Evaluación de la actividad antiinflamatoria

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1 Evaluación de la actividad antiinflamatoria del Omega 3 Informe final del Proyecto Román Pérez Fernández Universidad de Santiago de Compostela José Esteban Castelao Fernández Servicio Gallego de Salud-SERGAS

2 En las últimas décadas se ha observado que la modificación del perfil lipídico de la dieta puede modular de forma beneficiosa los procesos inflamatorios, disminuyendo de esta forma el consumo de fármacos antiinflamatorios que además provocan un gran número de efectos secundarios. El consumo de ácidos grasos Omega 3 de origen marino favorece una respuesta adecuada ante la agresión de patógenos y de otros agentes proinflamatorios. Además de su capacidad antiinflamatoria y otros muchos beneficios para la salud, el Omega 3 actuará de forma más o menos efectiva dependiendo de su origen y forma de obtención. El aceite de hígado de pescado Omega 3 activo producido por Biomega Natural Nutrients (BNN) no utiliza, en ningún momento del proceso de obtención del aceite, disolventes químicos ni sistemas de destilación. De esta forma, el aceite de BNN conserva las mismas propiedades que en el pescado, ya que mantiene intacta la estructura molecular de los ácidos grasos eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA), garantizando así su biodisponibilidad. Los avances en el conocimiento de las propiedades metabólicas, inmunomoduladoras e inflamatorias de los ácidos grasos han permitido el desarrollo de nuevas fórmulas lipídicas útiles para conseguir una mejor evolución de las patologías de base inflamatoria, facilitando una recuperación más rápida y la disminución de la dosis de fármacos antiinflamatorios con importantes efectos adversos. La inflamación es la respuesta del sistema inmunológico de un organismo al daño causado a sus células y tejidos vascularizados por patógenos bacterianos y por cualquier otro agresor de naturaleza biológica, química, física o mecánica. La respuesta antiinflamatoria es fundamentalmente una respuesta de carácter reparador, que cuando se prolonga, es el desencadenante de numerosas enfermedades como la arterosclerosis, enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso y la fibrosis pulmonar, así como la cirrosis hepática y las enfermedades inflamatorias intestinales. La inflamación es un proceso complejo caracterizado por la contribución de varios mediadores, como las prostaglandinas y el óxido nítrico (NO). A partir del ácido araquidónico (AA), una serie de enzimas transforman este producto en metabolitos biológicamente activos, llamados de forma general eicosanoides. Son tres las vías principales que convierten el AA en eicosanoides. En la primera vía, y la que en este proyecto se pretende evaluar, el enzima Ciclooxigenasa (COX) produce tromboxanos, prostaglandinas y prostaciclinas. De esta forma, las enzimas COX catalizan la conversión de AA en prostaglandina G 2 (PGG 2 ) y posteriormente en prostaglandina H 2 (PGH 2 ). PGH 2 es el precursor de otras prostaglandinas, de las prostaciclinas y de tromboxanos. Por tanto, la ciclooxigenasa (COX) es una de las principales enzimas implicadas en el metabolismo del ácido araquidónico, catalizando la síntesis de prostaglandinas y tromboxanos. Hay dos isoformas de COX: COX-1 se expresa de forma general y mantenida en todas las células, mientras que COX-2 es una forma inducible que ha sido implicada en la respuesta inflamatoria y en la regulación del crecimiento y diferenciación celular. Específicamente, se cree que COX-2 es el generador primario de los prostanoides que 1/17

