N Antisera to Human Complement Factors (C3c, C4)

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1 N Antisera to Human Complement Factors (C3c, C4) Intended Use In vitro diagnostic reagents for the quantitative determination of complement factors (C3 and C4) in human serum using the BN* Systems. Summary and Explanation (1,2,3) The complement system is an integral part of the antigen-unspecific immune defences. It can be activated via two reaction pathways, the classical pathway which is triggered primarily by cellbound immune complexes, and the alternative pathway which is activated primarily by foreign bodies such as microorganisms. The complement component C3 is a key protein in both reaction pathways whereas C4 belongs to the classical pathway of complement activation. Complement activation is associated with consumption of components C3 and/or C4 so that a reduction in their concentrations can allow diagnostic conclusions to be reached. Diminished serum concentrations of C3 and C4 are observed primarily in active systemic lupus erythematosus (SLE), in forms of membrane proliferative glomerulonephritis and in immune complex diseases (serum sickness). In the case of SLE the serum concentrations of the complement factors reflect the activity of the disease. Diminished C3 values occur in acute glomerulonephritis and in membrane proliferative glomerulonephritis whereas isolated diminished levels of C4 can occur in heredity angioneurotic oedema and in cases of cryoglobulinaema. Both complement components react as acute-phase proteins and may therefore show elevated serum concentrations in patients with inflammatory diseases. Hereditary deficiency states of both complement factors have been reported. Principle of the Method In an immunochemical reaction, the proteins contained in the human serum sample form immune complexes with specific antibodies. These complexes scatter a beam of light passed through the sample. The intensity of the scattered light is proportional to the concentration of the relevant protein in the sample. The result is evaluated by comparison with a standard of known concentration. Reagents Materials provided N Antiserum to Human C3c, Code No. OSAP or N Antiserum to Human C4, Code No. OSAO 1 vial each, containing 5 ml or 2 ml Composition N Antisera are liquid animal sera and are produced by immunization of rabbits with highly purified human complement factors (C3c or C4). Labile components are removed from the antisera by a special procedure. Microbial contamination is essentially excluded by filtration and the addition of sodium azide as a preservative (< 1 g/l). After solid phase immunoadsorption, the purified, specific antisera are specially tested and adjusted for optimal suitability for use on the BN* Systems. The antibody titers (T) are determined by radial immunodiffusion and are printed on the vial labels. The titers indicate the quantity of antigen in mg which will be precipitated in an agarose gel by 1 ml of the corresponding antiserum. Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explosive azides when contacting heavy metals such as copper or lead. Preparation of Reagents The N Antisera are ready-for-use as supplied and require no additional preparation. Storage and Stability Shelf life at +2 to +8 C: see expiration date given on the label; Stability once opened: four weeks if stored at +2 to +8 C securely capped immediately after each use and contamination (e.g., by microorganisms) is precluded; During storage, N Antisera can develop precipitates or turbidity which are not caused by microbial contamination and which do not affect their activity. In such cases, the antiserum should be filtered prior to use. Disposable filters with a pore size of 0.45 µm are suitable for this purpose. Do not freeze. On-board stability: five days at 8 hours each or a comparable period of time (maximum 40 hours); BN* II System: on-board stability may be extended by the use of BN* II Evaporation Stoppers (Code No. OVLE) as given in the Instruction Manual. BN ProSpec System: on-board stability as given in the Instruction Manual; Materials required but not provided BN* System N Protein Standard SL (human), Code No. OQIM N/T Protein Control SL/L, M and H (human), Code Nos. OQIN, OQIO und OQIP N Reaction Buffer, Code No. OUMS N Diluent, Code No. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (optional), Code No. OVLE Other materials and supplies as described in the respective BN* System Instruction Manual. Specimens Suitable samples are human serum, as fresh as possible (stored no more than 8 days at +2 to +8 C) or stored deep-frozen. Repeated freeze-thaw cycles must be avoided. The serum samples must be completely coagulated and, after centrifugation, must not contain any particles or traces of fibrin. Lipemic samples or frozen samples which became turbid after thawing must be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately x g) prior to testing. In the assay of C3, one should note that the antiserum is directed against the C3c fragment of the C3 molecule. Fragmentation of C3 to C3c fragment will have advanced to a varying degree depending on the age of the sample and on the conditions under which it has been stored. For fresh samples the C3 values obtained in the immunonephelometric assay are found to be up to 30 % lower than those obtained for aged samples, depending on the extent to which fragmentation has advanced (4). Fragmentation of C4 to the more stable C4c fragment proceeds far more slowly during storage of the sample than in the case of C3. Here, too, the C4 values obtained in the immunonephelometric assay are found to increase in relation to the period of storage. Procedure Notes 1. Consult your BN* System Instruction Manual for details regarding operation of the instrument. 2. The reagents must not be used beyond the expiry date. 3. Allow reagents and samples to equilibrate to room temperature (+15 to +25 C) before use on the BN* A/BN* 100 System. This equilibration step is not required prior to testing on the BN* II or BN ProSpec System. Assay Protocols for BN* Systems The assay protocols are given in the Instruction Manual and software of the instrument. All steps are performed automatically by the system. Establishment of the Reference Curve Reference curves are constructed by multi-point calibration. Serial dilutions of N Protein Standard SL are automatically prepared by the instrument using N Diluent. OSAO G09 E0540 (416) H 1 Edition June 2001 The reference curves can be used for as long as the accuracy controls, e.g. N/T Protein Control SL/ L, M and H, are reproduced within their respective confidence intervals. If a different lot of antiserum is used, a new reference curve must be recorded. Assay of Specimens Samples are automatically diluted 1:20 with N Diluent and measured. If the readings obtained are outside the measuring range, the assay can be repeated using a higher or lower dilution of the sample. Refer to BN* System s Instruction Manual for information on repeat measurements using other dilutions. Internal Quality Control Assay N/T Protein Controls SL/L, M and H after each establishment of a reference curve, the first opening an antiserum vial as well as with each run of samples. The controls are assayed and evaluated as for patient samples. The assigned values and confidence intervals are listed in the Table of Assigned Values of the respective control. Results The results are evaluated automatically by means of a logit-log function. Limitations of the Procedure Turbidity and particles in the samples may interfere with the determination. Therefore, samples containing particles must be centrifuged prior to testing. Due to technical manufacturing reasons and/or aged samples, the results obtained for control samples and interlaboratory survey samples may differ depending on the assay method used. It may therefore be necessary to assess these results in relation to method-specific target values. Expected Values The following reference intervals apply for serum samples from healthy adults (5): Protein 2.5 th th Percentile g/l C g/l Fresh serum samples can be expected to have lower C3 concentrations. Nevertheless, each laboratory should determine its own reference intervals since values may vary depending on the population studied. Specific Performance Characteristics Sensitivity and Measuring Range The sensitivity of the assay is established by the lower limit of the reference curve and depends therefore upon the concentrations of the proteins in the N Protein Standard SL. Typical measuring ranges are given in the BN* System s Instruction Manual. Specificity N Antisera are specific for the respective protein. Precision The following coefficients of variation (CV) were obtained with N Antisera to Human Complement Factors on the BN* System: Intra-Assay Inter-Assay Protein (n = 20) (n = 10) Mean value CV Mean value CV [g/l] [%] [g/l] [%] C C Method Comparison One hundred (100) serum samples were assayed with N Antisera to Human Complement Factors on the BN* System (y) and radial immunodiffusion (x) (NOR Partigen**). Correlation of the results yielded the following data: Protein Linear Regression Coefficient of Correlation C3 y (BN*) = 0.91 x (RID) g/l 0.96 C4 y (BN*) = 0.65 x (RID) g/l 0.97 In contrast to the assay on the BN* System, in the radial immunodiffusion technique there is no essential difference in the reactivity of the complement components in fresh and stored samples. Consequently, method comparisons using fresh sera in the radial immunodiffusion test show markedly higher values. Note The values cited for specific performance characteristics of the test represent typical results and are not to be regarded as specifications for the N Antiserum to Human C3c or C4. Bibliography 1. Hebert LA, Cosio FG, Neff JC. Diagnostic significance of hypocomplementemia. Kidney Int 1991; 39: West CD. The complement profile in clinical medicine. Inherited and acquired conditions lowering the serum concentrations of complement component and control proteins. Complement Inflamm 1989; 6: Dalmasso AP. Complement in the pathophysiology and diagnosis of human diseases. Crit Rev Clin Lab Sci 1986; 24: Okumura N, Nomura M, Tada T, et al. Effects of sample storage on serum C3 assay by immunonephelometry. Clin Lab Sci 1990; 3: Dati F, Schumann G, Thomas L, et al. Consensus of a group of professional societies and diagnostic companies on guidelines for interim reference ranges for 14 proteins in serum based on the standardization against the IFCC/BCR/CAP Reference Material (CRM 470). International Federation of Clinical Chemistry. Community Bureau of Reference of the Commission of the European Communities. College of American Pathologists. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996; 34: BN ProSpec is a registered trademark of in the USA, Germany and other countries. * BN is a trademark of in the USA. ** Partigen is a registered trademark of in Germany and other countries. USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE U.S.A.

