2001 < :8"I%;(

Transcripción

1 ! "#$ $%&"'(

2

3 ))!

4 - ' (()* /0 1 / /, C) /,C)- 5+,.0- + *+, -+./0123 "#$% %( '-9 $) "';1A2+ ' (()*+, '(()* D4 5)" / %E ( < + %2A(512F5G %%76**(672FH* @%513(+ &++"- ;@ 8 9 5*2%*2. ( :8"I%;( + $%3( 89!8I %522. ( :8;'- <= %22. (+ >?:@" %& )6A*B6A7%5A*226( "; %;@( 9 <)#+"+,' (()* #./.=

5 './ : 8 2 ; J B 8%22B5222 ( B 8K %5H*?( <=999=&< 4 &<=99 " %5?( === 4 =4 =4

6 *L 8;*L < ) +.>#%&%? 2@ A>

7 .>#%&% )AB(

8 .>#%&%9" 4=4 A20A B=3JJ B< B.0%.;( M J

9 .>#%&%1 /5D 5+8 *+4 1+ AC 8 5+5D.%GG( 5+*!)3-5+1D8 5+=8

10 .>#%&%, >C - 5+5D 94! 8 %?( 5+*!G3G8 ' '. A B5222 '' 2 B5222 B*2 44 B*2 4 B < ' B*2 44 B*2 4 B < '0N

11 .>#%&%, >C - 5+1D8 B4 %* ( B =322B622 B B #4 4 EFG 5+= 9C 4 3 >C - : HCI 7 >C - 5 * 5+*O * *+O O 57 H+7O

12 .>#%&%, ) 5+8 *+4 1+ AC 44 *+5&J + P + *+*- *+1"J *+8

13 .>#%&%, ) *+5.9 D DG 4 B E *+* B5< BS52 7 B %( QR B? ; 0522 *+1"J Q"J T 4 ' B? ; 0522

14 .>#%&%, 5+8 * AC * 1+1$

15 .4=4E *HU K%*2? ( 1)22)222K4=4.>#%&%,

16 .>#%&%, V 43 %=4( %44( = = T0-

17 .>#%&%,!#< KJ- 4=4 %*22-W ( 4- -X E K = <-K =

18 ? *

19 A>(#1 /5D 5+!- 8 *+-,! "C 1+!#=< ;=4 8<) -) < ;=4 8<) +!#=<

20 A> :2

21 A> 1 /5D H C2A > ( 5+8 *+4-J +8 1+

22

23 4.>#%&% - J - 4 *2B22 Y5 22B722. J S52? 2@ - < - 12BA Y522 S52 J B6- A> - J B B22 2B522 J B6-

24 4

25 4 5L *L

26 (6 " J%KH02 I

27 ' *(( 1*1*Z&P*22H ) Z ") [! ) [ Z--) [ \ 8 8) [ Z 8-) [ : :) [ 4 4) [ <E E) [ 4'- -) )' '' ' ) )E9 E9' ) )\ '#) )' ) )!E!E ) ) ) )- E) < ) )0> ) )Z 0) ).!J)!J) ) ) ) )\< )- -\ \) )I0 \) )\ \) )P<80 80) )< 8) )4 8J) ).) 4E.E.E).E ).E.0.0 )< )<. -)- ); 4E) )= = 4 4 ) ). 4 ) )Z- Z-- -) ) ) ) )Z ) ) =-) )\< =<).E ).E= =) )Z ) )Z- Z-> >) )K>) P) ] ])4 )4] ] ) )!E!E] ] ) )Z Z\ ) =+ ) 5: (2 5* 4 ) 9 2 #$% %??KKK+ + 4(>A)L)+)! *1)*2524')<- << -B <)- 52 <.=%.=%=.((J - -^- +

28 '

29

30

31

32 ) H!I

33

34

35 M - N ' -! " #

36 $%&$''( )%%*$( '%+,)( El genoma humano contiene alrededor de 3.4 x 10 9 pares de bases y entre y genes.