3 contribuyen a la inflamación, actuando tanto sobre el inicio de la inflamación como sobre la fase de resolución. El papel del óxido nítrico (NO) como mensajero y molécula efectora ha sido demostrado en gran variedad de tejidos. El óxido nítrico (NO) actúa como mensajero en el sistema nervioso central y como potente vasodilatador fisiológico que regula la presión arterial al modular el tono muscular. El NO es también una importante molécula en la inflamación y la sepsis. La exposición a moléculas bacterianas, como el lipopolisacárido (LPS), estimula las respuestas inflamatorias celulares e induce la liberación de factores proinflamatorios, incluyendo NO, prostaglandina E2 (PGE 2 ), citoquinas o Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF ). La producción fisiológica de NO está mediada por dos enzimas (sintetasas del óxido nítrico constitutivas, cnos), las cuales fueron detectadas en células endoteliales (enos) y neuronas (nnos) y se expresan de forma constante en estos tejidos. Sin embargo, cuando el NO es sintetizado en grandes cantidades por células inflamatorias activadas tiene propiedades citotóxicas y puede estar implicado en la patogénesis de procesos inflamatorios agudos y crónicos. Esta producción de NO está mediada por una enzima llamada sintetasa del óxido nítrico inducible (inos), la cual es inducible por varios estímulos, incluyendo LPS e interferón gamma (IFN- ). El inos está presente en macrófagos y hepatocitos. Durante la inflamación asociada con diferentes patologías, la producción de NO se incrementa de forma significativa y es citotóxica. De tal forma que la inhibición de la producción de NO en respuesta a estímulos inflamatorios puede ser una buena estrategia terapéutica en enfermedades inflamatorias. De esta forma, en este proyecto, se utilizarán varios métodos de estimulación in vitro de macrófagos (línea celular de macrófagos de ratón J774A.1) y medición de NO - 2, determinación de la viabilidad/proliferación celular, captación de radicales libres, y valoración de la expresión del ARNm que codifica a COX-2 e inos, con el fin de valorar la actividad antiinflamatoria de ácidos grasos Omega 3. 2/17

4 Objetivo 1: Estudio del efecto de Omega 3 sobre la formación de nitritos en la línea de macrófagos de ratón J774.1 En este ensayo se determinó el efecto de la administración de: 1) Omega 3 (Biomega Natural Nutrients (BNN)). 2) Dexametasona (DXM, antiinflamatorio esteroideo, usado como control). 3) Indometacina (IDMT, antiinflamatorio no esteroideo, usado como control). sobre la concentración de nitritos producida a 48 h tras la administración del estímulo LPS+Interferón gamma en macrófagos de ratón (línea celular J774A.1). Con este ensayo, se valora la potencia anti-inflamatoria de las sustancias a testar (mayor disminución en la producción de nitritos- mayor capacidad anti-inflamatoria). Los resultados obtenidos demuestran una disminución dosis-dependiente de la concentración de nitritos tras la administración de Omega 3 de BNN, así como tras la administración de DXM e IDMT. Las concentraciones óptimas de los Omega 3 de BNN están entre 5-10 g/ml (en base a DHA). La capacidad anti-inflamatoria de los Omega 3 de BNN es semejante a DXM a dosis de 0.1 M e IDMT a dosis de 0.1mM. No hay diferencias significativas entre los Omega 3 de BNN lote QU-3065 y lote RO Conclusión: Los Omega3 de BNN son iguales en capacidad de inhibir óxido nítrico que la DXM y la IDMT. 3/17

5 Figura 1 Nitritos (%) Nitritos (%) LPS+ IFN BiomegaN DXM IDMT Ω3 Ω3 Ω3 Ω3 DXM IND Control LPS+IFN 1 μg/ml 2,5 μg/ml 5 μg/ml 10 μg/ml 0,01 μm 0,1 mm MEDIA ,39 120,99 118,23 75,5 78,71 77,51 81,53 sd 1,61 3,61 3,61 4,4 4,4 1,61 3,61 5,62 Figura 1: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN a diferentes concentraciones sobre la concentración de nitritos producida a 48h comparado con DXM y IDMT. 4/17

6 Objetivo 2: Determinación de la viabilidad/proliferación celular (efecto citotóxico) En este ensayo se determinó el efecto de la administración de: 1) Omega 3 (BNN) 2) Dexametasona (DXM, antiinflamatorio esteroideo, usado como control), 3) Indometacina (IDMT, antiinflamatorio no esteroideo, utilizado como control) sobre la toxicidad o viabilidad celular a 48 h tras la administración del estímulo LPS+Interferón gamma en macrófagos de ratón (línea celular J774A.1). Es decir, se valora si el efecto de la reducción de nitritos es debido a toxicidad inducida a la célula (si la célula se muere hay menos nitritos ), o es debida a un efecto farmacológico del Omega3 (disminuye nitritos, pero las células son viables). Los resultados obtenidos muestran una disminución dosis-dependiente de la viabilidad celular tras la administración de Omega 3 de BNN. En cualquier caso, la viabilidad celular es siempre superior a la obtenida con el estímulo LPS+IFN-gamma. La toxicidad celular tras la administración de DXM o IDMT es significativamente superior a la producida por los Omega 3 de BNN. Conclusión: Es destacable la alta viabilidad celular obtenida tras la administración de los Omega 3 de BNN comparado con los antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos. 5/17

