Metagenómica Revelación de comunidades microbianas

Transcripción

1 Metagenómica Revelación de comunidades microbianas Adriana González, Martha Cárdenas y Silvia Restrepo Los microorganismos juegan un papel esencial en la vida sobre la Tierra. Ellos facilitan de formas muy variadas nuestra vida. Gracias a ellos se pueden llevar a cabo los ciclos del carbono, del nitrógeno y del azufre, entre otros. Durante años, los seres humanos nos hemos aprovechado de sus capacidades metabólicas para producir alimentos, antibióticos y recuperar ambientes contaminados. Las interacciones de los microorganismos con su entorno y con otros seres vivos han sido el objeto de innumerables investigaciones, no solamente con el fin de entenderlas sino también de revelar el potencial biotecnológico que se esconde tras ellas. La metagenómica es una estrategia entre muchas para estudiar los microorganismos. El término metagenómica hace referencia al estudio de genomas de una comunidad microbiana. Meta viene del griego más allá de entendiéndolo como ir más allá del genoma [1], y así es, ya que permite analizar la estructura y función en conjunto de un gran número de genes presentes en un ambiente determinado. Tradicionalmente el estudio de los microorganismos presentes en un nicho se ha realizado haciendo uso de las técnicas tradicionales de microbiología y su caracterización en el ámbito genético se ha efectuado mediante técnicas de clonación y secuenciación. De esta forma, el estudio de la diversidad microbiana se había restringido a aquellos microorganismos cultivables y se habían excluido aquellos que no eran fácilmente cultivables en laboratorio, y por lo tanto el estudio de las comunidades microbianas en su ambiente natural no había sido posible [2]. Sin embargo, en los últimos años se tomó conciencia de esta enorme falla y se comenzaron a adoptar estrategias que permitieran abordar las comunidades microbianas como un todo y no de forma individualizada como se estaba llevando a cabo. Los primeros estudios realizados en comunidades microbianas se concentraron en el empleo de la secuencia ribosomal 16S del ARN ribosomal de bacterias para distinguir una especie de otra [3]. Aunque fue muy útil para identificar grandes comunidades bacterianas, se tenía el inconveniente de obtener secuencias que no correspondían con ninguna especie cultivada reportada, lo que indicó que mediante esta técnica no se lograba identificar todos los organismos presentes en determinado nicho. Posteriormente, se utilizó la extracción de ADN directamente de la muestra ambiental y la subsiguiente amplificación de la región de 16S. En el caso de los hongos también se emplearon los genes ribosomales y en especial las regiones espaciadoras internas transcritas (ITS), para caracterizar las comunidades asociadas a diferentes ambientes y en particular al suelo [4]. Sin embargo estas primeras aproximaciones tenían la desventaja de que también se requería de un paso de clonación para poder llevar a cabo la secuenciación de las regiones nucleares amplificadas. El objetivo de la metagenómica es hacer uso de las técnicas modernas de secuenciación para el estudio de microorganismos directamente en su ambiente natural sin la necesidad de pasar por técnicas 20 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, núm. 12, febrero del 2012

