La mayor parte de los métodos de BM se basan generalmente en el aislamiento o purificación de ácidos nucleicos. Existe una metodología básica

Transcripción

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2 La mayor parte de los métodos de BM se basan generalmente en el aislamiento o purificación de ácidos nucleicos. Existe una metodología básica (esquematizada en la diapositiva) que es general para todos los tipos de ácidos nucleicos y que en los últimos años se ha visto mejorada en cuanto a la calidad de los resultados, la rapidez de obtención y también la economía. Estos métodos mejorados se analizarán por separado En todos los casos, el proceso parte de un proceso de lisis celular y homogenización sobre el que se aplica un agente caotrópico para permitir la eliminación de proteínas y la mayor parte de los componentes celulares y enriqueciendo la muestra en AN. El tratameinto con nucleasas específicas de AND o ARN permite obtener cada tipo de AN. La solución que contiene el AN se somete a un tratamiento con etanol o isopropanol que produce la precipitación de AN y permite eliminar el resto de componentes no deseados presentes en la muestra. Un proceso posterior de rehidratación del precipitado permite obtener la muestra definitiva. 2

3 En el caso del ADN existen dos tipos de métodos: el método orgánico y el inorgánico. En el método orgánico la lisis se produce en condiciones alcalinas (NaOH y SDS) tras lo cual se acidifica la solución. El sobrenadante tras la centrifugación se somete a la acción de agente caotrópicos (fenol/cloroformo) que eliminan el resto de componentes. Finalmente queda el paso de precipitación y rehidratación. 3

4 En el caso del método inorgánico, la lisis es similar pero la acidificación se lleva a cabo con acetato sódico que produce a su vez la precipitación de las proteínas sin el uso de agentes caotrópicos (muy tóxicos). Los pasos finales son similares al método orgánico. 4

5 Una de las modificaciones más efectivas ha sido la introducción de resinas de unión al ADN en forma de kits que han bajado considerablemente el precio del proceso de extracción pero incrementando la pureza de las muestras y la reproducibilidad. Parte de un proceso de lisis clásico seguido de acidificación. Tras la centrifugación, el sobrenadante se hace pasar una resina de unión a ADN deniminada DEAE (dietilaminoetanol) que lo retiene mientras deja pasar el resto de componentes. Tras un proceso de lavado, el ADN es eluído con una tampón bajo en sal y queda purificado. 5

6 La extracción de ADN de muestras fijadas en parafina provenientes de preparaciones histológicas permiten acceder a muestra antiguas. Para ello se aplica cualquiera de los métodos anteriormente descritos con una preparación previa de las muestras. Si se parte de bloques de parafina se debe llevar a cabo el corte y disección antes de una homogenización del tejido con proteasas como la proteinasa K. También se puede cortar el bloque y desparafinar. En el caso de muestras ya montadas, se debe eliminar la unión cubre-porta después proceder a la desparafinación. 6

7 La purificación de ARNm se basa en la presencia de una cola poli-a en esta molécula. Mediante métodos basados en la afinidad a una cola poli-t se puede purificar el ARNm desde ARN total, lisados celulares u homogenados de tejidos. La cola poli-t se puede unir covalentemente a una resina, columna o esferas de celulosa, acrilamida o agarosa. Tras un lavado para eliminar otros componentes se puede eluir mediante un cambio de ph o una alta concentración salina. Recientemente estos métodos basados en afinidad se han adaptado a sistema magnéticos. La cola poli-t se une covalentemente a una molécula biotina que se incuba con la muestra para unir las moléculas de ARNm. La biotina se captura con una bola magnética unida a estreptoavidina y esta última se hace retiene mediante un imán. Ello permite lavar la muestra para eliminar los componentes no deseados y después purificar el ARNm al destruir la interacción poli-a/poli-t mediante ph. El resto de la estructura producida se retiene mediante el imán. 7

8 Una vez purificados los AN es necesario determinar la cantidad obtenida y su calidad. Uno de los métodos es la electroforesis, que analizaremos posteriormente con más detalle. Esta técnica permite comprobar el tamaño de las moléculas (arriba a la izquierda) asociado a un patrón de bandas conocidas. Permite comprobar la integridad del ARN total (derecha) al detectar los distintos tipos de ARN ribosómicos. También permite la integridad de los plásmido (arriba centro) para conocer si están cortados, superenrrollados o están linearizados. 8