37 $%-( %.%*$%),'%,'$( )% '%*,',*,)$$*%$( ),'% 7 ( /) /0 )1 /"2 /3*), 0 /*),,$*%/%) /822 ), /0 456 /2

38 ,'$,$( )%! " #$% $% & ' #( ) * ' +! ( (!,''! #- ' '" * '. $/!) 0!) & - *!) '' !

39 ,'$,$( )% 044'!,! !! % $ #.!, 1 1! ' ' '!! )!) )*) 1 - $) 5 - %#1 )))))

40 %+%'( EJEMPLOS PRÁCTICOS DE ESTUDIOS DE ULTRASECUENCIACIÓN: 1. ANÁLISIS DE VARIANTES VIRALES UTILIZANDO UN ENSAYO DE AMPLICONES. 2. SECUENCIACIÓN DE NOVO DE GENOMAS BACTERIANOS UTILIZANDO LAS APLICACIONES Kb PAIRED-END Y SHOT-GUN.

41 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )% 8 9: ;$. 8, ' ' 0 '1!)1 2< ) ;1 ;( $'1 ' ' - )

42 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )%,,,*,',%)%*,$>)%),'$?*%*@,%,'$( )% = < > '!) " ) ", 0 *?@ - 2?@!) * - <) ' * ) %#1 > ') % 2) = = = %A!0 " "! )

43 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )% ( :%*,% 8 5"2 0 <# A )B' )A C 'A A D #8.1(!?@ 2E %;% - &$ ) % * - F "?@)?@ 4,, ', ) B) 0," )

44 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )% 2E 2 $ /,20 $H/,20H $/,20 $G/,20G $I/,20I $3/,203,20,20 J,20 K,20 L,20,20

45 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )% & 7 CB 5D, 2C5D Usuario %#1 # " " )*)E $ % F A $'! #, "5D *5(?@ UCTS %#1

46 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )% D 22<M 2 '<M 2 %?"@ $ ( G =H ; $ &$ )(?@ 4 &$ ) <'<M 2 < /? 2% * /2220 P 0 "Q! H<2 /3<2 NE#K<2B 2 $ 2E $ D 2* O I JCB B K2B B B " )

47 $#,)9'$$%:,*$,)%:$*,'%$'$&,)( ) %),;( %,'$( )% 0 <M 2 * GS FLX 454 TITANIUM

48 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) 8 9: ;$. 8 ' 04*)! ;1 ;( $ L5M5CBF,,?@

49 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /)

50 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /)

51 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /)

52 R( ( % *,%),$>)%'), 7 ;*( 7 %,* G-, 2 1 ( ),0 ), 3 )%?'$&,$>) 1 - #<G2 ),0 ), <

53 %'%$>)%,,-( $'$&,)(, < * $ O* 5<$<F

54 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) *( ( ( '( HIH$,)$,$*%/%)

55 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) /),0 21 / M ISGT<1ISKT<1GST< /0 1 /7 '27 J#I/K#I / 2 = =!( 3 K #K G L5M5CBN = - % B 7 < +! #- # %

56 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) 9- O7BB= # LBBOBB 7BB! = 676 %#1 5! (#1 - & &% ' *!0

57 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) '$?*%*@,%%%,%),%)$'', *),$( 3',?7 $ DI /3 2# U G12 V #* < W

58 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) *( ( ( '( HIH$,)$7 ( /) /),0 / M I /0 I % / 2 = =!( 3 K #K Fragmentación (Nebulización) Generación de extremos romos/a-tails A A Ligación de adaptadores 454 Selección de fragmentos por tamaño Cuantificación y control de calidad final

59 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) '$?*%*@,%7 ( /) # #" # 9 - / ' # 3BBP7B 2B< * L7B *!0

60 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /) / %! O/ 2! <M 2/# E20 1O! < 12X# <21 2E0 O/# % = 2 # 2 46 " = M 0 2 X# $###

61 '$'%.,$>)%%*,%)%),;( %7 ( /) " - $ = &$ 0 4 ' ) % Q %;%?N@ R- Q F 2C&$ 4 1! 2C5) ' %;%23 )?N@ ;8 ;=2C&$ 5)I23 )S2P C %;%,!$ #=R 8 &T! = * %#1 +!,, R#;!?@ '- '!), ' );"?@ &$ 0, )