2 de aislamiento y cultivo en laboratorio [5]. La aproximación consiste en emplear marcadores que permitan determinar la diversidad de microorganismos y genes presentes en una muestra ambiental. Hoy en día con la combinación de dos tecnologías de secuenciación de segunda generación como son 454-pirosecuenciación e Illumina-Solexa, ha sido posible secuenciar todo un metagenoma ambiental, así como también reorganizar genomas completos a partir de pequeños fragmentos de secuencia [1]. No obstante, con estas aproximaciones se genera un volumen enorme de datos para ser analizados y así poder responder a preguntas como: a quién pertenece esta secuencia? o cúal es la función de esta secuencia? Con las técnicas convencionales de secuenciación, en las que se hacían los análisis de un número no tan grande de pares de bases (entre 10 mil millones a 20 mil millones) existía la tendencia a promediar las pequeñas variaciones encontradas, las cuales eran atribuidas a un mismo genoma o pan-genoma, el cual hace referencia al contenido genético compartido entre los aislamientos de una misma especie. Con las nuevas técnicas de secuenciación utilizadas en metagenómica, el número de pares de bases es mucho mayor (>100 mil millones), lo que permite resolver un número diferente de genomas y potencialmente relacionar diferentes cepas con diferentes genomas, permitiendo un mejor entendimiento del papel de la variación genética en una población [1]. Qué se ha hecho? El primer gran proyecto de metagenómica fue denominado GOS (Global Ocean Sampling Expedition), este consistió en la exploración del genoma del océano con el objetivo de evaluar la diversidad genética en comunidades microbianas marinas para entender su papel en los procesos fundamentales de la naturaleza [6]. Este proyecto comenzó en el 2003 en el mar de los Sargazos, en el cual se encontró ADN de alrededor de 2000 diferentes especies, comprendiendo 148 tipos de bacterias nunca antes identificadas. El líder del proyecto, Craig Venter, continuó su periplo por el globo y en el año 2009 exploró la costa oeste de los Estados Unidos, y actualmente se encuentra en medio de una expedición de dos años para explorar el mar Báltico, el mar Mediterráneo y el mar Negro. En la actualidad, se está desarrollando el Proyecto del Metagenoma de la Tierra (Earth Microbiome Project) cuyo principal objetivo es el de entender las interacciones entre los microorganismos y sus ambientes. Es un trabajo de investigación que se está desarrollando en conjunto con diversos centros y universidades del mundo, los que están desarrollando una base de datos global con el fin de catalogar todas las muestras y los datos asociados encontrados en cada estudio, para que de esta forma, una vez la información se encuentre organizada y disponible, se pueda proceder a la secuenciación y al consolidado de la diversidad microbiana y por ende a la diversidad a nivel de genes y de proteínas en el planeta [1]. Los microorganismos y las comunidades microbianas encontradas durante este trabajo serán organizados de acuerdo con una amplia gama de ambientes o biomas, definidos con un único parámetro ambiental que permita establecer la estructura microbiana de la comunidad presente bajo esas determinadas condiciones. En cuanto a lo ambiental, el uso de metagenómica ha permitido monitorear el efecto de contaminantes en ecosistemas, así como también estudiar las comunidades microbianas que le hacen frente a esos compuestos [7]. De igual forma, la metagenómica ha permitido el descubrimiento de nuevos genes que codifican para enzimas, metabolitos y productos naturales antes no descritos y que son producidos por microorganismos no cultivables [8]. También ha permitido caracterizar las comunidades microbianas en las interacciones hospedero patógeno tanto en el ámbito humano como en plantas, estudiando en conjunto todos los microorganismos presentes en el hospedero y no uno a uno [9, 10]. Para los ecosistemas tropicales, los estudios de diversidad se han concentrado desde el punto de vista ecológico en la parte macrobiológica en las regiones del Amazonas y de los Andes suramericanos. Hasta el momento no se conocen estudios enfocados en diversidad microbiológica que comprendan caracterización a gran escala de las comunidades presentes en estos ecosistemas utilizando técnicas de metagenómica. Estas comunidades han sido estudiadas solamente utilizando métodos convencionales basados en cultivos o mediante el uso de técnicas de biología molecular como clonación, PCR, DGGE o PLFA [11, 12, 13]. Y en Colombia? Colombia es uno de los países con mayores recursos hídricos del planeta, cuenta con una gran cantidad de grupos taxonómicos en fauna y flora típica de la zona ecuatorial, lo que indica que posee una gran variedad de ambientes en los que habita una comunidad diversa de microorganismos. Sin embargo, Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 21

3 Figura 1. Cultivo de papa muchos de estos ecosistemas tan diversos y variados, han sido intervenidos por el hombre. Por ejemplo, la gran mayoría de sus tierras ha sido utilizada para la agricultura por muchos años y el uso indiscriminado de agroquímicos para el control de plagas y enfermedades ha ocasionado cambios en las propiedades fisicoquímicas de estos [14, 15], afectando a su vez la dinámica de las comunidades microbianas presentes [16, 17, 18]. Una comparación entre suelos agrícolas intervenidos y no intervenidos por la actividad humana mostró que los cambios ocasionados por los tratamientos tradicionalmente utilizados en estos suelos han favorecido la dominancia de ciertas especies, originando comunidades microbianas menos complejas [19]. Sin embargo la metagenómica no ha sido utilizada para confirmar estos cambios en nuestra microbiodiversidad. Entre los cultivos sembrados en una gran parte de los suelos colombianos se encuentra la papa amarilla, Solanum phureja, conocida también como papa criolla, que representa uno de los alimentos de importancia social y económica en América Latina. Este cultivo se encuentra en terrenos a una altura entre 1800 y 3200 metros sobre el nivel del mar a una temperatura que puede oscilar entre los 0 ºC y 20 ºC en suelos expuestos a niveles intensos de radiación solar. Por su amplia adaptación a las condiciones mencionadas anteriormente, hay regiones en las cuales este cultivo es tratado con compuestos biológicos mientras que en otras mediante compuestos químicos. Estas características del cultivo de papa criolla, además de la importancia de que sean cultivados en suelos de gran biodiversidad, hacen que este cultivo sea un ecosistema interesante para el estudio de su diversidad microbiana. Con el apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y la Federación de Cafeteros de Colombia, varias universidades e institutos se unieron para el estudio de la diversidad microbiana y la metagenómica en suelos de cultivos orgánicos y tradicionales de papa criolla. Hacen parte de este consorcio, la Universidad 22 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, núm. 12, febrero del 2012

