51 Int. CI.: C12P 7/64 ( ) C12N 9/00 ( ) 73 Titular/es: 72 Inventor/es: 74 Agente/Representante:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. CI.: C12P 7/64 ( ) C12N 9/00 ( ) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Fecha de presentación y número de la solicitud internacional: PCT/US2014/ Fecha y número de publicación internacional: WO Fecha de presentación y número de la solicitud europea: E (0) 97 Fecha y número de publicación de la concesión europea: EP Título: Variantes de acetil-coa carboxilasa mejoradas 30 Prioridad: US P US P 4 Fecha de publicación y mención en BOPI de la traducción de la patente: Titular/es: REG LIFE SCIENCES, LLC (100.0%) 600 Gateway Boulevard South San Francisco, CA 94080, US 72 Inventor/es: GREENFIELD, DEREK L.; TRIMBUR, DONALD E.; SCHIRMER, ANDREAS W.; CHANG, CINDY; BEHROUZIAN, BEHNAZ y WINGER, JESSICA 74 Agente/Representante: MILTENYI, Peter ES T3 Aviso:En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín Europeo de Patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre Concesión de Patentes Europeas).

2 E DESCRIPCIÓN Variantes de acetil-coa carboxilasa mejoradas Campo La divulgación se refiere a variantes de acetil-coa carboxilasa (ACC) para la producción de un compuesto derivado de malonil-coa incluyendo un derivado de ácido graso. Se contemplan además células huésped que expresan las variantes de ACC y cultivos celulares relacionados. Todavía se abarcan métodos de producción de compuestos derivados de malonil-coa empleando las células huésped que expresan las variantes de ACC. Antecedentes El petróleo es un recurso natural limitado que se encuentra en la tierra en formas líquida, gaseosa o sólida. Sin embargo, los productos del petróleo se desarrollan con costes considerables, tanto financieros como medioambientales. En su forma natural, el petróleo crudo extraído de la Tierra tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos, por ejemplo, parafinas (o alcanos), olefinas (o alquenos), alquinos, naftenos (o cicloalcanos), compuestos alifáticos, compuestos aromáticos, etc. de longitud y complejidad variables. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etc.). Debido a su alta densidad de energía y su fácil transportabilidad, la mayor parte del petróleo se refina para dar combustibles, tales como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible de aviación, etc.), gasóleo de calefacción, gas licuado de petróleo, etc. Los productos petroquímicos pueden usarse para producir productos químicos especializados, tales como plásticos, resinas, fibras, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes o geles. Los productos químicos especializados tienen muchos usos comerciales. Ejemplos de productos químicos especializados que pueden producirse a partir de materiales de partida petroquímicos incluyen ácidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, hidrocarburos de cadena larga, hidrocarburos de cadena ramificada, hidrocarburos saturados, hidrocarburos insaturados, etc.), alcoholes grasos, ésteres, aldehídos grasos, cetonas, lubricantes, etc. Los ácidos grasos se usan comercialmente como tensioactivos. Los tensioactivos pueden encontrarse, por ejemplo en detergentes y jabones. Los ácidos grasos también pueden usarse como aditivos en combustibles, aceites lubricantes, pinturas, lacas, velas, mantequilla, cosméticos y emulsionantes. Además, los ácidos grasos se usan como activadores aceleradores en productos de caucho. Los ácidos grasos también pueden usarse como materia prima para producir ésteres metílicos, amidas, aminas, cloruros de ácido, anhídridos, dímeros de ceteno, peroxiácidos y ésteres. Los ésteres grasos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiésel, un combustible alternativo, está compuesto de ésteres (por ejemplo, éster metílico de ácidos grasos (FAME), ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE), etc.). Algunos ésteres de bajo peso molecular son volátiles con un olor agradable que los hace útiles como fragancias o agentes saborizantes. Además, se usan ésteres como disolventes para lacas, pinturas y barnices. Además, algunas sustancias que se producen de manera natural, tales como ceras, grasas y aceites están compuestas de ésteres. También se usan ésteres como agentes de ablandamiento en resinas y plásticos, plastificantes, retardadores de la llama y aditivos en gasolina y gasoil. Además, pueden usarse ésteres en la fabricación de polímeros, películas, materiales textiles, colorantes y productos farmacéuticos. De manera similar, los alcoholes grasos tienen numerosos usos comerciales. Por ejemplo, las ventas anuales mundiales de alcoholes grasos y sus derivados superan 1000 millones de dólares estadounidenses. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos domésticos y de cuidado personal, por ejemplo, detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, lociones farmacéuticas, aditivos de aceite lubricante, agentes de acabado y antiestáticos de textiles, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas. La acetil-coa carboxilasa (ACC) desempeña un papel importante en la regulación de la síntesis y degradación de ácidos grasos. Es un complejo enzimático dependiente de biotina que cataliza la primera etapa comprometida de la biosíntesis de ácidos grasos, es decir, la carboxilación irreversible de acetil-coa para dar malonil-coa. ACC produce malonil-coa por medio de sus dos actividades catalíticas, es decir, biotina carboxilasa (BC) y carboxiltransferasa (CT). En la mayoría de los procariotas, ACC es una enzima de múltiples subunidades que incluye cuatro polipéptidos (subunidades), codificados por distintos genes cuya