2 N Antisera gegen Human- Komplementfaktoren (C3c, C4) Anwendungsbereich In-vitro-Diagnostica zur quantitativen Bestimmung von Komplementfaktoren (C3 bzw. C4) in Humanserum mit den BN* Systemen. Diagnostische Bedeutung (1,2,3) Das Komplementsystem ist Bestandteil der antigen-unspezifischen Immunabwehr. Es kann über zwei Reaktionswege aktiviert werden, den klassischen Weg, der vor allem durch zellgebundene Immunkomplexe ausgelöst wird, und den alternativen Weg, der vor allem durch Fremdkörper wie Mikroorganismen aktiviert wird. Die Komplementkomponente C3 ist ein Schlüsselprotein beider Reaktionswege, während C4 dem klassischen Aktivierungsweg angehört. Die Komplementaktivierung geht mit einem Verbrauch der Komponenten C3 bzw. C4 einher, so daß aus deren Konzentrationsverminderung diagnostische Rückschlüsse gezogen werden können. Erniedrigte Serumkonzentrationen von C3 und C4 werden vor allem bei aktivem systemischen Lupus Erythematodes (SLE), bei Formen der membranoproliferativen Glomerulonephritis und bei Immunkomplexkrankheiten (Serumkrankheit) beobachtet. Beim SLE gibt die Serumkonzentration der Komplementfaktoren die Krankheitsaktivität wieder. Erniedrigungen von C3 treten bei akuter Glomerulonephritis und bei membranoproliferativer Glomerulonephritis auf, während isolierte Erniedrigungen von C4 beim hereditären angioneurotischen Ödem und bei Kryoglobulinämien vorkommen können. Beide Komplementkomponenten reagieren als Akute-Phase-Proteine und können daher bei entzündlichen Erkrankungen erhöhte Serumkonzentrationen aufweisen. Hereditäre Mangelzustände beider Komplementfaktoren sind beschrieben worden. Prinzip der Methode Die im menschlichen Serum enthaltenen Proteine bilden in einer immunchemischen Reaktion mit spezifischen Antikörpern Immunkomplexe, an denen eingestrahltes Licht gestreut wird. Die Intensität des Streulichts ist abhängig von der Konzentration des jeweiligen Proteins in der Probe. Die Auswertung erfolgt durch Vergleich mit einem Standard bekannter Konzentration. Reagenzien Inhalt der Handelspackung N Antiserum gegen Human-C3c, Bestell-Nr. OSAP oder N Antiserum gegen Human-C4, Bestell-Nr. OSAO je 1 Flasche mit 5 ml oder 2 ml Zusammensetzung Die N Antisera sind flüssige, tierische Sera und werden durch Immunisierung von Kaninchen mit hochgereinigten humanen Komplementfaktoren (C3c bzw. C4) hergestellt. Durch ein besonderes Stabilisierungsverfahren werden labile Bestandteile aus den Antisera entfernt. Mikrobielle Verunreinigungen werden durch Filtration und den Zusatz von Natriumazid (< 1 g/l) als Konservierungsmittel weitgehend ausgeschlossen. Die mittels Festphasenimmunadsorption gereinigten, spezifischen Antisera werden nach besonderer Prüfung so eingestellt, daß eine optimale Eignung für die Verwendung in den BN* Systemen gewährleistet ist. Die Antikörper-Titer (T) werden in der radialen Immundiffusion ermittelt und sind auf den Flaschenetiketten ausgedruckt. Sie geben an, wieviel mg des Antigens von 1 ml des jeweiligen Antiserums in einem Agarosegel präzipitiert werden. Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in-vitro-diagnostischen Anwendung. 2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten: Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden. Vorbereitung der Reagenzien Die N Antisera sind gebrauchsfertig und können ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt werden. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Lagerungsdauer bei +2 bis +8 C: die Haltbarkeit ist auf dem Etikett angegeben; Stabilität nach Öffnen: 4 Wochen, sofern unmittelbar nach Gebrauch wieder dicht verschlossen bei +2 bis +8 C gelagert und eine Kontamination (z. B. durch Mikroorganismen) vermieden wird; N Antisera können bei Lagerung Ausflockungen oder Trübungen zeigen, die nicht durch mikrobielle Kontamination verursacht sind und die die Aktivität in keiner Weise beeinträchtigen. In solchen Fällen sollten die Antisera vor Gebrauch filtriert werden. Dazu eignen sich Einwegfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm. Die Reagenzien dürfen nicht eingefroren werden. Stabilität auf den BN* Systemen: 5 Tage mit jeweils 8 Stunden, oder ein vergleichbarer Zeitraum (maximal 40 Stunden); BN* II System: die erweiterte Stabilität der Reagenzien bei Verwendung von BN* II Evaporation Stoppers (Bestell-Nr. OVLE) ist der Bedienungsanleitung zu entnehmen; BN ProSpec System: die Stabilität der Reagenzien ist der Bedienungsanleitung zu entnehmen. Zusätzlich benötigte Materialien BN* System N Protein-Standard-SL (human), Bestell-Nr. OQIM N/T Protein-Kontrolle SL/L, M und H (human), Bestell-Nr. OQIN, OQIO und OQIP N Reaktionspuffer, Bestell-Nr. OUMS N Diluens, Bestell-Nr. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (wahlweise), Bestell-Nr. OVLE Verbrauchsmaterial und Ausrüstung wie in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Untersuchungsmaterial Zur Messung sollen möglichst frische (max. 8 Tage bei +2 bis +8 C aufbewahrte) oder tiefgefroren gelagerte humane Serumproben eingesetzt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Die Serumproben sollten vollständig geronnen sein und nach Zentrifugation keine Partikel oder Spuren von Fibrin enthalten. Lipämische Proben oder eingefrorene Proben, die nach dem Auftauen trüb sind, müssen vor der Bestimmung durch Zentrifugation (10 min bei ca x g) geklärt werden. Bei der Bestimmung von C3 ist zu berücksichtigen, daß das Antiserum gegen das C3c-Fragment des C3-Moleküls gerichtet ist. Je nach Alterungsgrad und Lagerungsbedingungen des Untersuchungsgutes ist die Fragmentierung von C3 zum C3c-Fragment unterschiedlich weit fortgeschritten. In frischen Proben werden bei der immunnephelometrischen Bestimmung bis zu 30 % niedrigere C3-Werte als in gealterten Proben erhalten, je nachdem wie weit die Fragmentierung fortgeschritten ist (4). Die Fragmentierung von C4 zum stabileren C4c-Fragment verläuft bei Lagerung der Serumproben wesentlich langsamer als die der C3-Komponente. Auch hier ist bei der immunnephelometrischen Bestimmung ein Anstieg der C4-Werte mit zunehmender Lagerungsdauer zu beobachten. Testdurchführung Hinweise 1. Einzelheiten zur Bedienung der BN* Systeme sind der entsprechenden Bedienungsanleitung zu entnehmen. 2. Die Reagenzien dürfen nach dem angegebenen Verfalldatum nicht mehr verwendet werden. 3. Reagenzien und Proben sollen vor der Messung am BN* A/BN* 100 System Raumtemperatur (+15 bis +25 C) erreicht haben. Am BN* II/BN ProSpec System können auch bei +2 bis +8 C gelagerte Reagenzien und Proben direkt zur Bestimmung eingesetzt werden. Assay-Protokolle an den BN* Systemen Die Assay-Protokolle sind in der Bedienungsanleitung sowie der Software des jeweiligen Gerätes enthalten. Alle Schritte werden automatisch vom System durchgeführt. Erstellung der Referenzkurve Referenzkurven werden über eine Mehrpunktkalibrierung aufgenommen. Für die Erstellung werden automatisch Verdünnungsreihen des N Protein-Standard SL mit N Diluens hergestellt. Die Referenzkurven können so lange verwendet werden, wie Richtigkeitskontrollen, z. B. N/T Protein-Kontrolle SL/L, M und H innerhalb der jeweiligen Vertrauensbereiche wiedergefunden werden. Bei Verwendung einer anderen Antiserum-Charge muß eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Messung der Patientenproben Proben werden automatisch 1:20 mit N Diluens verdünnt und gemessen. Bei Meßwerten, die außerhalb des Meßbereichs liegen, kann die Messung aus einer höheren oder niedrigeren Probenverdünnung wiederholt werden. Wiederholungsmessungen aus weiteren Probenverdünnungen sind in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Interne Qualitätskontrolle Die N/T Protein-Kontrollen SL/L, M und H sollten nach jeder Erstellung einer Referenzkuve, nach erstmaligem Öffnen einer Antiserumabfüllung sowie bei jeder Serie von Proben eingesetzt werden. Die Kontrollen werden im Ansatz und bei der Auswertung wie Patientenproben