9 Para cuantificar AN, las técnicas más utilizadas son la espectrofotometría y la espectrofluorometría. En el primer caso los AN muestran una absorción a 260 nm debido a los estructuras cíclicas de las bases nitrogenadas. Ello permite la cuantificación de manera muy fiable, siempre que las muestras estén muy purificadas para que no produzcan interacciones. En la siguiente diapositiva se muestran las relaciones de absorbancia de los distintos tipos de AN. La pureza de las muestras se lleva a cabo mediante el cálculo de la relación 260/280. A 280 nm se cuantifican las proteínas asociadas al AN. Parte de las proteínas son de unión a AN y no se pueden eliminar de la muestra. Es más, no se deben eliminar ya que estabilizan la muestra. Sin embargo un exceso de proteínas indica contaminación de la muestra. 9

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11 La determinación de la concentración de AN mediante fluorometría se utiliza cuando la muestra no está suficientemente purificada y se basa en la existencia de fluorocromos de unión a ADN. Estos agentes intercalantes producen fluorescencia cuando se unen al ADN. Uno de ellos es el bromuro de etidio. No se suele utilizar para cuantificar ADN ya que no muestra especificidad total por el ADN (de hecho se usa para visualizar ARN en geles de agarosa). El uso se restringe a la visualización de AN en geles de elecroforesis. El segundo agente intercalante es muy específico de ADN y permite una cuantificación muy precisa. Se usa también para llevar a cabo uno de los métodos aplicados en PCR en tiempo real. 11

12 La electroforesis es una técnica de separación de moléculas que se basa en la carga asociada a dichas moléculas. Requiere de una matriz denominada gel puede tener distinta naturaleza según el tipo de electroforesis. En este gel, con disposición horizontal (izquierda) o vertical (derecha), se establece un campo eléctrico que impulsa las moléculas hacia uno de los polos. En el caso del ADN que posee carga negativa propia, las muestras se disponen en pocillos localizados en el cátodo (-) y migran hacia el ánodo (+). Dado que las moléculas de ADN tienen una misma relación carga/masa (a más nucleótidos, más cargas negativas) todos los fragmentos analizados se moverán con la misma velocidad. Para producir una separación es necesario contar con el efecto del gel. Estas sustancias generan una malla tridimensional que dependiendo de su naturaleza frena de forma diferencial las moléculas de ADN, las más grandes son frenadas más que las pequeñas y producen la separación de las mismas. 12

13 En general, existen dos tipos de equipos de electroforesis, los horizontales y los verticales. Los primeros, denominados también submarinos, constan de dos electrodos dispuestos de forma horizontal separados por una plataforma donde se dispone el gel. Este equipo se usa fundamentalmente con agarosa como gel y sirve para separar ácidos nucleicos. El equipo vertical consta de dos tanques de tampón de electroforesis con sus correspondientes electrodos que están separados físicamente. El campo eléctrico se establece a través del propio gel. Los electrodos se sitúan en la parte superior (cátodo) cerca de los pocillos donde se aplican las muestras mientras que el ánodo se sitúa en la base del segundo tanque. Este equipo utiliza como gel, la acrilamida y sirve para separar proteínas y para ácidos nucleicos cuando se necesita una alta resolución y en algunas aplicaciones especiales. 13

14 La agarosa es un heteropolisacárido obtenido de algas marinas que está compuesto por el disacárido indicado en la diapositiva. La capacidad de retención de los geles de agarosa depende de la concentración de esta molécula y ello permite ajustar el rango de separación del gel de acuerdo a las muestras que se desee separar. 14

15 Los geles de poliacrilamida de obtienen mediante la polimerización de acrilamida y bisacrilamida en presencia de agentes catalíticos como el TEMED o el persulfato amónico o la riboflavina. Estas reacciones se deben producir en ausencia de oxígeno. Al igual que la agarosa la concentración de acrilamida determina el tamaño de poro del gel, y por tanto modifica la movilidad de las proteínas o ácidos nucleicos analizados. 15

16 En resumen: 1. La agarosa forma un retículo tridimensional. 2. En el campo eléctrico, las moléculas de AN son empujadas con la misma fuerza independientemente de su tamaño, pero el gel las retiene de manera diferencial dependiendo de su tamaño; a mayor tamaño, mayor retención. 3. Las moléculas AN se separan 4. Las moléculas de AN se tiñen con una agente intercalante (bromuro de etidio) para su visualización y análisis. 16

17 En una típica electroforesis de AN, se utiliza una calle del gel para cargar un estándar de peso molecular, una mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido y cantidad conocida, que permite determinar el tamaño de las muestras problema y también la cantidad de las mismas. 17