expresión coordinada se controla a través de múltiples niveles de regulación (Cronan et al. (2002) Progress in Lipid Research 41:407-43; James et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 279(4): ). Los cuatro polipéptidos de ACC se ensamblan para dar un complejo a una razón fija (Broussard et al. (2013) Structure 21:60-67). Más específicamente, la reacción de ACC requiere cuatro proteínas, es decir, biotina carboxilasa (BC), proteína transportadora de biotinoílo (o biotina) carboxilo (BCCP), y dos proteínas que forman la carboxiltransferasa (CT). La reacción de ACC global puede someterse a ensayo mediante la conversión dependiente de ATP del NaH 14 CO 3 lábil a ácidos en el ácido malónico estable en ácidos. Hay similitudes y diferencias entre las subunidades de ACC de bacterias y plástidos vegetales. Pero a pesar de la complejidad de las proteínas vegetales, las secuencias que son esenciales para la actividad de ACC no son significativamente 2

3 E diferentes de los homólogos bacterianos (Cronan et al., anteriormente) Se ha notificado que la ACC de E. coli es la menos estable de las enzimas ACC conocidas. La actividad global puede medirse sólo cuando las cuatro subunidades están presentes a altas concentraciones, aunque pueden medirse dos reacciones parciales en disoluciones de proteína diluidas. Se cree que los complejos estables son el complejo BC y el complejo CT alfa 2 beta 2. La BCCP de longitud completa se ha purificado como un dímero y hay pistas de la presencia de un complejo BC 2-BCCP 2 inestable. Otras ACC bacterianas parecen más estables que la de E. coli y la actividad de ACC puede medirse en extractos diluidos de Helicobacter pylori y Pseudomonas citronellolis. Además, las ACC de plástidos vegetales parecen más estables que las ACC de E. coli. Sin embargo, como en E. coli, la purificación adicional de la enzima intacta da como resultado la disociación y pérdida de la actividad de ACC que puede restaurarse mezclando fracciones que contienen las actividades de reacción parciales. Los subcomplejos son BC-BCCP y CT sin evidencias de BCCP intacta libre o CT beta libre, lo que sugiere que BCCP y CT beta se degradan cuando están libres en disolución (Cronan et al., anteriormente). Chapman-Smith et al. (J. Biol. Chem., 1999, vol. 274(3), págs ) describen la mutagénesis C-terminal del dominio de biotina de BCCP de E. coli. Choi-Rhee et al. (J. Biol. Chem., 2003, vol. 278(33), págs ) describen el efecto de deleciones dentro del extremo N-terminal de BCCP sobre la formación del complejo BC-BCCP y notifican que la región N-terminal de BCCP es responsable de la interacción de BCCP con BC. La identificación de los genes de ACC de E. coli incluyendo acca, accb, accc y accd ha facilitado el estudio de las proteínas ACC. Se han usado selecciones suicidas de radiación para aislar mutantes en síntesis de ácidos grasos incluyendo en genes accb y accd que codifican para las subunidades de ACC BCCP y CT beta, respectivamente. El mutante de accb se ha estudiado más extensamente y la mutación G133S es responsable del crecimiento sensible a la temperatura. Esta mutación da como resultado un choque estérico dentro del dominio de biotinoílo. Esta proteína mutante resultante se desnaturaliza fácilmente a temperaturas superiores y es por tanto sensible a proteasas intracelulares. La cepa de BCCP mutante tiene sólo aproximadamente el 2 por ciento del nivel normal de BCCP cuando se hace crecer a 30ºC, aunque las tasas de crecimiento y síntesis de ácidos grasos son normales (Cronan et al., anteriormente). Sin embargo, se sabe que el aumento de la concentración de las cuatro proteínas de ACC puede mejorar el flujo a través de la biosíntesis de ácidos grasos hasta un determinado grado (Davis et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 27(37): ). A la inversa, se ha mostrado que la ACC de E. coli puede inhibirse por derivados acilados de ACP mientras que ACP que carece de un resto acilo no puede inhibir ACC (Davies et al. (2001) Journal of Bacteriology 183(4): ). Hay una necesidad de rutas alternativas para crear tanto combustibles como productos actualmente derivados del petróleo. Como tales, los sistemas microbianos ofrecen el potencial para la producción biológica de numerosos tipos de biocombustibles y productos químicos. Pueden derivarse productos químicos y combustibles renovables de organismos modificados por ingeniería genética (tales como bacterias, levaduras y algas). Pueden alterarse genéticamente rutas de biosíntesis que se producen de manera natural para permitir que los organismos modificados por ingeniería genética sinteticen productos químicos y combustible renovables. Además, pueden adaptarse microbios, o modificarse metabólicamente, para que utilicen diversas fuentes de carbono como materia prima para la producción de productos químicos y combustible. Por tanto, sería deseable modificar por ingeniería genética una ACC para producir niveles superiores de compuestos derivados de malonilo (por ejemplo, ésteres grasos, alcoholes grasos y otros derivados de ácidos grasos así como compuestos distintos de ácidos grasos) cuando se expresan en una célula huésped recombinante. A pesar de los avances en el campo, sigue habiendo la necesidad de mejoras en enzimas modificadas genéticamente, células huésped recombinantes, métodos y sistemas con el fin de lograr una producción robusta y rentable de productos químicos y combustibles a través de la fermentación de células huésped recombinantes. La presente divulgación aborda esta necesidad proporcionando variantes de ACC que aumentan el rendimiento y título de compuestos derivados de malonilo. Sumario 0 60 Un aspecto