62 $$#%%)$,$>)%)( :( %%)(,?,%*$,)( $'$&,)( ',,'$,$( )%,$*%/%) ;7 ( /)

63 %'R( ( %%%)$,$>)%%)%%',,-( %'%)(, DNA mitocondrial humano: 16.5 Kb Saccharomyces cerevisiae: 12.5 Mb Human exome: 34 Mb Human genome: 3 Gb Drosophila melanogaster: Mb E. coli O157:H7: 5.44 Mb Caenorhabditis elegans: 100 Mb Sanger Nº de bases

64 %%)$,$>)%%)(,7,)( ( '%( YYYY 63L P6LP6O2MG)CB2B!)$

65 %%)$,$>)%%)(,7,)( ( '%(,-( ) H3G1LHG/LHJK <# ( 206!+2Q 90)2676; 2B)C!+CBF 2C)L! 90)C676; C! 9Q8 = L)BKLB! ; ; K23. ' $ CL)C O)C! ' % $ ;0!U)

66 %%)$,$>)%%)(,7,)( ( '%(,-( 63L P6LP6O2MG)CB2B!)$

67 %%)$,$>)%%)(,7,)( ( '%(,-( ) H3G1JIJ/J3 <# ) H3G1G/GJ+#

68 $)*( $>),'(,**,;%,*,%%%)$,% )$?'%%) =! 2 0 " " ' $!) = '- );" " ) E< " ) 4! ) 4 7 & L B &) 4 2M B)B B B L6&! - C 2 ) 0 > >>>))!) C!G 4 2M B)B B B L6 &!) ' =1! - 676) 6 6 M ) %, 7 &)

69 >( *( %%*,*,7,%*),**,;%,*,%%%)$, 2) ' 4 )=R#; ( G =H ) C) ' ' 0 ) ', ") = R#; 676 ) *%Z $$( %'),%,*$,?@ 5-! &)2BD #LBB5D ; " " % R#;! C3B 5 CMB 2)M C3B 5 CLB 2)P E # '!?@ 5-! )$?'%%) &)C2D #SC7B7BB5D C3B 5 CMB 2)M C3B 5 CLB 2)P )

70 >( )$( ),)'(,**,;%,*,%%%)$, Muestra de interés (DNA genómico) 4) La muestra enriquecida es eluída y amplificada 5) Ultrasecuenciación 454 1) Generación de librerías 2) Hibridación con el array de captura de secuencia 3) Eliminación de los fragmentos no capturados

71 *( ( ( '( %,**,;%,*,%)>'$( 3. Pre-capture amplification 4. Hybridization a) Ensamblaje del array b) Carga del array c) Hibridación: 42º C, h

72 *( ( ( '( %,**,;%,*,%)( '$>) Streptavidin beads Pre-capture amplification Primers biotinilados 3. Hybridization 47 ºC, horas

73

74 [ ( *T '( [ INPUT CONTROL DE CALIDAD 5 µg DNA genómico Para cada librería generada, se requieren 5 reacciones independientes para minimizar potenciales sesgos durante la amplificación. Cada reacción contiene 3 ng de DNA (unas 900 copias del genoma humano). Bioanalyzer RNA Pico 6000 Chip Bionanalyzer DNA 7500 Chip A260/A280: Sample library yield > 3.0g. Negative control yield negligible. Most of the fragments between 350-1,000bp Average fragment length between bp Para cada muestra capturada, son necesarias 10 reacciones independientes para minimizar potenciales sesgos durante la reacción de amplificación. Bionanalyzer DNA 7500 Chip A260/A280: LM-PCR yield > 1.0g No visible primer dimer peak Average fragment length between bp Secuenciación 454

75 DNA genómico Fragmentación del DNA por nebulización ( bp) Selección de fragmentos de DNA del tamaño apropiado (double SPRI method) ( bp) Control de calidad del DNA Generación de extremos romos y 5 -fosforilados Ligación de adaptadores de secuenciación Eliminación de fragmentos de pequeño tamaño (ej. Dímeros de adaptadores) Inmobilización de la librería en bolas magnéticas Relleno de los extremos 3 Aislamiento de la librería de DNA de cadena sencilla Control de calidad de la librería de DNA

