DETERMINACIÓN DE BIOTOXINAS MARINAS

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1 Basado en EU-Harmonised SOP for determination of Lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC/MSMS Version 5, January Página 1 de 1. OBJETIVO Determinar biotoxinas marinas lipofílicas de los grupos de ácido okadaico (AO), Pectenotoxina (PTX), Azaspiracido (AZA) y Yessotoxina (YTX) utilizando metodología basada en el uso de LC/MSMS. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este método es aplicable a la determinación de biotoxinas marinas lipofílicas en diferentes matrices de moluscos, tanto frescos como cocidos tales como mejillones, almejas, navajuelas, y ostiones. La aplicación de este procedimiento permite la determinación cuantitativa directa del AO, PTX2, AZA1 y YTX por medio de los estándares de referencia disponibles comercialmente. Asumiendo un factor de respuesta equivalente, el procedimiento permite la cuantificación indirecta de Dinofisistoxina-1 (DTX1) y DTX2 por medio del uso de AO; de la misma forma PTX2 es usada para la cuantificación indirecta de PTX1, AZA1 es usada para la cuantificación indirecta de AZA2 y AZA3; y YTX es usada para la cuantificación indirecta de Homo YTX, 45 OH YTX y 45 oh Homo YTX. También se puede realizar la cuantificación directa de las toxinas mencionadas anteriormente si se dispone de los estándares certificados correspondientes. 3. FUNDAMENTO El método está basado en la extracción de los grupos de toxinas del AO, PTX, AZA y YTX con 100% de metanol aplicado al tejido homogenizado. Los extractos son luego filtrados y directamente analizados por cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas en tándem (LC/MSMS) con el objetivo de investigar la presencia de AO libre, DTX1 libre, DTX2 libre, PTX1, PTX2, AZA1, AZA2, AZA3, YTX, Homo YTX, 45 OH YTX y 45 OH Homo YTX. Para determinar el contenido total del grupo de toxinas del AO, una hidrólisis alcalina del extracto de metanol es necesaria antes del análisis por LC/MSMS con el objetivo de convertir cualquier ester acetilado de AO y/o DTXs a AO y/o DTX1 o DTX2. Luego de la hidrólisis, los extractos son filtrados y analizados por LC/MSMS. La separación cromatográfica es realizada por elución en gradiente. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS 4.1 EU-Harmonised Standard Operating Procedure for determination of Lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC/MSMS Version 5, January DUEÑO DE PROCESO: Encargada de Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE DOCUMENTO CONTROLADO SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA APROBADO: Jefe Subdepartamento

2 Página 2 de 5. TERMINOLOGÍA 5.1 Grupo de las toxinas del Ácido Okadaico (AO): AO, DTX1, DTX Grupo de Pectenotoxinas (PTX): PTX1, PTX Grupo de Azaspirázido (AZA): AZA1, AZA2, AZA Grupo de Yessotoxina (YTX): YTX, Homo YTX, 45 OH YTX y 45 OH Homo YTX. 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS Utilizar sólo reactivos de grado analítico reconocido. Los solventes deben ser de calidad HPLC, a menos que otra cosa sea especificada. El agua debe ser ultra pura (Milli-Q o similar). NOTA: Dado que el uso de este método involucra reactivos dañinos para la salud, se deben seguir medidas de prevención adecuadas para evitar la inhalación o contacto con la piel. Usar delantal en todo momento, y cuando sea necesario guantes y/o antiparras. El trabajo debe ser realizado utilizando una campana de extracción. 6.1 REACTIVOS Acetonitrilo grado HPLC o hipergrado para LCMS Metanol grado HPLC Ácido clorhídrico (37% pureza) Ácido clorhídrico 2.5M. Ver preparación en punto Hidróxido de Sodio ( 99% pureza) Hidróxido de Sodio 2.5M. Ver preparación en punto Bicarbonato de Amonio ( 98% pureza) Solución de Hidróxido amónico ( 25% o más de pureza) Acetato amónico ( 99% pureza) Materiales de Referencia: Los materiales de referencia certificados y las soluciones estándar pueden ser adquiridas a través del National Research Council Canada (NRC), Institute for Marine Biosciences, Halifax Material de referencia certificado conteniendo ácido okadaico y Dinofisistoxina 1 (CRM-DSP-MUS-b) Homogenizado de molusco (Mytillus edulis) de la glándula digestiva con ácido okadaico y Dinofisistoxina.

3 Página 3 de Solución estándar de ácido Okadaico en metanol (CRM-OA-c) Solución estándar de Pectenotoxina-2 en metanol (CRM PTX2) Solución estándar de Azaspiracido 1 en metanol (CRM AZA1) Solución estándar de Yessotoxina en metanol (CRM YTX) Solución estándar de Homo-Yessotoxina (CRM-hYTX) Solución estándar de Azaspiracido 2 en metanol (CRM AZA2) Solución estándar de Azaspiracido 3 en metanol (CRM AZA3) Solución estándar Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-DTX1) Solución estándar Dinofisistoxina 2 en metanol (CRM-DTX2). 6.2 INSUMOS Instrumentos para la preparación de la muestra como cuchillos, espátulas, tijeras, tamiz de acero inoxidable, pocillos plásticos Matraces aforados de 20 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml y 1000 ml Micro y macropipetas y probetas Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml Filtros de membrana para jeringas tamaño de poro 0.45 µm Viales de autosampler para HPLC Jeringas para sistema de filtración de muestras Filtros de membrana para jeringas tamaño de poro 0.2 µm Columna HPLC en fase reversa Waters XTerra MS C µm 3.0*150mm 6.3 EQUIPOS Balanza analítica de sensibilidad Balanza de sensibilidad 0.01g Blender de alta velocidad Shaker o Vortex Ultra turrax Centrífuga capaz de alcanzar los 5000 RPM Bloque calefactor o baño termoregulado capaz de alcanzar los 76 C.