de la divulgación se refiere a una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos. En un aspecto particular, la divulgación se refiere a una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que comprende al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos, en la que la BCCP variante tiene una secuencia de polipéptido de uno cualquiera o más de los siguientes números de identificación de secuencia incluyendo SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 0, 2, 4, 6, 8, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 y 90. En un aspecto, la BCCP variante confiere a una célula una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la BCCP variante puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una célula, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. El compuesto derivado de malonil-coa incluye, pero no se limita a, un derivado de ácido graso tal como un ácido graso libre, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional (por ejemplo, ω-hidroxiácido graso, ω-hidroxidiol, ω-hidroxi-fame, ω-hidroxi-faee), un derivado de ácido graso insaturado, así como un compuesto no basado en ácidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un 3

4 E policétido y ácido 3-hidroxipropiónico Otro aspecto de la divulgación se refiere a una variante de una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) que tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos, en la que la mutación es en la región de aminoácidos N-terminal. En un aspecto, la mutación es en el aminoácido de la posición 2 de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la BCCP variante confiere a una célula una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En otra realización, la BCCP variante puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una célula, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. Otro aspecto de la divulgación se refiere a una variante de una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) que tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos, en la que la BCCP variante se selecciona de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 0, 2, 4, 6, 8, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 y/o 90. En un aspecto, la BCCP variante confiere a una célula una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la BCCP variante puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una célula, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. Todavía otro aspecto de la divulgación se refiere a una BCCP variante que está codificada por una secuencia genética o de ácido nucleico de accb variante, en la que la secuencia de ácido nucleico se selecciona de SEQ ID NO: 3,, 7, 9, 11, 13, 1, 17, 19, 21, 23, 2, 27, 29, 31, 33, 3, 37, 39, 41, 43, 4, 47, 49, 1, 3,, 7, 9, 61, 63, 6, 67, 69, 71, 73, 7, 77, 79, 81, 83, 8, 87 y/o 89. Otro aspecto de la divulgación se refiere a una célula recombinante o microorganismo recombinante que expresa una BCCP variante, en la que la BCCP variante tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos. En un aspecto, la célula es una célula huésped. En otro aspecto, la célula es una célula microbiana o célula huésped microbiana. En otro aspecto, el microorganismo es una célula microbiana o célula huésped microbiana o un microbio. En un aspecto, la mutación está en la región de aminoácidos N-terminal. En otro aspecto, la mutación está en la posición de aminoácido 2 de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la mutación es una sustitución. En diversos aspectos, la sustitución es aspartato (D) a asparagina (N); o aspartato (D) a histidina (H); o aspartato (D) a isoleucina (I); o aspartato (D) a treonina (T); o aspartato (D) a serina (S); o aspartato (D) a tirosina (Y); o aspartato (D) a arginina (R); o aspartato (D) a leucina (L); o aspartato (D) a glutamina (Q); o aspartato (D) a glutamato (G). En otro aspecto, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 6 que abarca un polipéptido con una mutación que incluye una sustitución de aspartato (D) a asparagina (N). En otro aspecto, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8 que abarca un polipéptido con una mutación que incluye una sustitución de aspartato (D) a histidina (H). En otro aspecto, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 que abarca un polipéptido con una mutación que incluye una sustitución de aspartato (D) a isoleucina (I). En un aspecto, la BCCP variante tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos y confiere a una célula recombinante una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la BCCP variante tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos y puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada a una célula recombinante, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la célula es un microorganismo recombinante o célula huésped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o célula huésped silvestre. En otro aspecto, la célula es de naturaleza microbiana. Aún otro aspecto de la divulgación se refiere a un método de producción de un compuesto derivado de malonil-coa, que incluye cultivar una célula que expresa una BCCP variante en un caldo de fermentación que contiene una fuente de carbono. El compuesto derivado de malonil-coa incluye un derivado de ácido graso, tal como, por ejemplo, un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional (por ejemplo, ω- hidroxiácidos grasos, ω-hidroxidioles, ω-hidroxi-fame, ω-hidroxi-faee), un derivado de ácido graso insaturado, así como un compuesto no basado en ácidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un policétido y ácido 3- hidroxipropiónico. En