behandelt. Die Sollwerte und Vertrauensbereiche sind der Tabelle der Sollwerte der entsprechenden Kontrolle zu entnehmen. Berechnung der Analysenergeebnise Die Auswertung erfolgt automatisch mittels einer Logit-Log-Funktion. Einschränkungen der Testdurchführung Trübungen und Partikel in den Proben können die Bestimmungen stören. Deshalb sollten Proben, die Partikel enthalten, vor der Bestimmung zentrifugiert werden. Für Kontroll- und Ringversuchsproben können aufgrund der technischen Herstellung bzw. gealterter Proben unterschiedliche Ergebnisse in Abhängigkeit von der verwendeten Bestimmungsmethode resultieren. Es kann daher notwendig sein, die Bewertung dieser Ergebnisse an methodenspezifischen Zielwerten vorzunehmen. Erwartete Werte Für Serumproben gesunder erwachsener Probanden gelten folgende Referenzbereiche (5): Protein 2, ,5. Perzentile In frischen Serumproben sind niedrigere C3-Konzentrationen zu erwarten. Darüber hinaus sollte jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche ermitteln, da diese vielen Einflußgrößen unterliegen, die für jedes untersuchte Kollektiv verschieden sein können. Leistungsmerkmale der Teste Empfindlichkeit und Meßbereich Die Empfindlichkeit der Bestimmung wird durch die untere Grenze der Referenzkurve festgelegt und hängt damit von den Konzentrationen der Proteine im N Protein-Standard SL ab. Typische Meßbereiche sind in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme angegeben. Spezifität Die N Antisera sind spezifisch für das jeweilige Protein. Präzision Mit den N Antisera gegen die Human-Komplementfaktoren wurden am BN* System folgende Variationskoeffizienten (VK) ermittelt: Intra-Assay Inter-Assay Protein (n = 20) (n = 10) Mittelwert VK Mittelwert VK Methodenvergleich Es wurden 100 Serumproben mit den N Antisera gegen die Human-Komplementfaktoren am BN* System (y) gemessen und vergleichend dazu mit der radialen Immundiffusion (x) (NOR-Partigen**) bestimmt. Die Korrelation der Ergebnisse lieferte folgende Daten: Protein Lineare Regression Korrelationskoeffizient Im Gegensatz zur Bestimmung an den BN* Systemen besteht in der radialen Immundiffusion kein wesentlicher Unterschied in der Reaktivität der Komplementkomponenten in frischen und gelagerten Proben. Daher werden bei Methodenvergleichen mit frischen Sera in der radialen Immundiffusion deutlich höhere Werte erhalten. Anmerkung Die angegebenen Werte für die Leistungsmerkmale der Teste stellen typische Ergebnisse dar und sind nicht als Spezifikation für das N Antiserum gegen Human-C3c oder -C4 anzusehen. Literatur Siehe Seite 1. BN ProSpec ist ein eingetragenes Warenzeichen der in den USA, Deutschland und anderen Ländern. * BN ist ein Warenzeichen der in den USA. ** Partigen ist ein eingetragenes Warenzeichen der in Deutschland und anderen Ländern. OSAO G09 E0540 (416) H 2 Ausgabe Juni 2001

3 N Antisérums anti-fractions du complément humain (C3c, C4) Domaine d utilisation Réactifs pour le dosage des fractions du complément (C3 et C4) dans le sérum humain à l aide des systèmes BN*. Intérêt diagnostique (1,2,3) Le système du complément est une composante du système de défense immunitaire non spécifique d un antigène. Il peut être activé par deux voies réactionnelles, la voie classique, essentiellement déclenchée par des immuncomplexes liés aux cellules, et la voie alterne, surtout activée par des corps étrangers tels les microorganismes. La fraction C3 du complément est une protéine-clé des deux voies réactionnelles, alors que le C4 n appartient qu à la voie classique. L activation du complément s accompagne d une consommation des fractions C3 et C4, de sorte que la diminution de leur concentration permet de tirer des conclusions sur le plan diagnostique. On observe des concentrations sériques diminuées de C3 et de C4 surtout dans le lupus érythémateux disséminé actif (LED), dans les différentes formes de glomérulonéphrite membrano-proliférative, et dans les affections dues aux immuncomplexes (maladie sérique). En cas de LED, la concentration sérique des fractions du complément reflète l activité de la maladie. Des diminutions de C3 sont observées dans les glomérulonéphrites aiguës et membrano-prolifératives, alors qu une diminution isolée de C4 peut apparaître en cas d oedème angioneurotique héréditaire ou de cryoglobulinémie. Les deux fractions du complément réagissent comme des protéines de la phase aiguë, et peuvent donc être augmentées dans les maladies inflammatoires. Des cas de déficit héréditaire des deux fractions du complément ont été décrits. Principe de la méthode Dans une réaction immunochimique, les protéines contenues dans le sérum humain forment avec les anticorps spécifiques des complexes immuns sur lesquels est envoyée une lumière. L intensité de la lumière dispersée est fonction de la concentration dans l échantillon de la protéine recherchée. L exploitation se fait par rapport à un standard de concentration connue. Réactifs Contenu du coffret Flacon de 1 x 5 ml ou 1 x 2 ml : N Antisérum anti-c3c humain, code OSAP ou N Antisérum anti-c4 humain, code OSAO Composition Les N Antisérums sont des sérums liquides, d origine animale, obtenus par immunisation de lapins avec des fractions du complément humain (C3c ou C4) hautement purifiées. Un procédé spécial de stabilisation permet d'éliminer les éléments labiles des antisérums. Une filtration ainsi que l addition d azide de sodium (< 1 g/l) comme conservateur excluent pratiquement toute contamination microbienne. Les antisérums spécifiques, purifiés par immunoadsorption en phase solide, sont préparés de façon à garantir des propriétés optimales pour leur utilisation sur les systèmes BN*. Le titre d'anticorps (T), déterminé par immunodiffusion radiale, est imprimé sur l'étiquette du flacon. Il indique le nombre de mg d'antigène précipités par 1 ml d'antisérum dans un gel d'agarose. Mises en garde et précautions d'emploi 1. A n utiliser que pour un usage in vitro. 2. Les réactifs contenant de l azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : Ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses! L azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. Préparation des réactifs Les N Antisérums sont prêts à l emploi et peuvent être utilisés sans aucun prétraitement. Stabilités et conditions de conservation Conservation à +2/+8 C : La date de péremption est indiquée sur l étiquette. Stabilité après ouverture : 4 semaines, à condition de bien refermer les flacons immédiatement après emploi, de les replacer à +2/+8 C, et d éviter toute contamination (par ex. microbienne). Les N Antisérums peuvent devenir troubles ou présenter une floculation, phénomènes qui n indiquent pas une contamination microbienne et qui n influencent en aucune façon leur activité. Dans ces cas-là, les filtrer à l aide d un filtre à usage unique à pores de 0,45 µm de diamètre. Ne pas les congeler. Stabilité sur les systèmes BN* : 5 jours à raison de 8 heures par jour, ou durée équivalente (maximum 40 heures). BN* II : l utilisation de bouchons anti-évaporation (code OVLE) permet d allonger la stabilité des réactifs ; se reporter au manuel d utilisation du système. BN ProSpec : pour la stabilité des réactifs, se reporter au manuel d utilisation du système. Autres réactifs et matériel nécessaires Système BN* N Standard Protéines SL (humain), code OQIM N/T Contrôle Protéines SL/L (humain),m,h, codes OQIN, OQIO et OQIP N Tampon de réaction, code OUMS N Diluant, code OUMT Bouchons anti-évaporation pour BN* II, code OVLE (utilisation facultative) Consommables et matériels complémentaires nécessaires selon les manuels d utilisation des systèmes BN*. Echantillons à tester Utiliser de préférence des échantillons sériques humains frais (conservés 8 jours maximum à +2 à +8 C), sinon congelés (une seule fois). Ne les échantillons congeler qu'une seule fois. Les échantillons sériques doivent être totalement coagulés et ne plus contenir aucune particule ni trace de fibrine après centrifugation. Les sérums fortement lipémiques ou devenus troubles après décongélation doivent être clarifiés par centrifugation (10 min à env g) Pour le dosage du C3, il faut tenir compte du fait que l antisérum anti-fraction C3c est dirigé contre la molécule C3. Selon le temps et les conditions de conservation de l échantillon, la fragmentation du C3 en C3c est plus ou moins avancée. Avec un échantillon frais, on obtient en immunonéphélémétrie, selon l état d avancement de la fragmentation, des valeurs de C3 jusqu à 30 % inférieures à celles obtenues sur un échantillon vieilli (4). La fragmentation du C4 en fraction C4c stable au cours de la conservation d un sérum de patient est nettement plus lente que celle du C3. Là aussi, on observe en immunonéphélémétrie des valeurs de C4 qui augmentent avec la durée de conservation de l échantillon. Réalisation du test Remarques : 1. Pour plus de détails concernant l utilisation des systèmes BN*, se reporter au manuel d utilisation de l appareil. 2. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption. 3. Porter réactifs et échantillons à la température ambiante (+15/+25 C) avant leur analyse sur le système BN* A ou BN* 100. Sur le système BN* II ou BN ProSpec, ils peuvent être testés directement à +2/+8 C. Protocoles du test sur les systèmes BN* : Les protocoles sont indiqués dans le manuel d utilisation et la dernière version du logiciel de chaque appareil. Toutes les étapes sont effectuées automatiquement par le système. Etablissement de la courbe d étalonnage : La courbe d'étalonnage est effectuée selon un étalonnage en plusieurs points. La série de dilutions du N Standard protéines SL est établie automatiquement avec le N Diluant. Les courbes d'étalonnage peuvent être utilisées tant que les contrôles d'exactitude, par ex. le N/T Contrôle Protéines SL/L, M et H, a été trouvés à l'intérieur de leur domaine de confiance. Refaire une nouvelle courbe d étalonnage à chaque changement de lot de l antisérum. Mesure des échantillons de patients : Les échantillons de patients sont dilués automatiquement au 1/20 avec le N Diluant, puis mesurés. Si des valeurs sortent du domaine de mesure, les échantillons peuvent être retestés à une dilution plus basse ou plus élevée. Le protocole pour retester les échantillons à une dilution différente est décrit dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Contrôle de qualité interne Tester les N/T Contrôles Protéines SL/M, M et H à chaque changement de courbe d étalonnage ou de flacon d antisérum, ainsi qu à chaque nouvelle série d échantillons. Traiter les contrôles comme des échantillons de patients, aussi bien dans le test que pour l exploitation des résultats. Les valeurs théoriques ainsi que les domaines de confiance sont indiqués dans le tableau des valeurs théoriques de chaque contrôle. Calcul des résultats d analyse L exploitation des résultats est effectuée automatiquement à l aide d une fonction log-logit. Limites du test Les échantillons troubles ou contenant des particules peuvent perturber le test. Dans ce cas, les centrifuger avant le test. Les échantillons testés dans le cadre d'un contrôle national ou d'une étude multicentrique peuvent donner des résultats différents selon la méthode de dosage utilisée. Il peut donc être nécessaire de procéder à l'exploitation des résultats selon les valeurs-cibles spécifiques à la méthode utilisée. Valeurs normales Les valeurs de référence suivantes ont été obtenues pour des échantillons sériques de sujets adultes sains (5) : Protéine 2,5ème - 97,5ème percentiles il faut s'attendre à des concentrations de C3 plus basses sur des échantillons sériques frais Il est toutefois recommandé à chaque laboratoire d établir ses propres valeurs de référence, dans la mesure où les domaines de référence sont soumis à de nombreux facteurs d influence qui peuvent varier selon le collectif étudié. Caractéristiques des tests Domaine de mesure et sensibilité La sensibilité du dosage est déterminée par la limite inférieure de la courbe d étalonnage, et dépend donc de la concentration en protéines du N Standard protéines SL. Les domaines de mesure types sont indiqués dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Spécificité Les N Antisérums sont spécifiques de la protéine indiquée. Précision Les N Antisérums anti-fractions du complément humain ont donné les coefficients de variation (CV) suivants sur le système BN*: Intra-essai Inter-essai protéine (n = 20) (n = 10) valeur moyenne CV valeur moyenne CV Comparaison avec une autre méthode 100 échantillons sériques ont été testés en parallèle, d une part sur le système BN* avec les N Antisérums anti-fractions du complément humain (y), et d autre part selon une méthode d immunodiffusion radiale (NOR-Partigen**) (x). La corrélation des résultats a donné les valeurs suivantes : Protéine régression linéare coefficient de corrélation Contrairement aux dosages effectués sur les systèmes BN*, il n existe pas en immunodiffusion radiale de différence significative entre la réactivité des fractions du complément d un échantillon frais et celle d un échantillon conservé. Aussi les études comparatives effectuées sur sérums frais donnent-elles des valeurs nettement plus élevées en immunodiffusion radiale. Remarque : Les valeurs indiquées comme caractéristiques du test représentent des résultats types, et ne doivent pas être considérées comme des spécifications du N Antisérum anti-c3c ou C4. Littérature Voir page 1. BN ProSpec est une marque déposée de aux USA, en Allemagne et dans d autres pays. * BN est une marque déposée de aux Etats-Unis. ** Partigen est une marque déposée de en Allemagne et dans d autres pays. OSAO G09 E0540 (416) H 3 Edition Juin 2001

4 N Antisiero anti fattori del complemento umano (C3c, C4) Settori d impiego Per uso diagnostico in-vitro nella determinazione quantitativa dei fattori del complemento (C3 e C4) nel siero umano con i sistemi BN*. Significato diagnostico (1,2,3) Il sistema del complemento è una componente della difesa immunitaria antigene-aspecifica. Può essere attivato attraverso due vie: quella classica, soprattutto per mezzo di immunocomplessi legati alle cellule; e quella alternativa, soprattutto per mezzo di corpi estranei, come microrganismi. La componente C3 del complemento è una proteina chiave per entrambe le vie, mentre la componente C4 appartiene alla via classica di attivazione. L attivazione del complemento è proporzionale al consumo delle componenti C3 e/o C4, tanto è vero che dalla diminuzione delle loro concentrazioni si possono trarre delle conclusioni diagnostiche. Diminuite concentrazioni di C3 e C4 nel siero si osservano soprattutto in presenza di Lupus eritematoso sistemico in fase attiva (LES), in presenza di forme di glomerulonefrite membranoproliferativa e di affezioni del sistema immunitario (malattia da siero). Nel caso di LES la concentrazione sierica dei fattori del complemento è indice dell attività della malattia. Diminuzioni di C3 intervengono nelle glomerulonefriti acute e nelle glomerulonefriti membranoproliferative, mentre riduzioni isolate di C4 si verificano nell edema angioneurotico ereditario o nelle crioglobulinemie. Entrambe le componenti del complemento reagiscono come proteine della fase acuta e quindi la loro concentrazione nel siero può aumentare nel corso di malattie infettive. Sono stati descritti decifit ereditari di entrambi questi fattori del complemento. Principio del metodo Le proteine presenti nel siero umano formano in una reazione immunochimica con gli anticorpi specifici degli immunocomplessi, che provocano una dispersione della luce incidente. L intensità della luce dispersa dipende dalla concentrazione della corrispondente proteina nel campione. La valutazione quantitativa avviene per confronto con uno standard a concentrazione nota. Reagenti Contenuto della confezione N Antisiero anti C3c umano, codice SAP o N Antisiero anti C4 umano, codice SAO 1 flacone da 5 ml o da 2 ml Composizione Gli N antisieri sono sieri liquidi di origine animale, prodotti per immunizzazione di conigli con fattori del complemento umano altamente purificati (C3c o C4). Le componenti labili dell antisiero vengono rimosse con un particolare procedimento di stabilizzazione. Le contaminazioni microbiche vengono escluse essenzialmente mediante filtrazione ed aggiunta di sodio azide (< 1 g/l) come conservante. Gli antisieri specifici, purificati tramite immuno-assorbimento vengono trattati in modo tale da assicurare un impiego ottimale con i sistemi BN*. Il titolo (T) viene determinato con l immuno diffusione radiale e si trova stampato sull etichetta dei relativi flaconi. Riporta quanti milligrammi di antigene vengono precipitati da 1 ml di ciascun antisiero in gel di agarosio. Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. 2. Quando si impiegano diagnostici in-vitro contenenti sodio azide, osservare le seguenti precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose. La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi esplosive. Preparazione dei reagenti Gli N antisieri sono pronti per l uso e possono essere impiegati senza alcun pretrattamento. Conservazione e validità Stabilità a +2/+8 C: vedere la data di scadenza sull etichetta Stabilità dopo apertura: 4 settimane, se conservati ben chiusi a+ 2/+ 8 C, evitando contaminazioni (ad es. da microrganismi). Durante la conservazione, gli N Antisieri possono presentare intorbidamenti o flocculazioni che non dipendono da contaminazioni microbiche e che non influenzano in alcun modo l attività. In questo caso è necessario filtrare l antisiero prima dell uso. A questo scopo sono disponibili filtri monouso con pori di 0,45 µm di diametro. Non congelare. Stabilità sui sistemi BN*: 5 giorni per 8 ore al giorno o periodo di tempo equivalente (massimo 40 ore); Sistema BN* II: la stabilità dei reagenti può essere aumentata usando gli Evaporation Stoppers per BN* II (cod. VLE), come indicato nel manuale d uso. Sistema BN ProSpec : la stabilità dei reagenti è indicata nel manuale d uso. Altro materiale necessario, ma non fornito Sistema BN* N Standard Proteine SL (umano), codice QIM N/T Controllo Proteine SL/L (umano), M e H, codice QIN, QIO e QIP N Tampone di reazione, codice UMS N Diluente, codice UMT Evaporation Stoppers per BN* II (opzionale), codice VLE Materiale di consumo ed accessori come descritto nei manuali d uso dei sistemi BN*. Campioni in esame Si impiegano come campioni in esame sieri umani possibilmente freschi (conservati per un massimo di 8 giorni a +2 /+ 8 C) oppure conservati congelati. Evitare ripetuti scongelamenti. I campioni di siero devono essere completamente coagulati e dopo essere stati centrifugati non devono contenere particelle o tracce di fibrina in sospensione. I campioni lipemici o i campioni congelati, che dopo scongelamento risultano torbidi, devono essere chiarificati, prima dell analisi, mediante centrifugazione (10 minuti a ca x g). Nella determinazione del C3 occorre tenere presente che l antisiero è indirizzato contro il frammento C3c della molecola C3. A seconda del grado di invecchiamento e delle condizioni di conservazione del materiale da esaminare, la frammentazione da C3 in C3c può progredire in maniera differente. In campioni freschi si sono riscontrati, nella determinazione immunonefelometrica, valori di C3 fino al 30% più bassi rispetto ai campioni conservati e ciò in funzione del progredire nel tempo del processo di frammentazione (4). Durante la conservazione dei campioni la frammentazione del C4 nel frammento C4c più stabile avviene molto più lentamente della C3. Anche in questo caso nella determinazione immunonefelometrica, si osserva un aumento dei valori di C4 in relazione al periodo di conservazione. Esecuzione del test Nota: 1. Per informazioni dettagliate fare riferimento al manuale d uso dei sistemi BN*. 2. Non utilizzare i reagenti oltre la data di scadenza indicata. 3. Prima della determinazione sul sistema BN* A/BN* 100, portare i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (+15/+25 C). Sul sistema BN* II / BN ProSpec i reagenti possono essere analizzati direttamente a +2/+8 C. Schema di esecuzione del test con i sistemi BN* Gli schemi per l esecuzione del test sono riportati nei manuali d uso e nel software dello strumento. Tutte le fasi sono eseguite automaticamente dallo strumento. Allestimento della curva di riferimento: Le curve di riferimento vengono allestite mediante una calibrazione a più punti. Per la sua preparazione vengono realizzate automaticamente diluizioni seriali dell'n Proteine standard SL con N Diluente. Le curve di calibrazione sono valide finchè i controlli di accuratezza, ad es. N/T Controllo per proteine SL/L, M ed H, rimangono entro i rispettivi ambiti fiduciali. Quando si utilizza un nuovo lotto di antisiero si deve allestire una nuova curva di riferimento. Misurazione dei campioni: I campioni di siero di paziente vengono diluiti automaticamente 1:20 con l N Diluente e quindi analizzati. Se le letture ottenute si trovano al di fuori dell ambito di misura, la misura può essere ripetuta usando una diluizione superiore o inferiore del campione. Per informazioni sulla ripetizione della misurazione con altre diluizioni consultare il manuale d uso dei sistemi BN*. Controllo di qualità interno I controlli N/T Siero Proteine SL/L, M e H devono essere analizzati dopo ogni preparazione delle curve di riferimento, dopo aver iniziato un nuovo flacone di antisiero e con ogni serie di campioni. I controlli sono analizzati e valutati allo stesso modo dei campioni. I valori nominali e gli ambiti fiduciali sono indicati nella tabella dei valori nominali del relativo controllo. Calcolo dei risultati La valutazione é eseguita in modo automatico mediante una funzione logit-log. Limitazioni della esecuizione del test I campioni torbidi o contenenti particelle possono interferire con la determinazione. Pertanto i campioni contenenti particelle devono essere centrifugati prima di essere analizzati. Per ragioni tecniche legate alla produzione e/o all invecchiamento dei campioni, i risultati ottenuti con i sieri di controllo e con i sieri per il controllo di qualità inter-laboratori possono differire in funzione del metodo utilizzato. Può quindi rendersi necessario valutare i risultati ottenuti facendo riferimento a valori specifici per i diversi metodi utilizzati. Valori Attesi I seguenti intervalli di riferimento si applicano ai campioni di siero di adulti sani (5): Proteina 2,5-97,5 Percentile 0,9-1,8 g/l C4 0,1-0,4 g/l Campioni freschi di siero dovrebbero presentare concentrazioni minori di C3. Inoltre, ogni laboratorio dovrebbe determinare i propri intervalli di riferimento, poiché i valori possono risultare diversi a seconda della popolazione esaminata. Caratteristiche del test Ambito di misura e sensibilità La sensibilità del test viene determinata dal limite inferiore della curva di riferimento e dipende quindi dalla concentrazione delle proteine nell N Proteine Standard SL. Gli ambiti di misura tipici sono riportati nel manuale d uso dei sistemi BN*. Specificità Gli N antisieri sono specifici per la rispettiva proteina. Precisione Con gli N antisieri anti fattori del complemento umano sono stati determinati, impiegando il sitema BN*, i seguenti coefficienti di variazione: Intra-serie Inter-serie Proteina (n = 20) (n = 10) Valore medio CV Valore medio CV [g/l] [%] [g/l] [%] Confronto tra i metodi Sono stati esaminati 100 campioni di siero con N Antisiero anti fattori del complemento umano sul sistema BN* (y) e con un metodo di immunodiffusione radiale (x) (NOR-Partigen**). La correlazione dei risultati è la seguente: Proteina Regressione lineare Coefficiente di correlazione C3 y (BN*) = 0,91 x (RID) + 0,02 g/l 0,96 C4 y (BN*) = 0,65 x (RID) + 0,02 g/l 0,97 Contrariamente alle determinazioni effettuate con il sistema BN*, con la tecnica della immunodiffusione radiale non esiste nessuna differenza significativa nella reattività delle componenti del complemento tra i campioni freschi e quelli conservati. Nota: I valori indicati come caratteristiche del test rappresentano dei risultati tipici e non devono essere considerati come specifiche per l N Antisiero anti fattori del complemento umano (C3c o C4). Bibliografia Vedi pagina 1. BN ProSpec è un marchio registrato della negli Stati Uniti, Germania e altri paesi. * BN è un marchio registrato della negli Stati Uniti. ** Partigen è un marchio registrato della in Germania e negli altri Paesi. OSAO G09 E0540 (416) H 4 Edizione Giugno 2001

