Para que el proceso de la fotosíntesis ocurra, las plantas deben mantener los estomas abiertos con la finalidad de permitir el intercambio de CO 2 /O 2 desde/hacia la atmósfera. Como una consecuencia de la actividad fotosintética en las células del mesófilo, existe un componente de pérdida de agua en forma de vapor de agua. La transpiración es un proceso biológico en el cual la planta toma agua del suelo hacia las raíces, el tallo y las hojas, Este proceso comprende la evaporación del agua desde el interior de los espacios intercelulares en las superficie de la hoja y su difusión fuera del tejido vegetal principalmente a través de los estomas y en menor medida a través de la cutícula. Debe existir un balance entre el transporte de CO 2 y O 2 y la pérdida de agua. Recordemos que las células guardianas de los estomas participan en la regulación de la apertura y cierre de los estomas en respuesta a distintas condiciones ambientales. En general, la tasa de transpiración de un determinante primario del balance energético de la hoja y del estado hídrico de la planta y depende de la temperatura, la humedad y el área superficial de la hoja. En esta práctica se pretende hacer un análisis general del complejo e importante proceso de la fotosíntesis. Para ello se realizarán diferentes procedimientos, empezando con la estimación de la tasa fotosintética, midiendo tanto la tasa de consumo de CO 2 y la tasa de producción de O 2 mediante un ensayo de discos flotantes. Así mismo, identificaremos los pigmentos fotosintéticos presentes en una hoja mediante una técnica de separación llamada cromatografía de papel. Finalmente, estudiaremos la tasa de transpiración como una medida del balance energético e hídrico de la planta. 2 III.- Procedimiento Durante la sesión de laboratorio se realizarán 4 experimentos que le permitirán conocer algunos aspectos de los procesos de fotosíntesis y respiración. Para lograr este objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un experimento, de acuerdo con las indicaciones del instructor. Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados.

3 3 PROBLEMA: Antes de iniciar la recolección de datos, para cada experimento plantéese una pregunta de trabajo, y basándose en ésta, diseñe una hipótesis de trabajo y una predicción de sus resultados. Identifique en su hipótesis las variables dependientes e independientes Diseñe un cuadro completo en donde pueda anotar los datos colectados y el análisis realizado. Experimento 1 El papel de la luz en la fotosíntesis.- Absorción del dióxido de carbono La absorción del dióxido de carbono por las plantas en presencia de luz es una evidencia indirecta del proceso de fotosíntesis. Uno de los métodos más simples para demostrarlo es estimar cambios en los niveles de CO 2 disuelto en una solución que contiene una planta acuática bajo condiciones de iluminación (Elodea). El CO 2 en solución acuosa se convierte en un ácido (ácido carbónico), cuya concentración se medirá por medio de una titulación usando un indicador de ph (fenolftaleína). Con este indicador se observará el punto de cambio en ph, donde se obtiene el equilibrio entre ph ácido y básico. Este cambio en ph sucede al añadirle una solución básica de NaOH a la muestra ácida, y se observa por un cambio en color; de esta forma se podrá calcular la producción de CO 2 para cada organismo EQUIPO Y MATERIALES Frascos de vidrio Lámpara Pajillas Rama de Elodea Beaker de 100 ml SOLUCIONES dh 2 O Fenolftaleína Solución de NaOH 2,5 µm PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Dipense 200 ml de dh 2 O en un becker 2. Con una pajilla sople la solución en forma contínua. 3. Dispense 25 ml de dh 2 O cargada de CO 2 en tres frascos de vidrio etiquetados de la siguiente forma: control, luz, oscuridad 4. En el frasco número 1 no agregue ninguna planta (control), mientras a los frascos número 2 y 3 (luz, oscuridad) agregue en cada uno una rama de Elodea. 5. Tape herméticamente los frascos, y al frasco 3 (oscuridad) cúbralo completamente con papel de aluminio. 6. Coloque los frascos1 y 2 cerca de una fuente de iluminación y espere unos 30 minutos.