un aspecto, la célula es un microorganismo recombinante o célula huésped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o célula huésped silvestre, respectivamente. En otro aspecto, la célula es de naturaleza microbiana. La divulgación contempla además un operón variante que controla la expresión de una BCCP. En un aspecto, el operón da como resultado un cambio en la expresión de BCCP en una célula recombinante en comparación con una célula silvestre. En un aspecto, la célula es una célula huésped microbiana recombinante o microorganismo recombinante en comparación con una célula huésped microbiana silvestre o microorganismo silvestre, respectivamente. En otro aspecto, el operón da como resultado un aumento en la expresión de BCCP en una célula recombinante y de ese modo mejora la actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) en la célula recombinante, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En un aspecto, el operón variante incluye además un promotor. El promotor incluye, pero no se limita a, un promotor heterólogo, una variante de promotor heterólogo y un promotor sintético. En un 4

5 E aspecto, el promotor incluye un promotor de accbc modificado genéticamente, un promotor de E. coli que se produce de manera natural o una variante de promotor de E. coli. En otro aspecto, el promotor es una variante de promotor de accbc. En otro aspecto, el promotor es un promotor T o una variante de promotor T. En un aspecto, el promotor es un promotor T de accbc. En otro aspecto, el promotor T de accbc se selecciona de SEQ ID NO: 93, 94, 9 ó 96 o variaciones de las mismas. La divulgación se refiere además a un microorganismo recombinante o célula huésped que abarca un operón variante que controla la expresión de una BCCP. En un aspecto, el operón da como resultado un cambio en la expresión de BCCP. En un aspecto, el operón da como resultado un aumento en la expresión de BCCP en una célula recombinante, y de ese modo mejora la actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) en la célula recombinante, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente. En otro aspecto, el operón variante incluye además un promotor. Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método de producción de un compuesto derivado de malonil-coa, que incluye cultivar un microorganismo o célula huésped que expresa un operón variante en un caldo de fermentación que contiene una fuente de carbono. En un aspecto, la célula es un microorganismo recombinante o célula huésped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o célula huésped silvestre, respectivamente. En otro aspecto, la célula es de naturaleza microbiana. El compuesto derivado de malonil-coa incluye un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional (por ejemplo, ω-hidroxiácidos grasos, ω-hidroxidioles, ω-hidroxi-fame, ω-hidroxi-faee), un derivado de ácido graso insaturado, así como un compuesto no basado en ácidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. Todavía otro aspecto de la divulgación se refiere a un método de producción de un compuesto derivado de malonil- CoA, que incluye cultivar una célula huésped que expresa una BCCP variante y un operón variante en un caldo de fermentación que contiene una fuente de carbono. En un aspecto, la célula es un microorganismo recombinante o célula huésped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o célula huésped silvestre, respectivamente. En otro aspecto, la célula es de naturaleza microbiana. El compuesto derivado de malonil-coa incluye un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional (incluyendo ω-hidroxiácidos grasos, ω-hidroxidioles, ω-hidroxi-fame, ω-hidroxi-faee), un derivado de ácido graso insaturado, así como un compuesto no basado en ácidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. La divulgación contempla además un microorganismo que abarca una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos. La BCCP variante tiene una mutación en una región de aminoácidos N-terminal. La mutación es una sustitución. En diversas realizaciones, la sustitución es aspartato (D) a asparagina (N); o aspartato (D) a histidina (H); o aspartato (D) a isoleucina (I); o aspartato (D) a treonina (T); o aspartato (D) a serina (S); o aspartato (D) a tirosina (Y); o aspartato (D) a arginina (R); o aspartato (D) a leucina (L); o aspartato (D) a glutamina (Q); o aspartato (D) a glutamato (G). En otra realización, la BCCP variante tiene una o más mutaciones, incluyendo sustituciones de aspartato (D) a asparagina (N); aspartato (D) a histidina (H); aspartato (D) a isoleucina (I); aspartato (D) a treonina (T); aspartato (D) a serina (S); aspartato (D) a tirosina (Y); aspartato (D) a arginina (R); aspartato (D) a leucina (L); aspartato (D) a glutamina (Q); y/o aspartato (D) a glutamato (G). En otra realización, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 6 que abarca un polipéptido con una mutación que incluye una sustitución de aspartato (D) a asparagina (N). En otra realización, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8 que abarca un polipéptido con una mutación que incluye una sustitución de aspartato (D) a histidina (H). En otra realización, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 que abarca un polipéptido con una mutación que incluye una sustitución de aspartato (D) a isoleucina (I). En otra realización, la expresión de la BCCP variante confiere una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa al microorganismo. En otra realización, la expresión de la BCCP variante puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada en el microorganismo, dando