5 N Antisueros contra los factores del complemento humano (C3c, C4) Campos de aplicación Reactivos de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de los factores del complemento (C3 o C4) en sueros humanos usando los sistemas BN*. Significado diagnóstico (1,2,3) El sistema del complemento es una parte de la respuesta inmunitaria inespecífica al antígeno. Este sistema puede ser activado por 2 vías, la vía clásica que es activada principalmente por complejos inmunitarios adheridos a la célula y la vía alternativa la cual es activada especialmente por cuerpos extraños, como microorganismos. El componente C3 del complemento es una proteína clave para las dos vías, mientras que C4 solamente pertenece a la vía clásica. La activación del complemento ocasiona un gasto en los componentes C3 o C4, de tal manera que de una disminución en su concentración se pueden sacar conclusiones diagnósticas. Bajas concentraciones de C3 y C4 en el suero, se observan sobre todo en lupus eritematoso sistémico (LES), en algunas formas de glomerulonefritis membranoproliferativa y en enfermedades por inmunocomplejos (enfermedad del suero). En LES la concentración en el suero de los factores del complemento refleja la actividad de la enfermedad. Disminuciones de C3 se presentan en glomerulonefritis aguda y membranoproliferativa, mientras que aisladas disminuciones de C4 pueden aparecer en edema angioneurótico hereditario y en crioglobulinemias. Los dos componentes del complemento reaccionan como proteínas de fase aguda, por lo cual pueden presentar concentraciones elevadas en el suero en enfermedades infecciosas. Estados de deficiencia hereditaria de estos dos factores del complemento están descritos en la literatura. Principio del método Las proteínas contenidas en el suero humano forman en una reacción inmunoquímica con anticuerpos específicos, inmunocomplejos los cuales pueden dispersar un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada depende de la concentración de la correspondiente proteína en la muestra. La valoración se hace por comparación con un estándar de concentración conocida. Reactivos Contenido del envase comercial N antisuero contra C3c-humano, N de pedido OSAP o N antisuero contra C4-humano, N de pedido, OSAO para cada una 1 frasco con 5 ml o con 2 ml Composición Los N antisueros son sueros animales, líquidos, fabricados mediante la inmunización de conejos con factores del complemento humano (C3c, C4) de alta pureza. Los componentes lábiles de los antisueros se retiran utilizando un proceso especial de estabilización. Las impurezas microbiológicas van a ser excluidas en general por medio de filtración y por la adición de azida de sodio (< 1 g/l) como medio de conservación. Los antisueros espec ficos, purificados mediante inmunoadsorción de fase sólida, después de someterse a pruebas especiales se ajustan de tal forma que se obtenga una óptima capacidad al usando los sistemas BN*. Los títulos de los anticuerpos (T) se obtiene por inmunodifusión radial y vienen dados en la etiqueta del frasco correspondiente. Este valor indica cuantos mg del antígeno por 1 ml del antisuero se pueden precipitar en un gel de agarosa. Advertencias y medidas de seguridad 1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro. 2. En el manejo de diagnósticos in-vitro que contengan azida sódica debe observarse la siguiente regla: No ingerir y evitar contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas explosivas con metales como cobre y plomo. Preparación de reactivos Los N antisueros están listos para ser utilizados y pueden aplicarse sin ningún otro tratamiento preliminar. Estabilidad y almacenaje Tiempo de conservación entre +2 y +8 C: La fecha de vencimiento viene dada en la etiqueta; Estabilidad después de abierto: 4 semanas siempre que los frascos después de ser empleados se mantengan entre +2 y +8 C, perfectamente cerrados y se eviten contaminaciones (por ej., por microorganismos); Los N antisueros pueden presentar durante el almacenamiento floculación o turbidez que no son ocasionadas por contaminación microbiológica y que no influyen de manera alguna en su actividad.en estos casos los antisueros deben ser filtrados, antes de ser usados. Para esto son apropiados filtros desechables con un diámetro de poro de 0,45 µm. No está permitida su congelación. Estabilidad en los sistemas BN*: 5 días 8 horas cada día o un período de tiempo comparable (máximo 40 horas); En el sistema BN* II el aumento de la estabilidad del reactivo, debido al uso del tapón protector de la evaporación (N de pedido, OVLE), viene dado en el manual de operaciones del aparato. La estabilidad de los reactivos en el sistema BN ProSpec se debe tomar del manual de operaciones. Materiales adicionales necesarios Sistema BN* N Proteína-estándar SL (humano), N de pedido OQIM N/T Proteína-controles SL/L (humano), M y H, N de pedido OQIN, OQIO y OQIP N tampón para reacción, N de pedido OUMS N diluyente, N de pedido OUMT Tampón protector de evaporación BN* II (opcional), N de pedido OVLE Otros materiales y equipos como está descrito en el manual de operaciones respectivos de los sistemas BN*. Material a investigar Para las medidas se deben utilizar, en lo posible, muestras de suero humano frescas (conservadas máximo 8 días entre +2 y +8 C) o muestras almacenadas congeladas. Evítese la congelación y decongelación repetida de éstas. Las muestras de suero deben estar completamente coaguladas y no presentar partículas o restos de fibrina después de centrifugadas. Muestras altamente lipémicas o muestras congeladas que presenten turbidez después de la descongelación, deben ser aclaradas por centrifugación (10 min. a aprox x g) antes de ser ensayadas. Para la determinación de C3 hay que tener en cuenta que el antisuero está dirigido contra el fragmento C3c de la molécula de C3, Dependiendo del grado de envejecimiento y de las condiciones de almacenamiento del material a investigar, la fragmentación de C3 a C3c va a estar diferentemente avanzada. En la determinación inmunonefelómetrica de muestras frescas se van a obtener valores de C3 hasta un 30% más bajos que en pruebas envejecidas, dependiendo que tan avanzada esté la fragmentación (4). La fragmentación del C4 en el fragmento más estable C4c, durante el almacenamiento de las muestras de suero, ocurre de una forma más lenta que la de los componentes C3. También aquí se observa que en la determinación inmunonefelométrica hay un aumento del valor de C4 con el aumento del tiempo de almacenamiento. Procedimiento Advertencias: 1. Los detalles sobre el manejo de los sistemas BN* se deben tomar de los correspondientes manuales de operación. 2. Los reactivos no se deben utilizar una vez pasada la fecha de vencimiento. 