UNA PLANTA MODELO. Kalanchoe daigremontiana

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1 UNA PLANTA MODELO Kalanchoe daigremontiana El género Kalanchoe (familia Crassulaceae, orden Saxifragales) presenta algunas interesantes adaptaciones a climas áridos y cálidos, tales como la apertura nocturna de los estomas. Estos permanecen cerrados durante el día, reduciendo la pérdida de agua. El proceso fotosintético se caracteriza por un mecanismo alternativo de fijación de carbono, denominado metabolismo ácido de las Crassuláceas (CAM). Por la noche, cuando las plantas abren los estomas, el carbono (CO2) es fijado en forma de ácidos. De día, cuando los estomas están cerrados y en presencia de luz, ATP y NADPH para el ciclo de Calvin, el CO2 es liberado de los ácidos orgánicos e incorporado como azúcar. Las plantas CAM mantienen una división temporal entre la fase luminosa de la fotosíntesis y el ciclo de Calvin. Dentro del género Kalanchoe encontramos especies que se reproducen siempre sexualmente, formando flores y semillas. También encontramos especies que se pueden reproducir asexualmente mediante la formación, en los bordes de las

2 hojas, de embriones y plántulas que al desprenderse y caer al suelo, generan plantas-hijas. En algunas especies, como Kalanchoe beharensis (oreja de elefante), portadoras de una versión del gen LEC1 que permite la formación de semillas, la producción de embriones foliares solo ocurre inducida por condiciones de stress. En otras, como Kalanchoe daigremontiana, portadoras de una mutación en el gen LEC1 que no les permite formar semillas, la reproducción asexual es constitutiva (obligatoria). Los Kalanchoes presentan algunas propiedades medicinales e insecticidas, de modo que pueden resultar tóxicas cuando son ingeridas por niños o animales de pequeño tamaño. En el laboratorio de enseñanza, adoptamos Kalanchoe daigremontiana como planta modelo porque permite desarrollar sin mayores contratiempos todos los estadíos de la micropropagación: obtención de los explantes, desinfección y sembrado in vitro; multiplicación mediante subcultivos sucesivos, transferencia a tierra y aclimatación. BIBLIOGRAFÍA GARCÊS H. M. P. et al. Evolution of asexual reproduction in leaves of the genus Kalanchoe. PNAS 104:39,2007 MALAJOVICH M.A. e MANN V.S. Micropropagación. Guía 80: El laboratorio de enseñanza; Guía 85: La desinfección de los instrumentos; Guía 90: La desinfección de los explantes y Guía 96: Los medios de cultivo.

3 ACTIVIDAD PRÁCTICA OBJETIVO Reproducir los principales estadios de la micropropagación. MATERIALES Una planta de Kalanchoe daigremontiana, frascos o tubos de ensayo con medio de cultivo* estéril, 1 azulejo limpio, 1 colador, 1 pinza, 1 cuchillo o bisturí, alcohol 70º, Clorin 10 (Dicloro isocianurato de sodio; 10,1 en cloro activo) **, vaso de precipitados de 1 litro, agua destilada, vasos plásticos pequeños con tierra de jardín, filme de PVC (Rolopac), macetas con tierra de jardín. * El medio de cultivo es una solución de sales minerales gelificado con agar (0,7%). No es necesario agregar sacarosa o azúcar cristal, ni agua de coco. (Guías 111: Micropropagación: medios clásicos y 112: Micropropagación: medios alternativos). ** Clor-in 10 es un producto comercial para la desinfección de hortifrutícolas. Disolver una pastilla en 500 ml de agua, según indicaciones del fabricante. No es necesario enjuagar. Utilizar agua destilada en la desinfección de los explantes y agua de grifo para desinfectar el colador. PROCEDIMIENTO Estadio 1: Separación de los explantes y sembrado in vitro Antes de comenzar: Desinfectar la pinza en alcohol 70º y el colador por inmersión durante al menos 20 minutos en una solución de Clor-in 10, preparada disolviendo una pastilla en 500 ml de agua. 1. Separar los explantes: retirar los embriones foliares de la planta o cortar algunos fragmentos de hoja. 2. Desinfectar los explantes por inmersión en una solución de Clor-in 10, preparada disolviendo una pastilla en 500 ml de agua destilada. Revolver continuamente.

4 3. Eliminar con el colador la solución desinfectante, reteniendo los explantes. 4. Con la pinza, transferir los explantes a los frascos que contienen medio de cultivo. 5. Incubar los explantes en presencia de luz, a temperatura ambiente. Estadio 2: Multiplicación (Opcional) La multiplicación es posible cuando el explante inicial es un fragmento de hoja sobre la cual se desarrollan los embriones foliares, como se observa en la imagen de al lado. Repicar asépticamente los embriones transfiriéndolos a frascos con medio de cultivo estéril de la misma composición. Incubar en presencia de luz. Estadio 3: Transferencia a tierra Lavar bien las plantitas para retirar el exceso de agar y transferirlas a los vasos con tierra. Después de un tiempo, repetir el procedimiento, pero esta vez a las macetas definitivas que serán colocadas en el exterior.

5 NUESTRO COMENTARIO Kalanchoe daigremontiana, nuestra planta modelo, crece en un medio de cultivo sin azúcar, de modo que el número de contaminaciones es muy bajo. En vez de centralizar la actividad en la composición del medio, como se hace habitualmente, preferimos insistir en los estadíos de la micropropagación. Por otro lado, el uso de Clor- in 10 simplificó enormemente la tarea de desinfección de los explantes. Obtuvimos un buen número de clones con nuestro grupo de primer año del Curso Medio Técnico de Biotecnología. Las diferentes etapas del trabajo se muestran ilustradas en las figuras anexas. CÓMO MONTAR UN PROYECTO? Seguir el crecimiento en medios de cultivo de diferente composición. Figura 1. Crecimiento in vitro de los explantes. Arriba, de izquierda a derecha: embrión foliar, hoja y fragmento de hoja. Abajo, los mismos cultivos después de un tiempo.

6 Figura 2. Incubación de embriones foliares Figura 3. Transferencia a tierra

7 Figura 4. Aclimatación Figura 5. Clones de Kalanchoe daigremontiana, preparados por el grupo de primer año del Curso Medio Técnico de Biotecnología, en la exposición montada en ocasión de la Semana Nacional de Ciencia y Tecnología 2013 en el Instituto de Tecnologia ORT de Rio de Janeiro.

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