como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa por el microorganismo. El compuesto derivado de malonil-coa incluye, pero no se limita a, un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional, un derivado de ácido graso insaturado, una flavanona, un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. En una realización, el compuesto derivado de malonil-coa es un FAME o un FAEE. En otra realización, el compuesto derivado de malonil-coa es un alcohol graso. En otra realización, el microorganismo es una célula microbiana. En aún otra realización, la célula microbiana es una célula recombinante. Los ejemplos de células microbianas incluyen, pero no se limitan a, células de los géneros Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia y Streptomyces. En una realización, la célula microbiana es del género Escherichia. En una realización, la célula microbiana es de Escherichia coli. En otra realización, la célula microbiana es de una cianobacteria o el Cyanophyta. En otra realización, la célula microbiana es de una cianobacteria o Cyanophyta incluyendo, pero sin limitarse a, Prochlorococcus, Synechococcus,

6 E Synechocystis, Cyanothece y Nostoc punctiforme. En otra realización, la célula microbiana es de una especie de cianobacteria específica incluyendo, pero sin limitarse a, Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC Otro aspecto de la divulgación se refiere a un microorganismo recombinante que tiene una expresión alterada de una secuencia de ácido nucleico que incluye accb o accc o una combinación de los mismos, dando como resultado una producción alterada de un compuesto derivado de malonil-coa por el microorganismo. En un aspecto, la expresión alterada es expresión aumentada. En otro aspecto, la expresión alterada es expresión disminuida. En aún otro aspecto, la expresión alterada se debe a un cambio en uno o más promotores que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico de accb codifica para BCCP. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico variante de accb codifica para la BCCP variante. En un aspecto, el compuesto derivado de malonil-coa incluye, pero no se limita a, un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional, un derivado de ácido graso insaturado, una flavanona, un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. En un aspecto, el microorganismo incluye, pero no se limita a, microorganismos del género Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En un aspecto, la célula microbiana es del género Escherichia. En un aspecto, la célula microbiana es de Escherichia coli. En otro aspecto, la célula microbiana es de una cianobacteria o el género Cyanophyta. En todavía otro aspecto, el microorganismo es una cianobacteria o Cyanophyta de Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece o Nostoc punctiforme. En un aspecto, el microorganismo es una especie de cianobacteria de Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 o Synechococcus sp. PCC7001. Otro aspecto de la divulgación se refiere a un microorganismo o célula huésped que tiene una expresión alterada de una variante de ACC y expresa además una proteína de biosíntesis de ácidos grasos. En un aspecto, la célula huésped es una célula microbiana. En otro aspecto, la célula huésped es una célula recombinante. En aún otro aspecto, la célula huésped es una célula bacteriana recombinante. En otra realización, la variante de ACC es una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) o una biotina carboxilasa (BC) o una combinación de las mismas. En un aspecto, la expresión alterada es expresión aumentada o disminuida. En un aspecto, la expresión alterada es expresión aumentada, en la que la expresión aumentada da como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa cuando la célula microbiana se cultiva con una fuente de carbono. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, la célula huésped puede expresar además una proteína de biosíntesis que tiene actividad enzimática que puede aumentar la producción de derivados de ácidos grasos. En una realización, la proteína con actividad enzimática puede estar presente de manera nativa en la célula huésped y su gen puede sobreexpresarse por medio de un promotor u otra alteración genética. En otra realización, la proteína con actividad enzimática puede ser el resultado de un gen exógeno o heterólogo que se expresa en la célula huésped. Los ejemplos de tales actividades enzimáticas incluyen, pero no se limitan a, actividad tioesterasa (E.C * o E.C o E.C ), actividad éster sintasa (E.C ), actividad acil-acp reductasa (AAR) (E.C ), actividad alcohol deshidrogenasa (E.C ), actividad alcohol graso acil-coa reductasa (FAR) (E.C *), actividad ácido carboxílico reductasa (CAR) (EC ), actividad descarbonilasa o desformilasa, actividad acil-coa reductasa (E.C ), actividad acil-coa sintasa (FadD) (E.C ), actividad OleA y actividad OleBCD. En todavía otro aspecto, la divulgación se refiere a un microorganismo o célula huésped que tiene una expresión alterada de una variante de ACC y expresa además una proteína de biosíntesis de ácidos grasos, en el que la expresión alterada es expresión aumentada que da como resultado una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa cuando la célula se cultiva con una fuente de carbono. En un aspecto, la célula huésped es una célula microbiana. En otro aspecto, la célula huésped es una célula recombinante. En aún otro aspecto, la célula huésped es una célula bacteriana recombinante. En todavía otro aspecto, el microorganismo o célula huésped es una célula recombinante que puede compararse con o contrastarse con una célula silvestre en las mismas