4 7. Al finalizar los 30 minutos, añada 5 gotas de fenolftaleína (éste indicador es incoloro en soluciones ácidas y se torna rosado en soluciones alcalinas) y mezcle bien. 8. Llene la bureta de titulación con la solución de mm de NaOH. 9. Mueva el frasco en círculos y añada gotas de la solución de NaOH hasta obtener un color rosado persistente. 10. Anote en el cuadro de resultados la cantidad de NaOH que utilizó para obtener un cambio en el color del frasco, mediante la titulación. 11. Calcule el consumo de CO2 mediante esta ecuación: [CO 2 ] = ml de NaOH (experimental) ml de NaOH (control) * [NaOH] Volumen de la Elodea (ml) Para determinar el volumen de Elodea, siga el siguiente procedimiento: a.- Coloque la Elodea en un vaso (beaker) pequeño con 50 ml de agua. b.- Haga una marca donde queda el menisco. c.- Remueva cuidadosamente el organismo con la precaución de no derramar agua. d.- Con una pipeta llena añada agua hasta llegar a la marca. e.- La diferencia de lectura en la pipeta indicará el volumen del organismo. 12. Repita el proceso con los demás frascos. 13. En el cuadro de datos diseñado por el subgrupo de trabajo, reporte sus datos y discuta las diferencias en las concentraciones de CO 2 en las 3 condiciones experimentales Experimento 2 PROBLEMA: El papel de la luz en la fotosíntesis.- Producción de O 2 De acuerdo a la ecuación 1 (introducción) la tasa fotosintética de una planta puede ser medida indirectamente estimando la tasa de liberación de O 2 en la planta o en una hoja aislada. Sin embargo, es importante de recordar que el proceso de respiración ocurre simultáneamente al proceso de fotosíntesis. Por lo tanto, el consumo del O 2 (respiración aeróbica) acumulado en la hojas (mesófilo esponjoso) disminuye la cantidad de O 2 que podría ser liberado como producto de la fotosíntesis por respiración aeróbica. De esta forma, valores de O 2 liberado representan una medida de la tasa neta de fotosíntesis. Uno de los métodos frecuentemente utilizados para estimar la tasa neta fotosintética se basa en la eliminación al vacío, de gases (O 2 y CO 2 ) acumulados en el mesófilo de una hoja, cortada en forma de discos, que posteriormente se infiltran con una solución de bicarbonato de sodio como fuente de CO 2. En oscuridad, los discos desgasificados permanecerán en el fondo de la solución de bicarbonato de sodio, pero en presencia de una fuente de luz, se van acumulando O 2 en los espacios intersticiales producto de la fotosíntesis, haciendo que los discos floten en la solución (si la tasa de producción de O 2 por fotosíntesis, sobrepasa la tasa de de consumo de O 2 por respiración aeróbica). EQUIPO Y MATERIALES 3 Jeringas de 5 ml etiquetadas (c/co 2 +luz, c/co 2 +oscuridad y 4 SOLUCIONES dh 2 O Solución jabonosa

5 s/co 2 ) Envases plásticos Lámpara Hojas de espinaca Perforador de hoja cronómetro regla Soporte mecánico Manguera Vaselina Tapones de hule Papel toalla 5 Bicarbonato de sodio (NaHCO 3 ) 0.2% PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL El siguiente experimento consiste en cuantificar el número de discos de hojas de igual tamaño, que flotan, en 3 condiciones experimentales: control, en presencia de CO 2 en condiciones de luz, y en presencia de CO 2 pero en condiciones de oscuridad. Nota: Las 3 condiciones experimentales pueden ser ejecutadas simultáneamente, participando todos los compañeros del subgrupo de trabajo, o de forma secuencial. Discuta con sus compañeros y el instructor, la estrategia que van a seguir en su subgrupo 1. Agregue un volumen de 100 ml de Bicarbonato de Sodio en los dos envases plásticos rotulados como c/co 2. Al otro frasco (s/co 2 ), agregue el mismo volumen de dh 2 O. 2. En cada uno añada una gota de solución jabonosa, evitando la formación de burbujas. 3. Usando un perforador, corte 30 discos de hojas de espinaca, evitando cortar sobre la vena principal de la hoja. Escoja un área de la hoja lo más uniforme y delgada posible. 4. Remueva el pistón de cada jeringa, y coloque 10 discos en cada jeringa. 5. Cuidadosamente, coloque nuevamente el pistón. Coloque la jeringa en posición vertical y empuje el pistón hasta un punto en la jeringa donde un volumen pequeño de aire permanece junto a los discos (aproximadamente 10% del volumen de la jeringa). 6. Succione un volumen pequeño (3-5 ml) del envase rotulado como s/co 2. Manteniendo la jeringa invertida (la punta dirigida hacia arriba), haga movimientos de la jeringa hasta que todos los discos se mantengan suspendidos en la solución. 7. Coloque la tapa de la punta de la jeringa y mantenga presión sobre ella con el dedo índice de su mano izquierda. Sosteniendo la jeringa hacia arriba, genere un vacío dentro de la jeringa, halando el pistón hacia afuera con la mano derecha, mientras mantiene cerrada la punta de la jeringa. (si al soltar el pistón, éste no regresa a su posición inicial, significa que no está generando un buen vacío). Mantener la presión al menos 10s. Note que se forman pequeñas burbujas provenientes tanto el aire que estaba disuelto en el agua como el aire de adentro de la hoja que se juntan para formar burbujas grandes. Expulse este aire quitando el dedo y empujando el pistón.