18 La electroforesis es una alternativa a la electroforesis en gel. Se utiliza cuando se necesita una alta resolución ya que diferencia tamaños de 1 base entre fragmentos de ADN. Su uso más importante ha sido la secuenciación de ADN. Para ello se disponen dos tanques (cátodo y ánodo) con tampón de electroforesis sobre los que se establece una campo eléctrico de alto voltaje. La muestra se deposita en un tubo capilar relleno de tampón que une ambos tanques. Las moléculas migran en el capilar dependiendo de su carga y son detectadas mediante diversos tipos de detectores. De fluorescencia cuando se bombardean con un láser si las moléculas están marcadas con un fluorocromo. Se puede usar un detector de fluorescencia con iluminación UV para agentes intercalantes o con un espectrofotómetro ultravioleta cuando no están marcadas. 18

19 Las técnicas de hibridación (blot) comprenden un grupo de metodologías basadas en un reconocimiento específico entre una molécula y una sonda. Este nombre de sonda se suele aplicar cuando es un ácido nucleico de pequeño tamaño que reconoce a otro AN o a una proteína (Southern, Northern and Southwestern blot). En el caso del western blot la sonda proteica suele ser un anticuerpo, aunque se pueden usar lectinas (proteínas de unión a azúcares) y otras proteínas con afinidades específicas. Las técnicas de hibridación, antes de proceder a la incubación de sonda y diana, requieren un paso de transferencia de las moléculas diana desde el gel hacia una membrana. 19

20 Existen dos tipos de técnicas de transferencia, por capilaridad y por electrotransferencia. Mediante capilaridad, el gel se dispone sobre varias capas de papel de filtro sumergido parcialmente en un tampón de transferencia. Sobre el gel se dispone la membrana (nylon) y encima se disponen varias capas de papel de filtro seco. Sobre este se coloca un peso. El tampón de transferencia sube mediante capilaridad por el papel de filtro y arrastra a las moléculas desde el gel al filtro. Se utiliza fundamentalmente para AN. En el caso de la electrotransferencia, el sistema es similar pero debajo del gel se dispone una capa de papel de filtro empapado en tampón que está en contacto con un tanque de tampón con el cátodo sumergido. Sobre la membrana se dispone otro papel de filtro que está en contacto con el ánodo. Al establecerse un campo eléctrico, las moléculas cargadas negativamente migran hacia el ánodo escapando del gel hacia la membrana. En este tipo, se usan membranas de nylon para AN y de nitrocelulosa para proteínas. 20

21 Una vez que la molécula diana se ha transferido, la membrana se incuba con la sonda y el paso final es el revelado. Las técnicas de detección de proteínas (Western Blot) (A) utilizan un anticuerpo primario que reconoce específicamente a la proteína diana. Para amplificar la señal, la membrana se incuba con un anticuerpo secundario que reconoce a la fracción constante del anticuerpo primario. Para visualizar el reconocimiento proteína-anticuerpo primario, el secundario está marcado mediante radiactivamente, con una enzima o con un fluorocromo. Cuando la sonda es un AN, esta suele estar marcada con radioactividad (B1) o con digoxigenina o biotina (B2). Estos compuesto se pueden visualizar con un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con un enzima o con estreptoavidina marcada con una enzima en el caso de la biotina. En la tabla siguiente se pueden analizar los métodos de visualización no radioactivos. 21

22 Estos métodos se dividen en cromogénicos (se deposita una sustancia coloreada en la membrana) o quimioluminicente (se produce una reacción química que emite luz). Ambos se basan en dos tipos den enzimas que se usan para marcar sondas, la HRP o peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina. Dependiendo de los reactivos utilizados, estas enzimas pueden producir depósitos de diferentes colores sobre la membrana o emitir luz que puede ser detectada mediante escáneres o directamente mediante placas fotográficas. La radioactividad se detecta mediante escáneres de radioactividad o placas fotográficas mientras la fluorescencia requiere de escáneres de fluorescencia. 22

23 El panel de la izquierda es un gel de electroforesis teñido con bromuro de etidio. El ADN total ha sido extraído de nueve clones, digerido con una endonucleasa de restricción, y separados de acuerdo al tamaño por electroforesis. El ADN forma calles sin bandas discretas, ya que ninguna secuencia de ADN se encuentra presente en más de una copia. El estándar de peso molecular contiene una serie de fragmentos de ADN de tamaño conocido. Un fragmento de ADN clonado se ha cargado en el carril # 10: el estándar de peso indica un tamaño de alrededor de 400bp y constituye un control positivo. El panel central es un autorradiograma de una Southern Blot del mismo gel. El ADN en el gel se ha transferido a un filtro, el filtro es incubado con una sonda de ADN marcada radiactivamente. Cuando la sonda de ADN encuentra una secuencia homóloga en la membrana, hibrida y se inmoviliza. La membrana se expone a una película de rayos-x y produce una banda oscura en la película. El panel de la derecha es una interpretación de la autorradiografía de Southern Blot: el contenido de la información es la presencia o ausencia de bandas, y sus tamaños. La presencia de una banda que muestra una secuencia de ADN homóloga a la sonda de ADN está presente en los clones 3, 4, y 8, con el mismo tamaño que la sonda, y ausente en los clones 1, 2, 5, y 9. La sonda se pega a sí mismo en # 10, como se esperaba. En la calle # 6, una secuencia homóloga está presente, pero con un sitio de restricción adicional que corta el fragmento en dos fragmentos más pequeños de 300bp y 100bp. Este análisis indica que el gen de interés se ha clonado con éxito en un conjunto particular de 23