condiciones. En el presente documento el compuesto derivado de malonil-coa incluye, pero no se limita a, un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional, un derivado de ácido graso insaturado, una flavanona, un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. En un aspecto, la célula microbiana se selecciona de células del género Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. Otro aspecto de la divulgación proporciona una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene SEQ ID NO: 6. En una realización, la mutación está en una región de aminoácidos N-terminal con una sustitución de aspartato (D) a asparagina (N), en la que la sustitución está en la posición de aminoácido 2. En otra realización, la BCCP variante está codificada por un gen accb variante, en la que el gen accb variante tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:. Otro aspecto de la divulgación proporciona una proteína portadora de biotina 6

7 E carboxilo (BCCP) variante que tiene SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8. En una realización, la mutación está en una región de aminoácidos N-terminal con una sustitución de aspartato (D) a histidina (H), en la que la sustitución está en la posición de aminoácido 2. En otra realización, la BCCP variante está codificada por un gen accb variante, en la que el gen accb variante tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7, respectivamente. Otro aspecto de la divulgación proporciona una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12. En una realización, la mutación está en una región de aminoácidos N-terminal con una sustitución de aspartato (D) a isoleucina (I), en la que la sustitución está en la posición de aminoácido 2. En otra realización, la BCCP variante está codificada por un gen accb variante, en la que el gen accb variante tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, respectivamente. En diversas realizaciones, las BCCP variantes confieren a una célula recombinante una producción aumentada de un compuesto derivado de malonil-coa en comparación con una célula silvestre correspondiente, en la que dicho compuesto derivado de malonil-coa incluye un derivado de ácido graso de un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional y un derivado de ácido graso insaturado; o un compuesto distinto de ácidos grasos tal como una flavanona, un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. La presente divulgación abarca además microorganismos recombinantes que incluyen o expresan las BCCP variantes. En una realización, los microorganismos se seleccionan de microorganismos del género Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. Se contempla además un método de producción de un compuesto derivado de malonil-coa, que incluye cultivar el microorganismo recombinante que expresa la BCCP variante en un caldo de fermentación que contiene una fuente de carbono. El compuesto derivado de malonilo producido mediante este método incluye un derivado de ácido graso que incluye un ácido graso, un éster metílico de ácidos grasos (FAME), un éster etílico de ácidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiácido graso, un derivado de ácido graso bifuncional y un derivado de ácido graso insaturado; o un compuesto distinto de ácidos grasos tal como una flavanona, un flavonoide, un policétido y ácido 3-hidroxipropiónico. Breve descripción de las figuras La presente divulgación se entiende mejor cuando se lee junto con las figuras adjuntas, que sirven para ilustrar las realizaciones preferidas. Sin embargo, se entiende que la divulgación no se limita a las realizaciones específicas dadas a conocer en las figuras. La figura 1 es un esquema de un aspecto de una ruta bioquímica modificada por ingeniería genética que implica variantes de acetil-coa carboxilasa (ACC) tales como una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante. Tal como se representa, BCCP puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una célula. Esto puede conducir a una producción aumentada de malonil-coa y acil-acp, lo que a su vez puede conducir a una producción aumentada de compuestos derivados de malonil-coa, incluyendo, por ejemplo, derivados de ácidos grasos tales como ésteres grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos, ácidos grasos y otros derivados de ácidos grasos. La figura 2 representa una alineación de siete secuencias de aminoácidos de BCCP de siete especies diferentes. El área en el recuadro muestra un motivo que se conserva a través de la mayoría de las especies de BCCP. La figura 3 es un esquema de otro aspecto de una ruta bioquímica modificada por ingeniería genética que implica variantes de acetil-coa carboxilasa (ACC) tales como una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante. Tal como se representa, BCCP puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una célula. Esto puede conducir a una producción aumentada de malonil-coa y acil-coa, lo que a su vez puede conducir a una producción aumentada de compuestos derivados de malonil-coa, incluyendo, por ejemplo, derivados de ácidos grasos tales como ésteres grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos, ácidos grasos y otros derivados de ácidos grasos. La figura 4 es un resumen de varios aspectos de una ruta bioquímica modificada por ingeniería genética que implica variantes de acetil-coa carboxilasa (ACC) tales como una proteína portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante. Tal como se muestra, BCCP puede conferir actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una célula. Esto puede conducir a una producción aumentada de malonil-coa y compuestos derivados de malonil- CoA, incluyendo policétidos, ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP), flavanonas y flavonoides así como productos intermedios aumentados tales como, por ejemplo, acil-coa aumentada (véase también la figura 3); acil-acp aumentada (véase también la figura 1); así como malonato (o ácido malónico) aumentado. Los productos intermedios aumentados pueden conducir además a productos finales aumentados tales como derivados de ácidos grasos, incluyendo ácidos grasos, ésteres grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos y otros derivados de ácidos grasos. 7