6 6 8. Repita el paso anterior 2-3 veces, hasta observar que los discos se hunden al fondo de la jeringa. Nota: si encuentra dificultad en lograr que los discos se sumerjan en la solución trate de añadir 1 o más gotas de jabón en la solución prueba. No trate de generar vacío en la jeringa más de 5 veces ya que puede dañar los discos. 9. Coloque la jeringa cerca de la fuente de luz (lámpara), evitando que se caliente demasiado. Inicie el cronómetro. 10. Cuente el número de discos que flotan, al final de cada minuto (asegúrese de sacudir muy suavemente la jeringa si algún disco se queda pegado en las paredes de la jeringa). Continúe midiendo por 10 min o hasta que todos los discos flotan. 11. Repita el mismo procedimiento, utilizando igual cantidad de discos, pero en presencia de la solución de bicarbonato y finalmente, en presencia de bicarbonato pero manteniendo la jeringa en condiciones de oscuridad. 12. Para el análisis, haga una gráfica donde se represente el número de discos que flotan en función del tiempo, para las 3 condiciones experimentales, control, en presencia de CO 2 + luz y en presencia de CO 2 + oscuridad. En la gráfica, determine el punto en el tiempo en el cuál el 50% de los discos de hoja están flotando (ET 50 ) el cual representa un valor confiable de la tasa fotosintética. 13. Compare los valores de ET 50 en las 3 condiciones experimentales Numero de discos flotando Tiempo (min) EC 50 Experimento 3 PROBLEMA: Efecto de la luz en la tasa de transpiración El método más simple y frecuentemente utilizado en la mayoría de los laboratorios de enseñanza consiste en un depósito de agua (tubo o manguera plástica), en el que a un extremo se introduce una rama, que se ajusta al orificio de un tapón de hule. El contacto entre el tallo de la rama-tapón-manguera debe ser hermético. En el otro extremo de la manguera, se conecta un tubo capilar calibrado o pipeta volumétrica, el cual permite medir directamente la pérdida de agua por parte de la planta por transpiración. Con ésta técnica se pueden utilizar pedazos de ramas, tallos, hojas y otros, pero no plantas completas Debido a que el agua se evapora a través de los muchos estomas que se encuentran en la superficie de la hoja de una planta, la rama fresca sello hermético manguera llena de agua pipeta volumétrica sello hermético

7 tasa de transpiración está directamente relacionada con el área superficial de la hoja y se debe expresar como la cantidad de agua perdida (ml) por metro cuadrado por minuto (m 2 /min). Para cuantificar la tasa de transpiración, por lo tanto, debe calcular el área de superficie de las hojas de cada rama utilizada: EQUIPO Y MATERIALES Soporte mecánico Pinza para bureta Tubo plástico Rama de una planta Pipeta volumétrica de 2 ml PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Obtenga un tubo plástico y llénelo con agua 7 SOLUCIONES dh 2 O 2. Coloque en uno de los extremos del tubo una pipeta volumétrica de 1ml 3. Tome los dos elementos (manguera + pipeta) y coloque el otro extremo en un envase con agua. 4. Conecte un pipeteador en el extremo libre de la pipeta y llene la pipeta, a través de la manguera, evitando la formación de burbuja. Una vez alcance la marca de 0 ml, no succione más. No retire el pipeteador del extremo de la pipeta. Si observa alguna burbuja a lo largo de la columna de agua, debe expeler todo el agua, e iniciar de nuevo. En los siguientes pasos, el extremo de la rama cortada debe permanecer en contacto con el agua, no expuesta al aire, para evitar romper la columna de agua en el xilema 5. Escoja una rama para cortar. 6. Con un cortador, corte en ángulo el tallo de una rama bajo el agua. 7. Sin sacar el tallo de la bandeja de agua, inserte la rama en el tapón que sella el terminal de la manguera + pipeta. El diámetro de la rama debe ajustar firmemente el diámetro del tapón. 8. Remueva el combinado rama-manguera-pipeta y rápidamente coloque vaselina alrededor de las zona de contacto de la manguera con la pipeta y la rama. 9. Coloque los dos extremos del combinado rama-manguera-pipeta en la pinza para bureta, formando una U con la manguera, como se muestra en la figura. Asegúrese que durante esta manipulación la planta siempre se mantiene en contacto con el agua y que el agua no entre al pipeteador. 10. Con mucho cuidado retire el pipeteador y verifique que el nivel de agua no cambia, lo que demuestra que los extremos están bien sellados. 11. Coloque su preparación a las condiciones establecidas por el instructor y mida el nivel de agua en la pipeta cada 2 minutos, por 30 min. 12. Una vez finalizado, remueva la rama de la manguera y limpie su estación de trabajo. Recuerde eliminar completamente los restos de vaselina.