7 Citotoxicidad/viabilidad celular (%) viabilidad celular (%) LPS+ IFN BiomegaN DXM IDMT Ω3 Ω3 Ω3 Ω3 DXM DXM DXM IDMT IDMT IDMT Control LPS+IFN 1 μg/ml 2,5 μg/ml 5 μg/ml 10 μg/ml 0,01 μm 0,1 μm 1 μm 0,01 mm 0,1mM 0,25mM MEDIA ,61 135,68 151,03 102,63 59,89 42,32 72,06 75,24 41,49 56,71 58,51 sd 8,71 7,19 10,51 3,18 10,51 4,84 5,81 2,9 3,73 5,12 2,63 2,77 Figura 2: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN sobre la toxicidad o viabilidad celular comparado con DXM e IDMT. 6/17

8 Objetivo 3: Evaluación del efecto Scavenger (captación de radicales libres) En este ensayo se determinó el efecto de la administración de: 1) Omega 3 (BNN) sobre la captación de radicales libres realizada por un donador de óxido nítrico (PAPA- NONOato). Los resultados obtenidos muestran una disminución de nitritos en el medio tras la administración de Omega 3 de BNN. La captación de radicales libres es semejante con ambos Omega3 de BNN (QU-3065 y RO-3140). Conclusión: Los Omega 3 de BNN reducen la formación de radicales libres. 7/17

9 Figura 7 Evaluación de la actividad anti-inflamatoria del Omega 3 Captación de radicales libres (%) Nitritos (%) BiomegaN QU-3065 QU-3065 QU-3065 QU-3065 Control 1 μg/ml 2,5 μg/ml 5 μg/ml 10 μg/ml MEDIA ,84 67,36 67,68 79,84 sd 4,16 4,32 6,24 8,8 2,4 Figura 3: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN a distintas concentraciones sobre la captación de radicales libres. 8/17

10 Objetivo 4: Evaluación de la expresión del ARNm que codifica a inos y COX-2 (Figura 4) y proteína de COX-2 (Figura 5). En este ensayo se determinó el efecto de la administración de: 1) Omega 3 (BNN) 2) Dexametasona (DXM, antiinflamatorio esteroideo, usado como control) 3) Indometacina (IDMT, antiinflamatorio no esteroideo, utilizado como control) sobre la inhibición de la expresión del ARN mensajero de inos y COX-2 Los resultados obtenidos muestran una disminución significativa del ARNm de inos tras la administración de 5 g/ml Omega 3 de BNN. La inhibición de ARNm de inos se observa también tras la administración de dexametasona(0.1 M) e indometacina(0.1 mm). Estos resultados son semejantes a los obtenidos cuando se valora el ARNm de COX-2. La expresión proteica de COX-2 es inhibida de forma evidente tras la administración de Omega 3 de BNN, en relación al control y las célulasestimuladas con LPS e IFN. Conclusión: La administración de Omega 3 de BNN, produce un bloqueo total en la producción de ARNm de inos, superior a la obtenida con DXM e IDMT. En relación con COX-2, los resultados son similares, siendo la inhibición de COX-2 superior tras el tratamiento con Omega 3 que con los fármacos de referencia. La expresión proteica de COX-2 disminuye de forma evidente tras la administración de Omega 3 de BNN. 9/17

11 Niveles de expresión de ARNm COX-2 Niveles de expresión de ARNm inos Evaluación de la actividad anti-inflamatoria del Omega 3 Figura 10 12,00 inos mrna 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 ARNm COX-2 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 LPS+ IFN Figura 4: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN sobre la inhibición de la expresión del ARN mensajero de inos y COX-2 comparado con DXM e IDMT. 10/17