8 E La figura muestra un gráfico que representa el título de FAS (FAME) como resultado de expresar diversas variantes de BCCP (en la posición 2 del gen accb) en células huésped de E. coli. WT es el control para el complejo de ACC silvestre. Algunas de estas variantes de BCCP mejoraron el título de FAS más de veces (véase también la tabla 1). Descripción detallada Visión general La divulgación se refiere a variante(s) de ACC o polipéptido(s) de acetil-coa carboxilasa (ACC) variante(s) que puede(n) expresarse en un microorganismo. Estas variantes de ACC están alteradas genéticamente y se cree que confieren actividad enzimática mejorada para la producción aumentada de compuestos derivados de malonil-coa incluyendo derivados de ácidos grasos. En el presente documento, la divulgación se refiere a polipéptido(s) y proteína(s) que puede(n) conducir a actividad acetil-coa carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa(n) en una célula huésped, en comparación con la actividad de ACC correspondiente en una célula silvestre. Con el fin de ilustrar esto, se alteraron genes de ACC introduciendo mutaciones en un gen de ACC así como un operón de ACC. Ambas de estas alteraciones pueden aumentar independientemente la producción de derivados de ácidos grasos en una célula huésped. Se espera que estas mutaciones mejoren el título y rendimiento de un producto derivado de malonil-coa, incluyendo pero sin limitarse a, compuestos derivados de ácidos grasos (es decir, derivados de ácidos grasos) tales como, por ejemplo, ácidos grasos, ésteres grasos, alcoholes grasos, aldehídos grasos, aminas grasas, derivados de ácidos grasos bifuncionales y compuestos no basados en ácidos grasos tales como, por ejemplo, flavanonas y flavonoides, policétidos y ácido 3-hidroxipropiónico. Ejemplos de ésteres grasos son ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE). Los ejemplos de derivados de ácidos grasos bifuncionales incluyen, pero no se limitan a, ω-hidroxiácidos grasos, ω-hidroxidioles, ω-hidroxi-fame y ω-hidroxi- FAEE. Se ha estipulado que, con el fin de producir rendimientos superiores de compuestos derivados de malonil-coa, se requiere la expresión aumentada de los cuatro genes de ACC que codifican para el complejo de ACC completo (Davis et al. (2000) anteriormente). Sin embargo, la presente divulgación revela el hallazgo sorprendente de que las mutaciones seleccionadas como diana en sólo un gen de ACC pueden mejorar la producción de compuestos que se derivan de malonil-coa, incluyendo derivados de ácidos grasos. Por ejemplo, mutaciones seleccionadas como diana en el gen accb y/o cambios de expresión seleccionados como diana en el operón de accbc mejoraron significativamente la producción de ésteres grasos en hasta el 630 por ciento (véase la figura así como la tabla 1 y los ejemplos, más adelante). Sin querer restringirse a la teoría, se cree que variantes de ACC o polipéptidos de ACC variantes confieren directa o indirectamente a complejos de ACC actividad enzimática mejorada que conduce a una producción superior de compuestos derivados de malonil-coa en células huésped. Se cree que la actividad de la célula huésped aumenta, dando como resultado de ese modo producción aumentada de compuestos derivados de malonil-coa. Tales compuestos derivados de malonil-coa incluyen derivados de ácidos grasos y compuestos no basados en ácidos grasos. Definiciones Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares un, una y el/la incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a una célula huésped incluye dos o más de tales células huésped, la referencia a un éster graso incluye uno o más ésteres grasos, o mezclas de ésteres, la referencia a una secuencia de ácido nucleico incluye una o más secuencias de ácido nucleico, la referencia a una enzima incluye una o más enzimas, y similares. Los números de registro de secuencias en la totalidad de esta descripción se obtuvieron de bases de datos proporcionadas por el NCBI (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) mantenidas por los Institutos Nacionales de Salud, EE.UU. (que se identifican en el presente documento como números de registro de NCBI o alternativamente como números de registro de GenBank o alternativamente o simplemente como números de registro ), y de las bases de datos UniProt Knowledgebase (UniProtKB) y Swiss-Prot proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformática (que se identifican en el presente documento como números de registro de UniProtKB ). Los números de clasificación de enzimas (EC) se establecen por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB), cuya descripción está disponible en el sitio web de Nomenclatura de Enzimas del IUBMB en Internet. Los números EC clasifican las enzimas según la reacción que catalizan. Por ejemplo, la actividad enzimática acetil-coa carboxilasa (ACC) se clasifica bajo E.C ACC es un complejo enzimático de múltiples subunidades presente en la mayoría de los procariotas y en los cloroplastos de la mayoría de las plantas y algas. ACC cataliza la reacción de ATP y acetil-coa y HCO 3- para dar ADP y fosfato y malonil-coa. La funcionalidad de ACC se conserva en la mayoría de los procariotas desde una especie hasta la siguiente. Por tanto, diferentes especies microbianas pueden llevar a cabo la misma actividad enzimática acetil-coa carboxilasa (ACC) que se clasifica bajo E.C Tal como se usa en el presente documento, el término nucleótido se refiere a una unidad monomérica de un polinucleótido que consiste en una base heterocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato. Las bases que se 8