3. Los reactivos y las muestras tienen que haber alcanzado la temperatura ambiente (entre +15 y +25 C) antes de ser medidos en los sistemas BN* A/BN* 100. En los sistemas BN* II/BN ProSpec los reactivos y las muestras almacenados entre +2 y +8 C se pueden utilizar directamente para la determinación. Protocolos del test en los sistemas BN* Los protocolos de elaboración de los ensayos vienen dados en el manual de operaciones, así como en el software del aparato correspondiente. Todas las etapas son efectuadas automáticamente por el sistema. Preparación de la curva de referencia: Las curvas de referencia se hacen sobre una calibración de varios puntos. Para su elaboración se preparan automáticamente una serie de diluciones del N Proteína-estandar SL con el N diluyente. Las curvas de referencia pueden ser utilizadas tanto tiempo como sea posible, siempre que al determinar de nuevo de los controles de exactitud, por ej. los N/T proteína-controles SL/L, M y H sus valores se encuentren dentro de los rangos de confianza correspondientes. Al utilizar un nuevo lote de antisueros se deben preparar nuevas curvas de referencia. Medida de las muestras de pacientes: Las muestras van a ser automáticamente diluidas 1:20 con N diluyente y medidas. Para valores que se encuentren por fuera del rango de medida, se puede repetir la medida a una dilución de la muestra mayor o menor. La repetición de las medidas a otras diluciones de las muestras viene descrita en el manual de operaciones del sistema BN*. Control de calidad interno Los N/T proteína-controles SL/L,M y H se deben utilizar después de cada elaboración de una curva de referencia, después de abrir un frasco de antisuero por primera vez, así como también, con cada serie de muestras. Los controles deben manejarse en el test y en la evaluación como las muestras de pacientes. Los valores teóricos y los rangos de confianza se deben tomar de la Tabla de valores teóricos correspondiente a cada control. Cálculo de los resultados del análisis La valoración se efectua automáticamente mediante una función log-logit. Limitaciones del Procedimiento La presencia de turbidez y de partículas en las muestras pueden alterar la determinación. Por lo tanto, las muestras que contengan partículas deben ser centrifugadas antes de efectuar la determinación. Para las muestras control y para las muestras empleadas en estudios en diferentes centros, debido a la técnica de fabricación o al envejecimiento de las muestras, se obtienen resultados diferentes dependiendo del método de determinación utilizado. Por esta razón, puede ser necesario efectuar la valoración de estos resultados en relación con los valores objetivo del método correspondiente. Valores esperados Para sueros de sujetos adultos sanos son válidos los siguientes rangos de referencia (5): Proteína 2,5-97,5 Porcentile En muestras de sueros frescas se esperan concentraciones bajas de C3. Cada laboratorio debe además determinar sus propios rangos de referencia, ya que estos están sujetos a diferentes factores, los cuales pueden ser diferentes para cada colectividad investigada. Características del test Rango de medida y sensibilidad La sensibilidad de la determinación se fija de acuerdo al límite inferior de la curva de referencia y depende de la concentración de proteínas en el N Proteína estándar SL. Los rangos de medida típicos vienen dados en el manual de operaciones de los sistemas BN*. Especificidad Los N antisueros son específicos para la respectiva proteína. Precisión Los siguientes coeficientes de variación (CV) fueron obtenidos con los N antisueros contra los factores del complemento en el sistema BN*: Intra-assay Inter-assay Proteína (n = 20) (n = 10) promedio CV promedio CV Comparación de métodos Se midieron 100 muestras de sueros con los N Antisueros contra los factores del complemento humano en el sistema BN* (y) y se compararon con la determinación por inmunodifusión radial (x) (NOR-Partigen**). La correlación de los resultados dio los siguientes datos: Proteína Regresión lineal Coeficiente de correlación Contrariamente a la determinación en los sistemas BN*, no existe en la inmunodifusión radial ninguna diferencia marcante en la reactividad de los componentes del complemento en muestras frescas o almacenadas. Por esta razón, al comparar los métodos con sueros frescos se obtiene valores más altos en la inmunodifusión radial. Nota: Los valores dados para las características del test representan valores típicos y no se deben tomar como especificaciones para los N antisueros contra C3c o C4 humanos. Bibliografía Ver página 1. BN ProSpec es una marca registrada de en USA, Alemania y en otros países. * BN es una marca de fábrica de en USA. ** Partigen es una marca registrada de en Alemania y en otros países. OSAO G09 E0540 (416) H 5 Edición Junio 2001

6 N Anti-soros contra factores do complemento humano (C3c, C4) Campos de aplicação Reagentes de diagnóstico in vitro para determinação quantitativa de factores do complemento (C3 e C4) no soro humano com o sistemas BN* Significado diagnóstico (1, 2, 3) O sistema do complemento é parte integrante da defesa imunitária antígeno-inespecífica e pode ser activado por duas vias reaccionais: a via clássica, desencadeada sobretudo por imunocomplexos ligados às células, e pela via alternativa, activada sobretudo por corpos estranhos, tais como os microrganismos. A componente complementar C3 é uma proteína-chave de ambas as vias de reacção, ao passo que a C4 é exclusiva da via clássica. A activação do complemento é acompanhada de um consumo das componentes C3 e C4, de modo que a diminuição das suas concentrações permite tirar conclusões de natureza diagnóstica. Concentrações séricas diminuídas de C3 e C4 observam-se sobretudo no lupo eritematoso sistémicoactivo (LES), em formas de glomerulonefrite membrano-proliferativa e em afecções devidas aos imunocomplexos (doença sérica). No LES, a concentração sérica dos factores do complemento reflecte a actividade da doença. Diminuições de C3 ocorrem nas glomerulonefrites aguda e membrano-proliferativa, enquanto que uma diminuição isolada de C4 pode manifestar-se no edema angioneurótico hereditário e em crioglobulinemias. As duas componentes do complemento reagem como proteínas da fase aguda, podendo por isso apresentar concentrações aumentadas nas doenças inflamatórias. A literatura da especialidade descreve casos de défice hereditário de ambos os factores do complemento. Princípio metodológico As proteínas contidas no soro humano formam imunocomplexos numa reacção imunoquímica com anticorpos específicos que dispersam a luz radiada. A intensidade da luz difusa depende da concentração da respectiva proteína na amostra. A avaliação faz-se comparando com um padrão conhecido da concentração. Reagentes Conteúdo da embalagem N Anti-soro contra C3c humano, código OSAP ou N Anti-soro contra C4 humano, código OSAQ 1 frasco de 5 ml ou 2ml de cada Composição Os N antisoros são soros líquidos de origem animal obtidos por imunização de coelhos com factores do complemento (C3c ou C4) humano altamente purificados. Um procedimento especial de estabilização elimina os componentes lábeis. As impurezas microbianas são eliminadas, de forma considerável, através da filtração e da adição de azida de sódio (< 1 g/l) como conservante. Purificados por imunoadsorção na fase sólida, os anti-soros específicos são sujeitos a um controlo especial e calibrados de forma a garantirem uma utilização óptima nos sistemas BN*. Os títulos de anticorpos (T) são determinados por imunodifusão radial e vêm expressos no rótulo do frasco. Eles indicam quantos mg de aní geno são precipitados em gel de agarose por 1 ml do respectivo anti-soro. Advertências e medidas de precaução 1. Só para uso diagnóstico in vitro. 