4 Nacional de Colombia con los profesores Daniel Uribe, Emiliano Barreto y Fabio Aristizábal; Corpogen con su directora Patricia Del Portillo; la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) con el investigador Antoni Rueda y la Universidad de los Andes con la profesora Silvia Restrepo. El objetivo principal del proyecto es la construcción de un microarreglo para la evaluación de la calidad de suelos. Sin embargo, para la fabricación del microarreglo, se realizó un estudio metagenómico completo de los diferentes tipos de suelo, estudio de diversidad de bacterias, arqueas y hongos y secuenciación del ADN total. Los resultados preliminares muestran que, a) para un promedio de lecturas (de pirosecuenciación) por finca, no se ha llegado a la saturación de la diversidad de bacterias pero sí de hongos; b) el 40 % de las secuencias 16S y el 70 % de las secuencias ITS no se pudieron identificar, mostrando que aún desconocemos la microbiota de nuestros suelos; c) el tipo de práctica agrícola no afecta la diversidad bacteriana pero sí influye en la diversidad de hongos, cambiando la composición de los principales órdenes de hongos en los dos tipos de suelos. Por su lado, el análisis de ADN total ha permitido identificar las principales enzimas de varios ciclos biogeoquímicos y así guiar el diseño del microarreglo. Perspectivas En el futuro las mayores aplicaciones de la metagenómica serán el descubrimiento de nuevas enzimas, el descubrimiento de metabolitos útiles para el control de patógenos y la caracterización de las reacciones patogénicas entre microorganismos y plantas o animales. El análisis de estas interacciones permitirá el descubrimiento de factores de patogenicidad que podrán ser empleados posteriormente como blanco en el diseño de estrategias eficientes de control. REFERENCIAS [1] Gilbert, J. A. et ál. (2010), Metagenomics. A foundling finds its feet, en Standards in Genomic Sciences, 3: [2] Chen, K. & Pachter, L. (2005), Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of microbial communities, en PLoS Computational Biology, 1: [3] Coenye, T. & Vandamme, P. (2003) Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes, en FEMS Microbiology Letters, 228: [4] Viaud, M.; Pasquier, A. and Brygoo, Y. (2000), Diversity of soil fungi studied by PCR-RFLP of ITS, en Mycological Research, 104, 9: [5] Jurkowski, A. & Handelsman, J. (2008), Metagenomics, en Nature Reviews Microbiology, junio. [6] Venter, J. C. et ál. (2004), Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea, en Science, 304: [7] George I. et ál. (2010), Application of Metagenomics to Bioremediation. Metagenomics: Theory, Methods and Applications, Norfolk, Caister Academic Press. [8] Wong, D. (2010), Applications of Metagenomics for Industrial Bioproducts. Metagenomics. Theory, Methods and Applications, Norfolk, Caister Academic Press. [9] Charles, T (2010), The Potential for Investigation of Plant-microbe Interactions Using Metagenomics Methods. Metagenomics. Theory, Methods and Applications, Norfolk, Caister Academic Press. [10] Nelson K. E. & White B. A. (2010), Metagenomics and Its Applications to the Study of the Human Microbiome. Metagenomics. Theory, Methods and Applications, Norfolk, Caister Academic Press. Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 23

5 [11] Carney, K. M. & Matson, P. A. (2005), Plant communities, soil microorganisms, and soil carbon cycling: does altering the world belowground matter to ecosystem functioning?, en Ecosystems 8 (8): [12] Maciel B. M. et ál. (2009), Simple DNA extraction protocol for a 16S rdna study of bacterial diversity in tropical landfarm soil used for bioremediation of oil waste, en Genetics and molecular research, 8(1): [13] Peixoto R. S. et ál. (2009), Use of rpo B and 16S rrna genes to analyse bacterial diversity of a tropical soil using PCR and DGGE, en Letters in applied microbiology, 35(4): [14] Post, W. M. & Mann, L. K. (1990) Changes in Soil Organic Carbon and Nitrogen as a Result of Cultivation, en Bouwman, A. F. (ed.), Soils and the Greenhouse Effect, New York, John Wiley & Sons: [15] Murty, D. et ál. (2002) Does forest conversion to agricultural land change soil organic carbon and nitrogen? A review of the literature, en Global Change Biology, 8, [16] Bossio, D. A. & Scow, K. M. (1998), Impact of carbon and flooding on PLFA profiles and substrate utilization patterns of soil microbial communities, en Microbial Ecology, 35: [17] Lauber, C. L. et ál. (2008), Soil properties that structure bacterial and fungal communities across a land-use gradient, en Soil Biology and Biochemistry, 40: [18] Steenwerth, K. L. et ál. (2002), Soil microbial community composition and land use history in cultivated and grassland ecosystems of coastal California, en Soil Biology & Biochemistry, 34: [19] Torsvik, V.; Øvreås, L. & Thingstad, T. F. (2002), Prokaryotic Diversity-Magnitude, Dynamics, and Controlling Factors, en Science, 296 (5570): REseña de las autoras Silvia Restrepo Restrepo Bióloga, M.Sc., PhD. Profesora asociada Directora del Departamento de Ciencias Biológicas Directora del Laboratorio de Micología y Fitopatología, LAMFU Universidad de los Andes Adriana González Microbióloga, M.Sc., PhD. Investigadora - Área de Biología Molecular Laboratorio Nacional de Diagnóstico Fitosanitario Instituto Colombiano Agropecuario, ICA Martha Cárdenas Microbióloga, M.Sc., PhD. Profesora de cátedra Departamento de Ciencias Biológicas Universidad de los Andes Juan Sebastián Ramírez Leal 24 Hipótesis, Apuntes científicos uniandinos, núm. 12, febrero del 2012