12 COX-2 b-actina Figura 5: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN sobre la expresión proteica del COX-2 comparado con DXM e IDMT. 11/17

13 Objetivo 5: Efectos de Omega 3 sobre la secreción de citoquinas. En este ensayo se determinó el efecto de la administración de: 1) Omega 3 (BNN) 2) Dexametasona (DXM, antiinflamatorio esteroideo, usado como control) sobre la expresión proteica de citoquinas. Se realizó un array de expresión proteica de citoquinas en células control y tras la administración de LPS+IFN, Omega3 de BNN (5 g/ml) y dexametasona (0.1 M). Los resultados obtenidos indican una disminución de Fas ligand, GCSF, I-TAC, MIG, TIMP2 y TNFalfa en células tratadas con Omega 3 en relación a aquellas tratadas con LPS+IFN. En algunas de estas citoquinas (GCSF, I-TAC, MIG, TIMP2 y TNF-alfa), la disminución en los niveles de citoquinas fue superior al observado tras el tratamiento con DXM. Conclusión: La administración de Omega3 de BNN, revierte el incremento de ciertas citoquinas tras la administración del estímulo pro-inflamatorio (LPS+IFN), y esta disminución es en algunos casos superior al producido por DXM. Es de señalar el efecto de los Omega 3 de BNN sobre TNF-alfa. 12/17

14 Control LPS/IFN BNN DXM 5 g/ml 0.1 M POS , , , ,50 NEG 6,40 6,94 6,74 7,29 BLC 273,00 266,85 298,73 271,15 CD 30L 253,00 260,82 290,95 292,72 Eotaxin 24,00 32,67 31,12 141,74 Eotaxin-2 706,00 508,58 600,05 269,61 Fas ligand 16,00 39,70 15,04 9,24 Fractalkine 49,50 35,18 45,12 25,68 GCSF 109, ,07 511, ,67 GM-CSF 377,00 510,09 642,06 313,78 IFN-gamma 516,00 448,28 520,70 434,46 IL-1 alpha 130,50 292,48 512,92 111,44 IL-1 beta 15,50 17,59 22,30 9,24 IL2 448,50 405,56 396,23 393,89 IL3 295,00 279,92 297,17 264,48 IL4 613,00 559,84 643,62 484,79 IL , , , ,19 IL9 707,00 608,09 605,24 536,14 IL10 254,50 243,74 227,16 201,31 IL-12p40/p70196, , , ,69 IL-12p70 745,50 699,55 752,01 611,63 IL-13 84,00 60,81 93,35 59,57 IL ,00 429,18 458,47 435,49 I-TAC 236, ,40 333,48 495,57 KC 50,50 39,70 44,08 54,44 Leptin 32,50 19,60 21,78 7,70 LIX 355,00 314,09 349,56 346,13 Lymphotactin315,50 250,27 308,07 278,86 MCP ,00 979,98 765,50 718,96 MCSF 699,50 727,69 540,93 544,36 MIG 23, ,79 320, ,50 MIP-1 alpha , , , ,76 MIP-1 gamma65.412, , , ,52 RANTES 4.558, , , ,68 SDF-1 165,50 154,28 166,48 90,90 TCA-3 306,50 234,19 266,58 221,85 TECK 346,00 391,49 422,68 353,32 TIMP-1 293,50 248,26 254,65 194,63 TIMP-2 356,00 856,85 301,84 204,39 TNF-alpha 461, , , ,23 stnf RI , , , ,85 stnf RII , , , ,94 Figura 6: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN sobre la secreción de citoquinas. 13/17

15 Intensidad de señal Intensidad de señal Intensidad de señal Intensidad de señal Intensidad de señal Intensidad de señal Evaluación de la actividad anti-inflamatoria del Omega 3 Figura 12 Figura 7: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN sobre la secreción de citoquinas. Representación gráfica de las citoquinas en las que se observa disminución de niveles. 14/17