24 plásmidos, y que existe una variación genética en el clon # 6. 23

25 El Northern blot es una técnica de hibridación que utiliza ARN como diana y oligonucleótidos marcados como sonda. Se utiliza habitualmente para llevar a cabo estudios de expresión génica, de tipo espacial (expresión de un gen en distintos órganos) o de tipo temporal (a lo largo del tiempo). También permite estudiar la expresión de un gen tras un tratamiento con algún compuesto o comparar la expresión en dos tipos celulares distintos. 24

26 La PCR o reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica que permite obtener amplificar de manera específica una secuencia de ADN obteniendo un gran número de copias partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, también denominado molde. La PCR requiere de forma básica un molde de calidad suficiente, una pareja de cebadores que reconocen secuencias flanqueantes a la secuencia que se desea amplificar y una ADN polimerasa termoestable, que funcione a 70-75ºC y que resista temperaturas de 95ºC. Tras varios ciclos de polimerización la secuencia se amplifica de forma exponencial. 25

27 El proceso de PCR consiste en una serie de 25 a 35 modificaciones de temperatura denominadas ciclos. Cada ciclo contiene 3 pasos a diferentes temperaturas, que se indican en la diapositiva. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de magnesio y los dntp en la reacción, la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar. La PCR utiliza un equipo denominado termociclador, que permite variar la temperatura de una mezcla de reacción de forma rápida. 26

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39 Normalmente, la PCR se analiza mediante una electroforesis en agarosa. Permite visualizar los productos, comprobar la especificidad de la reacción, cuantificar el ADN amplificado y comprobar su tamaño. Además, tras extraerlo con un kit apropiado el ADN amplificado se puede usar en otros procesos. 38

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42 En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea, a la vez. La detección mediante fluorescencia permite medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación. La diferencia entre la PCR normal y la PCR a tiempo real radica en que el termociclador posee un sistema de detección de fluorescencia. En su versión más simple, la reacción de PCR tiene lugar en condiciones similares a la PCR normal, pero en presencia de un agente intercalante denominado Sybr Green. Este compuesto no emite fluorescencia cuando no está asociado al ADN pero si cuando se intercala. La fluorescencia emitida es específica de ADN y proporcional a su concentración. Cuando finaliza el paso de polimerización de cada ciclo, el sistema óptico del termociclador cuantifica la fluorescencia emitida y la representa en tiempo real. A mayor número de moléculas iniciales, antes se detectará la fluorescencia. Para más detalle consulten el artículo adjunto. Uno de los usos más importantes de la PCR a tiempo real es que permite medir la expresión génica (de forma relativa o absoluta) y permite cuantificar ADN. 41

43 Existen otros tipos de fluorocromos utilizados para PCR a tiempo real. En cada caso la fluorescencia se emite de forma distinta y son generalmente más específicos que el Sybr Green. 42

44 Instrument cost should be taken into account: 454, Solexa and ABI is ~40% of HeliScope 454 Life Sciences: FLX Titnium series. Run=10 hours, a cluster of computers is required (only a single processor for the standard FLX). ABI SOLiD 3 ( SystemSequencing/overviewofsolidsystem/index.htm)

45 Una de las técnicas más utilizadas en el diagnóstico molecular de enfermedades de base genética, es la secuenciación. En la actualidad existe una carrera tecnológica para encontrar un método que permita realizar la secuenciación del genoma humano en el menor tiempo posible y el menor coste posible. El futuro se entiende que el principal método de diagnóstico será en la secuenciación del genoma, y evidentemente su análisis. El primer método de secuenciación ADN fue el denominado método químico de Maxam y Gilbert. Este método la secuencia para analizar se sometía acción de diversos reactivos químicos que troceaban las moléculas y mostraban un extremo 3 con un nucleotido terminal distinto (ver tabla). Una vez degradados, los fragmentos se analizaban mediante electroforesis, y de esta forma se podía obtener la secuencia del fragmento original. Este método permitió iniciar el proceso de secuenciación de ADN, pero a una velocidad muy pequeña y un coste elevado. 44