76 [ ( *T '( [ INPUT CONTROL DE CALIDAD 5 µg DNA genómico Para cada librería generada, se requieren 5 reacciones independientes para minimizar potenciales sesgos durante la amplificación. Cada reacción contiene 3 ng de DNA (unas 900 copias del genoma humano). Bioanalyzer RNA Pico 6000 Chip Bionanalyzer DNA 7500 Chip A260/A280: Sample library yield > 3.0g. Negative control yield negligible. Most of the fragments between 350-1,000bp Average fragment length between bp Para cada muestra capturada, son necesarias 10 reacciones independientes para minimizar potenciales sesgos durante la reacción de amplificación. Bionanalyzer DNA 7500 Chip A260/A280: LM-PCR yield > 1.0g No visible primer dimer peak Average fragment length between bp Secuenciación 454

77 ( )*( '%,'$,%',,*,%$,)%"* La eficiencia teórica de una qpcr es del 100% y significa que las secuencias diana se doblan en cada ciclo, es decir, que E=2. Sin embargo, la eficiencia real nunca es del 100% y por eso el valor de E debe calcularse empíricamente para cada sonda. Los locus control NSC permiten determinar el enriquecimiento de un pequeño set de locus control estandarizados que se encuentran dentro de un rango de eficiencias de captura conocidas. Estos ensayos permiten hacer una estimación aproximada del enriquecimiento de poblaciones mayores de genes diana sin necesidad de secuenciarlos. Si la qpcr de estos locus control indica una captura correcta, es muy problable que los locus experimentales de interés también hayan sido capturados satisfactoriamente.

78 ( )$%*,$( )%(?*%%',)9'$$%'(,( %',"* Al analizar los datos de la qpcr hay que tener en cuenta los siguientes puntos: 1) La diferencia observada entre los valores de fold enrichment para las dos ensayos NSC demuestran la importancia de incluir varios locus control con el fin de obtener valores que representen con mayor precisión la población de genes diana a capturar. Esta diferencia se debe sobre todo a dos parámetros: diferencias en la eficiencia de captura de cada loci y diferencias en la eficiencia de amplificación entre los dos ensayos de qpcr. Se asume que, en un conjunto de loci dentro de un mismo ensayo, la eficiencia de captura de cada locus y la eficiencia de captura de cada reacción de qpcr individual son cercanas a un valor medio común. Por este motivo, la utilización de más de un locus control da una mejor estimación global. 2) Nimblegen ha diseñado y validado 4 secuencias NSC control, recomendadas como el número mínimo de controles a incluir en un experimento para obtener una representación adecuada de la población de locus a capturar. Pueden utilizarse también ensayos diseñados específicamente para cada captura. 3) El enriquecimiento máximo medio de captura de secuencia dentro de un genoma grande depende del porcentaje del genoma a capturar. Capturas de tamaño más pequeño dentro de un mismo genoma dan lugar a mayores valores de enriquecimiento medio máximo, y a la inversa. 4) Hay que comprobar siempre que no existen dímeros de primers porque la fluorescencia que originan puede llevar a sobreestimar la señal en una muestra dada.

79 >( $%-,*),**,;%,*,%%%)$,,',,*,

80 >( %)%*,*),'$,%( ( *%),,%)>$, Gene Sorter: permite introducir el nombre de un gen y buscar genes similares para generar una lista de genes con un gen por línea. Table Browser: genera un fichero con las localizaciones cromosómicas y las coordenadas de inicio y fin de los exones. También permite generar una página con estas coordenadas, que puede ser importada y manipulada desde otras aplicaciones.