16 Objetivo 6: Efectos de Omega 3 sobre la actividad anti-tumoral en líneas celulares de cáncer de mama. En este ensayo se determinó el efecto de la administración de: 1) Omega-3 (BNN) sobre la proliferación celular en las líneas de adenocarcinoma de mama humana MCF-7 (no invasiva) y MDA-MB-231 (invasiva). Se administró Omega3 de BNN a distintas dosis y distinta procedencia (2.5, 5 y 10 g/ml, y quenlla o rosada) a células MCF-7 (adenocarcinoma de mama no invasiva) o MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama altamente invasivo) y a las 48h se valoró la proliferación celular (ensayo MTT). Los resultados muestran una disminución de la proliferación celular tras la administración de 10 g/ml de Omega 3 procedentes de quenlla y disminución semejante a todas las dosis con el aceite procedente de rosada. En la línea celular MDA-MB-231, se observa disminución de la proliferación celular de forma dosis dependiente al utilizar aceite de quenlla, y disminución significativa de proliferación a partir de 5 g/ml con aceite de rosada. Conclusión: La administración de Omega 3 de BNNde origen de quenlla inhibe proliferación de células MCF-7 a dosis de 10 g/ml, mientras que con el aceite de rosada esta inhibición se produce a dosis de 5 g/ml. En la línea celular MDA-MB-231 se observa disminución de la proliferación celular a las mismas dosis con los mismos tipos de aceite. 15/17

17 Metabolización MTT (A570) Metabolización MTT Evaluación de la actividad anti-inflamatoria del Omega 3 0,800 MCF-7 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 EtOH Quenlla Rosada Figura 8: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN en diferentes dosis y de diferentes procedencias, sobre la proliferación celular en las líneas de adenocarcinoma de mama humana MCF-7 (no invasiva). 1,000 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 MDA-MB-231 EtOH Quenlla Rosada Figura 9: Efecto de la administración de Omega 3 de BNN en diferentes dosis y de diferentes procedencias, sobre la proliferación celular en las líneas de adenocarcinoma de mama humana MDA- MB-231 (invasiva). 16/17

18 CONCLUSIONES En base a los resultados obtenidos en este estudio, podemos destacar las siguientes conclusiones: 1. El aceite Omega 3 de BNN a dosis de 5 g/ml, inhibe la formación de nitritos de forma semejante a las drogas dexametasona (antiinflamatorio esteroideo, a dosis de 0.1 M) e indometacina (antiinflamatorio no esteroideo, a dosis de 0.1 mm). 2. La administración de Omega3 de BNN a dosis de 5 g/ml no afecta a la viabilidad de las células J774A.1 (no posee efectos citotóxicos), mientras que estos efectos citotóxicos son visibles al utilizar dexametasona (a dosis de 0.01, 0.1 y 1 M) e indometacina (a dosis de 0.01, 0.1 y 0.25 mm). 3. El aceite Omega 3 de BNN a dosis de 5 g/ml reduce la formación de radicales libres in vitro. 4. Los Omega 3 de BNN bloquean la expresión de ARNm de inos. Este efecto de bloqueo de ARNm de inos está relacionado con la disminución de formación de nitritos (punto 1) causada por el Omega 3 de BNN. 5. Los Omega 3 de BNN bloquean la expresión de ARNmy proteína de COX Los Omega3 de BNN reducen de forma significativa citoquinas que median en el proceso inflamatorio. Es de destacar la inhibición que producen los Omega 3 de BNN sobre TNF-alfa, citoquina que incrementa la expresión de COX Los Omega 3 de BNN disminuyen proliferación celular en células de adenocarcinoma de mama a partir de dosis de 10 g/ml. Parecen ser más potentes los efectos observados con Omega 3 de origen de rosada que de quenlla. En base a estas conclusiones, nuestros datos sugieren que el aceite Omega 3 de BNN parece poseer un componente anti-inflamatorio equivalente a antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, pero con menor capacidad citotóxica. Estos efectos antiinflamatorios parecen estar mediados por la inhibición de los enzimas inos (necesario para la producción de nitritos) y de COX-2 (necesaria para la producción de prostaglandinas). Importante destacar que los Omega3 de BNN reducen significativamente la producción de TNF-alfa, el cual a su vez induce a COX-2. 17/17

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