9 E producen de manera natural (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T) y uracilo (U)) son normalmente derivados de purina o pirimidina, aunque debe entenderse que también están incluidos análogos de bases que se producen de manera natural y no natural. El azúcar que se produce de manera natural es la pentosa (azúcar de cinco carbonos), la desoxirribosa (que forma ADN) o la ribosa (que forma ARN), aunque debe entenderse que también están incluidos análogos de azúcares que se producen de manera natural y no natural. Los ácidos nucleicos se unen normalmente mediante enlaces fosfato para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos, aunque se conocen en la técnica muchas otras uniones (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares). El término polinucleótido se refiere a un polímero de ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN), que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o alterados. Los términos polinucleótido, secuencia de ácido nucleico y secuencia de nucleótidos se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ARN o bien ADN. Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula, y por tanto incluyen ADN bi y monocatenario y ARN bi y monocatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de o bien ARN o bien ADN producidos a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, aunque no limitados a polinucleótidos metilados y/o de extremos ocupados. El polinucleótido puede estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a, plásmido, viral, cromosómico, EST, ADNc, ARNm y ARNr. Tal como se usa en el presente documento, los términos polipéptido y proteína se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. El término polipéptido recombinante se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas recombinantes, en las que generalmente se inserta ADN o ARN que codifica para la proteína expresada en un vector de expresión adecuado que se usa a su vez para transformar una célula huésped para producir el polipéptido. También puede insertarse ADN o ARN que codifica para la proteína expresada en el cromosoma huésped por medio de recombinación homóloga u otros medios conocidos en la técnica, y se usa de ese modo para transformar una célula huésped para producir el polipéptido. De manera similar, los términos polinucleótido recombinante o ácido nucleico recombinante o ADN recombinante se producen por técnicas recombinantes que conocen los expertos en la técnica. Tal como se usan en el presente documento, los términos homólogo y homólogo/a se refieren a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 0 por ciento (%) a la secuencia de polinucleótido o polipéptido correspondiente. Preferiblemente, los polinucleótidos o polipéptidos homólogos tienen secuencias de polinucleótido o secuencias de aminoácidos que tienen una homología de al menos aproximadamente el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 8%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 9%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótido correspondiente. Tal como se usa en el presente documento los términos homología de secuencia e identidad de secuencia se usan de manera intercambiable. Un experto habitual en la técnica conoce métodos para determinar la homología entre dos o más secuencias. Brevemente, pueden realizarse cálculos de homología entre dos secuencias de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima y pueden excluirse las secuencias no homólogas para fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una primera secuencia que se alinea para fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 0%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 8%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 9%, al menos aproximadamente el 98% o aproximadamente el 100% de la longitud de una segunda secuencia. Se comparan entonces los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes de las secuencias primera y segunda. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El tanto por ciento de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del tanto por ciento de homología entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático, tal como BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 21(3): ). El tanto por ciento de homología entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM20, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, ó 6 (Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-43). El tanto por ciento de homología entre dos secuencias de nucleótidos también puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 0, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, ó 6. Un experto habitual en la técnica puede realizar cálculos de homología inicial y ajustar los parámetros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto preferido de parámetros (y el que debe usarse si un profesional no está seguro de qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, penalización por extensión de hueco de 4 y penalización por hueco con desplazamiento del marco de lectura de. Se conocen 9