81 %)%( *%*$ Gene name, accesion number

82 %)%( *%*$$

83 %)%( *%*$$$ Guardar como archivo.txt delimitado por tabulaciones

84 ,?'%?*( [ %*$ Archivo.txt 1º

85 ,?'%?*( [ %*$$

86 ,?'%?*( [ %*$$$ Pegado especial Pegar como Texto : Guardar como archivo.txt delimitado por tabulaciones Archivo para enviar al servicio de diseño de arrays de captura de Nimblegen

87 %)( 0 -CGH arrays CGX / CNV / Whole genome / Whole genome-exon focused / Custom -ChIP-chip arrays Whole genome / Promoter / Custom -Arrays de metilación Whole genome / Promoter / Custom -Arrays de expresión génica Whole genome / Promoter / Custom

88 ,,,*,%'$%O( %.%*$%),'%)%$( % '*,%%)$,$+)

89 [ ( *T '( [ *O? %? %.%*$%),'%$) Z,'$;,'%( ''%$( ) *%'7 %T$) %.%*$%),'%*( %$),,,),';$ %Z %)$) %? ( O

90 8 $ ( 0% 15676

91 ( 0

92 ( 0

93 ( 0

94 ")< *225 (

95 4<9+4)*225 (

96 (

97 ( 0% 5$( $$ 9$8 =$ 67651

98 $;1 %

99 $;#0

100 $;#0

101 $;1 > $

102 $;9 #

103 9 $;%

104 9 $;0

105 9 $;0

106 9 $;0

107 9 $;0

108 9 $;0

109 9 $;

110 9 $;

111 9 $;

112 9 $; 'C

113 9 $; 'C

114 1 ;0

115 1 ;/

116 1 ;9 #

117 1 ; %

118 1 ; %

119 1 ; %

120 1 ;%##

121 1 ;$%

122 1 ;%

123 $ % +++

124 8 0

125 4BJ G 0;R $ B K B: K B -?. B.; B'> B< B B 4 B B'8= B')'- +++ B; B: B8' B0- B B' B4 B+++

126 ( C '/ #. / 9.

127 %NV ( 0) New species New subspecies P, A).JB44H>*44() QIR :>9 *,H :J:2IR

128 %NV ( 0) 4

129 . 0 HCV, HBV, HIV virus populations has special characteristics: In an infected patient the population of viruses presents high rates of mutation and replication. It is a complex mixing of different mutants. Goal of the study: Detection and quantification of mutations or combination of mutations that could confer resistance to viral inhibitors in samples from infected patients (HCV, HBV). Special interest in mutations at a low rate (minor variants).

130 V ( W Minor variants often play an important role in the development of resistance to antiviral treatments in patients, even if they are present in a very low percentage in the population. Minor variants may not be detected by classical sequencing methods You obtain hundreds of sequences with much effort and high cost NextGen sequencing allow to detect efficiently variants at a very low rate You obtain thousands of sequences with relatively low cost

131 V ( W 454-Roche GS FLX platform: With longer reads than other platforms ( bp) a wider picture is obtained This is a clear advantage when studying combination of mutations in a same molecule 5 5B:72, 5' ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTAC.AAA.ACC.TAC.GGA.TGG.AAA.TTG.CAC.CTG.TAT.TCC. CAT.CCC.ATC.GTC.CTG.GGC.TTT.CGC.AAA.ATA.CCT.ATG.GGA.GTG.GGC.CTC.AGT. CCG.TTT.CTC.TTG.GCT.CAG.TTT.ACT.AGT.GCC.ATT.TGT.TCA.GTG.GTT.CGT.AGG. GCT.TTC.CCC.CAC.TGT.TTG.GCT.TTC.AGC.TAT.ATG.GAT.GAT.GTG.GTA.TTGGGGGC CAAGTCTGTACAG 3'

132 % Goal: to obtain accurate estimations of proportions of the variants. Critical issue: discriminate errors from real low-rate variants K Two main steps:! B 4- B %(_ B = B; B! Filtering low-quality reads more accurate estimations will be obtained. Statistical model for the remaining error: modelling the errors that still remain in our reads.!

133 1 # K! B 4- B %(_ B = B; B! RawDat a Accuracy 99,90524 St ep1 Accuracy 99,96654 Filtering noise before computing estimations of proportions is a useful approach The statistical model: improves slightly the accuracy It provides a probabilistic score per base! Final Accuracy 99,97068

134 ; )))