46 Con la llegada de la PCR, apareció un nuevo método basado en el uso de deoxinucleotidos (dntps) marcados con radiactividad. La muestra analizada se sometía a una PCR estándar en la que además de los cuatro dntps habituales se añadía uno de ellos marcado con radiactividad, pero que además producía la finalización de la polimerización. Las cuatro reacciones de PCR, se analizaban mediante una electroforesis en gel de acrilamida, donde se podía deducir la secuencia. 45

47 El método Dideoxy fue mejorado cuando se utilizaron fluorocromos con emisión a distintas longitudes de onda y por tanto distintos colores para marcar los cuatro deoxinucleotidos. Esta forma se podía llevar a cabo análisis con una sola reacción de PCR y se podía detectar la presencia tanto mediante un gel de acrilamida, como utilizando un sistema de electroforesis capilar. 46

48 Esta técnica produce como resultado lo que se denominan un electroferograma, donde cada pico corresponde a una base del ADN. Con esta técnica se han podido obtener la secuenciación de diversos genomas, incluido el humano. 47

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50 Outline of the 454 and polony sequencing process. Both systems first fragment the genomic DNA (Step 1) and then use a process of in vitro cloning followed by amplification. The 454 process is shown on the left and Polony sequencing is shown on the right. In the 454 protocol, the linkers are ligated onto the ends of the DNA (Step 2a). Polony sequencing involves circularization followed by linearization and the addition of linkers to generate two fragments with a spacer between them and linkers at the end (Step 2B). Both processes then attach the in vitro clones to beads and carry out PCR in an emulsion mixture to generate beads with many clonal copies of the target fragments (Step 3a/3b). For the sequencing step, the beads must be immobilized in a single layer to allow imaging in an environment that enables the reaction reagents to be flowed across them. In the case of 454 sequencing, a picotiter plate is used, in which most cells will contain a single bead (Step 4a). The polony method immobilizes the beads in an acrylamide matrix in a dense monolayer (Step 4b). The methods are very similar up until the point of the sequencing reaction; in the case of 454 sequencing, a DNA synthesis reaction from a single sequencing primer is carried out. Bases are flowed across the picotiter plate one at a time and incorporation is detected by the release of light (Step 5a). The polony method uses ligation to anchor primers, which can be annealed in one of four positions. In each cycle, a population of degenerate

51 nonomers, which have been fluorescently labeled, is added to the monolayer, and only complimentary oligos will anneal and ligate to the anchor primer. 49

52 Actualmente existe una gran competencia para desarrollar nuevos métodos de secuenciación, y sería muy complicado y largo explicar los fundamentos de cada uno de ellos. Uno de los más actuales y novedosos es la pirosecuenciación. Este procedimiento se basa en la generación de luz (luminiscencia) cuando los nucleótidos son agregados a una cadena creciente de ADN en un orden establecido (GCTA en el ejemplo). Con este sistema, no hay geles, fluorocromos, o ddntps. La mezcla de pirosecuenciación consiste en una cadena sencilla molde de ADN, un cebador de secuenciación, sulfurilasa y luciferasa, además de dos substratos, adenosina 5 fosfosulfato (APS) y luciferina. Secuencialmente, uno de los cuatro dntps se añade a la reacción. Si es el nucleótido complementario a la base nitrogenada del molde junto al extremo 3 'del cebador, la ADN polimerasa extiende el cebador. Ello libera pirofosfato (PPi) con la formación del enlace fosfodiéster entre el dntp y el molde. PPi se convierte en ATP por la acción de la sulfurilasa en presencia de APS. El ATP se utiliza para generar de luminiscencia mediante la luciferasa que convierte la luciferina en oxyluciferina. El proceso se repite con cada uno de los cuatro nucleótidos que se añaden de forma secuencial a la reacción. La generación de una señal que indica que el nucleótido añadido es correcto. Los resultados de una reacción de pirosecuenciación consisten en picos individuales de luminiscencia asociada con la adición de un nucleótido complementario. Si una secuencia contiene un nucleótido repetido, por ejemplo, GTTAC, los resultados serían los siguientes: pico dg, pico dt (el doble de la altura del pico de dg), pico da y pico dc. 50

53 El sistema se regenera con apirasa, que degrada el dntp residual libre y datp. Como los nucleótidos se agregan al sistema uno a la vez, la secuencia está determinada por cuál de los cuatro nucleótidos genera luz. 50

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