8 13. Calcule la tasa de transpiración de la planta midiendo el volumen de agua consumido por la planta por unidad de tiempo (min). 14. Para expresar la tasa de transpiración por unidad de área, es necesario conocer el área superficial de la hoja. Para ello: a. Coloque las hojas a medir en una cuadrícula de 1 cm. b. Trace el contorno de cada hoja. c. Cuente un cuadrado parcial si es de al menos la mitad cubierta por la hoja, no cuente cuadrados parciales que cubren menos de la mitad). Tampoco incluya el área del tallo (pecíolo) en sus cálculos. 15. Compare sus resultados con otros grupos PROBLEMA: Separación de los pigmentos vegetales 8 Experimento 4 Los cloroplastos contienen una mezcla de pigmentos fotosintéticos cuya composición varía entre los distintos organismos autótrofos. Con base en las propiedades químicas individuales y la polaridad relativa de cada pigmento, éstos pueden ser separados y diferenciados en componentes individuales. La cromatografía es una técnica físico-química que se usa para separar e identificar sustancias en sus constituyentes individuales. Consiste en una migración de los componentes de la mezcla entre la fase fija, que es la fase estacionaria y otra fase móvil. La separación es posible debido a que algunas sustancias se retienen mejor en la fase estacionaria, mientras que otras se mueven mejor en la fase móvil. Se puede identificar varios tipos de cromatografía dependiendo del estado físico de las fases que participan: (1) cromatografía de adsorción en la cual, la fase estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida, y (2) cromatografía de reparto. En este caso, la fase líquida o gaseosa se desplaza sobre una fase líquida estacionaria colocada en la superficie de un soporte sólido. La cromatografía de papel se fundamenta en una combinación entre la cromatografía de adsorción y cromatografía de reparto. La partición ocurre entre el agua que hidrata la celulosa y la fase móvil orgánica. EQUIPO Y MATERIALES Extracto de pigmentos Papel de cromatografía de papel Tijera Capilares de vidrio PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL SOLUCIONES dh 2 O Solución reveladora 1. Tome una tira de papel de cromatografía y marque con un lápiz, una línea 1,5 cm de distancia del fondo del papel. Esta línea indicará el área de inicio donde se colocará el extracto de pigmentos 2. Haga un corte en forma de V en el extremo donde colocó el extracto 29 cm 2 3. En el borde superior de la tira de papel marque una raya a 2 cm. del borde superior, ésta indica el frente, y será el punto final al que debe llegar la solución reveladora (cuando el frente llegue a este punto, saque inmediatamente el papel del tubo de ensayo).

9 9 papel de cromatografía 1,5 cm poner la siguiente. capilar 4. Con un capilar de vidrio pequeño extraiga una cantidad del extracto de pigmento. el cual consiste en hojas frescas de espinacas (Spinacia oleracea, Chenopodiaceae) o güitite (Solanaceae). 5. Deposite una pequeña cantidad del extracto. Para ello dibuje con el extremo del capilar que contiene el extracto rápidamente una línea paralela a la línea de inicio (paso 1) 6. Cuando esta gota esté seca añada mas extracto, siguiendo el mismo procedimiento, esperando que cada una seque antes de 7. Suspenda la tira de papel con un gancho dentro de un tubo de ensayo que contenga la solución reveladora (acetona al 8% y éter de petróleo 92%). Cuide que el papel no haga contacto con las paredes del tubo de ensayo. 8. Regule la superficie de contacto con el líquido sacando o introduciendo el gancho dentro del corcho. El papel debe tocar con la punta la superficie del líquido, pero no debe introducirse en el mismo. 9. Una vez que el papel ya tocó el solvente, cierre el frasco. No mueva y golpee el frasco 10. Cuando el frente llegue al punto final (2cm del borde) saque el papel y póngalo a secar al aire, en un sitio oscuro. 11. Cada una de las bandas coloreadas del extracto de las plantas es un pigmento diferente. Para cada uno de los pigmentos que observa aplique la siguiente fórmula: Rf = distancia recorrida por el pigmento distancia recorrida por el disolvente El Rf es un indicador de la afinidad de cada pigmento por las fases sólida y líquida. Se utiliza para caracterizar pigmentos; por lo tanto, el pigmento que tenga mayor Rf, será el más afín a la fase líquida y el de menor Rf será el más afín a la fase sólida. 12. Haga un esquema en el reporte de sus resultados.