2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de azida sódica: Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas! Com metais pesados, como cobre ou chumbo, a azida de sódio pode formar azidas explosivas! Preparação dos reagentes Os N Anti-soros estão prontos para o uso e podem ser utilizados sem qualquer tratamento prévio. Estabilidade e conservação Conservação entre +2 e +8 C: A estabilidade está indicada no rótulo; Estabilidade depois de aberto: 4 semanas desde que os frascos, imediatamente após o uso, sejam firmemente fechados e conservados entre +2 bis +8 C para evitar a contaminação (p. ex., através de microorganismos); Em caso de armazenagem, os N antisoros podem apresentar floculações ou turvações que não são provocadas por contaminação microbiana e não prejudicam, de nenhum modo, a actividade. Nesses casos, os antisoros deverão ser filtrados antes de serem usados. Para esse efeito, são adequados os filtros descartáveis com um diâmetro de poros de 0,45 µm. Não congelar. Estabilidade nos sistemas BN*: 5 dias com 8 horas ou um período de tempo equivalente (máximo de 40 horas); Sistema BN* II: o aumento da estabilidade dos reagentes em caso de utilização de BN* II Evaporation Stoppers (N.º de pedido OVLE) deverá ser retirada da instruções de serviço; Sistema BN ProSpec : a estabilidade dos reagentes deverá ser retirada das instruções de serviço. Materiais necessários mas não fornecidos Sistema BN* N Proteína Standard SL (humano), código OQIM N/T Controlos de proteína SL/L (humano), M e H, códigos OQIN, OQIO e OQIP N Tampão de reacção, código OUMS N Diluente, código OUMT BN* II Evaporation Stoppers (opcionais), N.º de pedido OVLE Material de consumo e equipamento tal como descrito nas instruções de serviço dos sistemas BN*. Amostras Amostras séricas humanas, tão frescas quanto possível (tempo máximo de conservação: 8 dias entre +2 a 8 C), ou congeladas. Evitar congelar e descongelar repetidamente. As amostras devem estar completamente coaguladas e não apresentar partículas ou vestígios de fibrina após a centrifugação. Amostras lipémicas, ou amostras congeladas que se apresentem turvas quando descongeladas, têm de ser clarificadas por centrifugação (10 min a aprox x g) antes da determinação. Na determinação do C3 é necessário tomar em consideração que o antisoro se dirige contra o fragmento C3c da molécula C3. Consoante a idade e as condições de conservação do material de análise, a fragmentação do C3 em C3c progride diferentemente. Consoante o grau de progressão da fragmentação (4), com amostras frescas obtêm-se na determinação imuno-nefelométrica valores de C3 até 30% inferiores aos obtidos com amostras envelhecidas. A fragmentação de C4 em fragmento C4c estável, em caso de conservação das amostras séricas, decorre de forma substancialmente mais lenta do que a fragmentação dos componentes de C3. Na determinação imuno-nefelométrica, também se observa, aqui, um aumento dos valores de C4, à medida que a duração de conservação aumenta. Procedimento Notas: 1. Os pormenores para a manipulação dos sistemas BN* deverão ser retirados das instruções de serviço respectivas. 2. Os reagentes não deverão ser mais usados após a data de expiração indicada. 3. Antes da medição no sistema BN* A/BN* 100, é necessário que os reagentes e as amostras tenham atingido a temperatura ambiente (+15 a +25 C). Os reagentes e as amostras armazenadas entre +2 bis +8 C podem ser utilizadas directamente no sistema BN* II/BN ProSpec para a determinação. Protocolos de ensaio nos sistemas BN* Os protocolos de ensaio estão contidos nas instruções de serviço e no Software do aparelho respectivo. Todos os passos são executados automaticamente pelo sistema. OSAO G09 E0540 (416) H 6 Edição Junho 2001 Definição da curva de referência: As curvas de referência são obtidas por uma calibração de pontos múltiplos. As séries de diluição do N Proteína Standard SL com o N Diluente são efectuadas automaticamente. As curvas de referências permanecem válidas enquanto os controlos de exactidão, p. ex. N/T Controlos de proteína SL/L, M e H, se encontrarem compreendidos nos respectivos escalões de confiança. Utilizando-se outro lote de anti-soro, é necessário definir uma nova curva. Medição das amostras de paciente: As amostras são automaticamente diluídas a 1:20 com N Diluente e medidas. Se os valores se situarem fora do escalão de medição, esta pode ser repetida a partir de uma diluição maior ou menor. As repetições de medição a partir de outras diluições da amostra estão descritas nas instruções de serviço dos sistemas BN*. Controlo interno de qualidade Os N/T Controlos de proteína SL/L, M e H deverão ser utilizados após a preparação de cada curva de referência, após a primeira abertura de um frasco de antisoro ou em cada série de amostras de paciente. Na preparação e na avaliação do teste, os controlos são tratados como amostras de paciente. Os valores teóricos e os escalões de confiança deverão ser retirados da tabela de valores teóricos dos controlos respectivos. Cálculo dos resultados O resultado é calculado automaticamente mediante uma função logit-log. Limitações do procedimento As turvações e as partículas nas amostras podem perturbar a determinação. Por isso, as amostras que contêm partículas deverão ser centrifugadas antes da determinação. Em amostras de controlo ou de ensaios interlaboratoriais pode acontecer obterem-se resultados divergentes, conforme o método de análise utilizado, em virtude da elaboração técnica ou da idade das amostras. Pode ser, por isso, necessário proceder a uma avaliação destes resultados em função dos valores específicos do método utilizado. Valores esperados Escalões de referência válidos para amostras séricas de adultos sãos (5): Proteína 2, ,5. percentil Em amostras séricas frescas são de esperar concentrações de C3 mais baixas. Além disso, cada laboratório deverá determinar os seus escalões de referência próprios, já que estes dependem de muitos factores que podem variar consoante a população examinada. Características do teste Sensibilidade e Âmbito de medição A sensibilidade da determinação é definida pela curva inferior da curva de referência e depende, assim, da concentração das proteínas no N Protein-Standard SL. Os escalões de medição típicos estão indicados nas instruções de serviço dos sistemas BN*. Especificidade Os N Anti-soros são específicos da respectiva proteína. Precisão Os seguintes coeficientes (CV)de variação foram determinados com os N Anti-soros contra factores do complemento humanos, no sistema BN*, para a determinação sérica: Intra-Assay Inter-Assay Proteína (n = 20) (n = 10) valor médio CV valor médio CV Comparação de métodos No sistema BN* (y), foram medidas 100 amostras séricas com os N antisoros contra factores do complemento humanos e determinadas comparativamente com a imunodifusão radial (x) (NOR- Partigen**). A correlação dos resultados apresenta os seguintes dados: Proteína Regressão linear Coeficiente de correlação Contrariamente à determinação com os sistemas BN*, na imunodifusão radial não existe diferença significativa entre a reactividade dos componentes do complemento nas amostras frescas e nas amostras conservadas. Por isso, na imunodifusão radial, para as comparações de métodos efectuadas com soros frescos, obtêm-se valores claramente mais elevados. Nota Os valores indicados para as características dos testes representam resultados típicos e não devem ser considerados como especificação para o N antisoro contra o C3c ou o C4 humanos. Bibliografia Vide a página 1. BN ProSpec e uma marca registada da nos EUA, na Alemanha e noutros países. * BN é uma marca de fábrica da nos EUA. ** Partigen e uma marca registada da na Alemanha e noutros países. Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles / Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical IVD Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro LOT Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de Lote EXP Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de CCYY-MM-DD vencimiento / termo da validade 8 C Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura 2 C di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE REF Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de Catálogo Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice d'utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as Instruções de Utilização

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