Aplicabilitat clínica dels estudis de resistències del VIH
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- María Aurora Ferreyra Peralta
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1 JORNADAS DE LA SOCIETAT CATALANA DE MALALTIES INFECCIOSES I MICROBIOLOGIA CLÍNICA Aplicabilitat clínica dels estudis de resistències del VIH Lleida, 4 y 5 de Noviembre del 2011 José Luis Blanco Servicio de Enfermedades Infecciosas Hospital Clinic. Barcelona
2 Resistance: General concept Overall of mechanism that a microorganism can develop to evade the action of the drug. Changes in targets not compromising target function but impeding drug linking
3 Key of Adaptation Genetic Evolution Mutation rate (1 mutation/genome/cycle) Recombination (9 events/cycle) HIGH VARIABILITY Generation rate (~ virus/day) Hypermutagenesis (APOBEC3G)
4 Factores relacionados con el virus Resistencias: Naturales Transmitidas Factores relacionados con el huesped y el tratamiento. Problemas de adherencia Farmacocinética/fármacodinámica Falta de potencia Otros??? Replicación Vírica Persistente Desarrollo de Resistencias Farmacológicas Fracaso Terapéutico
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6 Impacto retardado de las resistencias en la progresión clínica Mutaciones de Resistencia Incremento de la Carga Viral Disminución de CD4 Progresión Clínica Tiempo (años)
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9 Life Cycle VIH-1 T20 MVC RT-NRTI AZT ddi 3tC d4t ABA TDF NEV EFV ETV RT-NNRTI RAL SQV FPV ATV LPV TPV DRV
10 Genoma del VIH RT: NRTI / NNRTI PRT: IPs Integrasa: Inh. Integrasa Gp41-120: T-20 Gp 120 : Inh CCR5
11 Métodos Genotípicos. Secuenciación plasma Extracción ac.nucleicos RNA RT-PCR cdna TAATTAGCATCCTGAAAA TTTCACGGACAATGCTAA AACTATAATAGTACAGCT GAAGGAGGCTGTAGAAAT TAATTGTACAAGACCCAA CAACAATACAAGAAAAAG TATACACCTAGGACCAGG GAGATCATTTTATGCAAC AGGAGACATAATAGGGGA TATAAGACAAGCACATTG TAACATCAGTAGAGCAAC ATGGAAAAACACTCTAGA ACAGATAGTTAAAAAATT GAAAGATCAATTTAAGAA TAAAACAATAGTCTTTAA CAATCCTCAGGAGGGGA CCTAGAAATTGTAACGCA CAGTTTTAATTGTGGAGG GGAATTTTTCTA secuenciados STOP Amplicones de DNA STOP STOP STOP electroforesis
12 Nomenclatura de las Mutaciones Codon #184 AAT- CTG. AAC - AUG aa 1 aa 2 aa 183 aa 184 Si suponemos que la base G muta a T: AAT- CTG. AAC - GUG aa 1 aa 2 aa 183 aa 184 Nomenclatura Mutación: M184V AUG = Methionine (M) GUG = Valine (V) Code Amino acids A alanine C cysteine D aspartate E glutamate F phenyalanine G glycine H histidine I isoleucine K lysine L leucine TAATTAGCATCCTGAAAA TTTCACGGACAATGCTAA AACTATAATAGTACAGCT GAAGGAGGCTGTAGAAAT TAATTGTACAAGACCCAA CAACAATACAAGAAAAAG TATACACCTAGGACCAGG GAGATCATTTTATGCAAC AGGAGACATAATAGGGGA TATAAGACAAGCACATTG TAACATCAGTAGAGCAAC Code Amino acids ATGGAAAAUGACACTCTA GAACAGATAGTTAAAAAA TTGAAAGATCAATTTAAG AATAAAACAATAGTCTTTA ACAATCCTCAGGAGGGG ACCTAGAAATTGTAACGC ACAGTTTTAATTGTGGAG GGGAATTTTTCTA M N P Q R S T V W Y methionine asparagine proline glutamine arginine serine threonine valine trytophan tyrosine
13 Nº Identificación Muestra: 4002 Fecha: 1/11/2000 CV: 8000 cp/ml Hospital: HCP Médico Solicitante: Dr Blanco Sistema de Genotipado: PE Biosystems Cepa de Referencia: pnl-4 Fecha del Informe: 12/11/00 Mutaciones para los Inhibidores Nucleósidos de la Retrotranscriptasa: M184V R211K Zidovudina Didanosina Zalcitabina Lamivudina Estavudina Abacavir Adefovir No evidencia de Resistencia Resistencia parcial Resistencia parcial Resistencia No evidencia de Resistencia Resistencia parcial No evidencia de Resistencia Mutaciones para los Inhibidores No Nucleósidos de la Retrotranscriptasa: K103N Nevirapina Delavirdina Efavirenz Resistencia Resistencia Resistencia
14 Cómo sabemos que una mutación confiere resistencia a un fármaco? Primer paso : Forzar la selección PASES IN VITRO 3TC VIH VIH3TCr M184V Segundo paso : Confirmación MUTAGENESIS DIRIGIDA M184V Tercer paso : ensayos clinicos (IIA,B; III y IV)
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17 Métodos Fenotípicos. VIRCO PATIENT Deletion of protease (PR)- reverse transcriptase (RT) gene extraction RT PCR PLASMA total RNA cdna PR/RT GENES (³ CARO 200 µl) (más de 1000 $) D viral genotypes COMPLEJO Viral (tiempo PR/RT gene de elaboración 2-4 Gene semanas) transfer/ isolation POCOS LABORATORIOS (Virco, Virologic, electroporation VIRalliance) HIV genome of lab. virus RESULTADOS NO SUPERIORES A METODOS GENOTIPICOS HIV genome minus PR/RT gene linearized genome Intracellular, IMPORTANTE EN FARMACOS homologous NUEVOS recombination AYUDA EN SECUENCIAS COMPLEJAS CD4+ T- cells (MT4) ANTIVIROGRAM Susceptibility Assay Virus titration Infectious HIV D viral genotypes
18 Indicaciones del test de resistencias IAS-USA [1] DHHS [2] European [3] Primary/acute Recommend Recommend Recommend Postexposure prophylaxis Recommend Chronic, Rx naive Recommend* Recommend Strongly consider* Failure Recommend Recommend Recommend Pregnancy Recommend Recommend Pediatric Recommend *If prevalence of drug resistance in untreated patients 5% (European: 10%); should be considered if the prevalence is unknown or if exposure to someone receiving antiretroviral drugs is likely. Resistance testing should also be considered if the HIV VL suppression achieved with a new antiretroviral regimen is not optimal. 1. Hammer SM, et al. JAMA. 2006;296: DHHS guidelines, May Available at: 3. Vandamme AM, et al. Antivir Ther. 2004;9:
19 Minority viral populations Protease Reverse Transcriptase NL4-3 Leu Met Met Gly Ile Leu Val Met Asp Thr Met Leu Thr 578 Bulk 578PRT1 578PRT2 578PRT3 578PRT8 578PRT9 578PRT10 578PRT11 578PRT12 578PRT13 578PRT14 578PRT16 Leu 578PRT4 nd 578PRT6 Pro 578PRT5 Pro 578PRT7 Ile Ile Ile Val Thr Gln Ala Leu Asn Asp Val Trp Tyr 578PRT15 Ile Ile Ile Val Thr Gln Ala Leu Asn Asp Val Trp Tyr Martinez-Picado et al., J Clin Microbiol. 1999
20 Standard Sanger Sequencing Detects the Most Common Circulating HIV-1 Variants
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