4 Página 4 de HPLC con sistema capaz de analizar en modo gradiente Espectrómetro de masas equipado con interfase ESI y capaz de analizar en tándem MS/MS. 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto materiales, insumos y reactivos esté disponible. Leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar. Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad 7.1 MUESTREO/MUESTRA Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los rotulados en la muestra. Registrar la recepción de la muestra en la planilla Excel Registro de análisis de toxinas marinas y micotoxinas RG Almacenar la muestra refrigerada si será procesada de manera inmediata, de lo contrario congelar hasta su procesamiento. Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite, almacenar aproximadamente 10g de contramuestra y eliminar lo restante en bolsa de residuos biológicos. 7.2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Ácido clorhídrico 2.5M: Agregar 20 ml de ácido clorhídrico (6.1.5) a un matraz aforado de 100 ml al que se le adicionan previamente aproximadamente 20 ml de agua. Completar hasta el aforo con agua. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada hasta por 3 meses Hidróxido de Sodio 2.5M: En un vaso de precipitado de 100 ml pesar 10g de hidróxido de sodio (6.1.7) y disolver en 75 ml de agua. Trasvasijar el hidróxido de sodio disuelto a un matraz aforado de 100 ml y aforar con agua. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada hasta por 3 meses Fase móvil A: 100% Agua + 2 mm Acetato Amónico, ph 9.5: Preparación 1000 ml: Disolver g de Acetato Amónico en 60 ml de Agua y agregar a un matraz aforado de 1000 ml; agregar 8 ml de Hidróxido de Amónico (>25% pureza) y llevar al aforo con Agua. Comprobar el ph. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada durante 48 horas de su preparación.

5 Página 5 de Fase Móvil B: 90% Acetonitrilo / 10% Agua + 2 mm Acetato Amónico, ph 9.5: Preparación 2000 ml: Disolver g de Acetato Amónico en 132 ml de Agua y agregar a un matraz aforado de 2000 ml; agregar 48 ml de Hidróxido Amónico y llevar al aforo con Acetonitrilo. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada durante 48 horas de su preparación Solución estándar stock: Un volumen específico de los estándares de referencia ( al ) es diluido en metanol (6.1.2) al volumen especificado en la Tabla N 1 para obtener la solución estándar stock multitoxina. La Tabla 1 muestra un ejemplo de preparación de una solución estándar stock multitoxina derivada de los materiales de referencia disponibles comercialmente. Tabla 1. Ejemplo de preparación de solución estándar stock con un nivel de concentración de 200 ng/ml de AO, PTX-2 y AZA y de 500 ng/ml de YTX. Estándar de referencia Ácido okadaico NRC CRM-OA-c Pectenotoxina-2 NRC CRM-PTX2 Azaspiracido-1 NRC CRM-AZA 1 Azaspiracido-2 NRC CRM-AZA 2 Azaspiracido-3 NRC CRM-AZA 3 Dinofisistoxina 1 NRC CRM-DTX1 Dinofisistoxina 2 NRC CRM-DTX2 Yessotoxina NRC CRM-YTX Homo-Yessotoxina NRC CRM-hYTX Concentración certificada (ug/ml) Volumen (ul) Solvente (ul) Volumen total (ul) 1000 Concentración final (ng/ml) NOTA: Se debe chequear la concentración de los diferentes lotes de estándares de referencia ya que la concentración certificada puede cambiar.

6 Página 6 de 7.3 PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN Diluir un volumen determinado de la solución estándar stock multitoxina (7.2.5) en metanol (6.1.2) al volumen indicado en la Tabla N 2 para obtener una solución estándar de trabajo multitoxina para la curva de calibración. Estas soluciones pueden ser usadas por una semana, y deben ser almacenadas en congelador ( -20 C) cuando no estén en uso. Un periodo de almacenamiento mayor es permitido si se prueba su estabilidad por parte del laboratorio. La Tabla N 2 muestra un ejemplo de la preparación de las soluciones estándares de trabajo para la curva de calibración. Tabla 2 Ejemplo de preparación de soluciones estándares de trabajo con concentraciones en un rango de 3ng/mL a 40 ng/ml para AO, PTX2 y AZA-1, y de 5 ng/ml a 100 ng/ml para YTX Volumen de solución estándar Volumen de solvente Metanol (ul) Concentración de AO,DTX1, DTX2, PTX2, AZA1, AZA 2, AZA 3 Concentración de YTX, hytx (ng/ml) stock (ul) (ng/ml) NOTA: Se debe chequear la concentración de los diferentes lotes de estándares de referencia ya que la concentración certificada puede cambiar. 7.4 PREPARACIÓN DE CONTROLES Se recomienda preparar un fortificado a partir de una muestra o un material de referencia cada día de análisis. En el caso de que se utilice un Material de referencia como el indicado en el punto de este método, revisar la preparación del material respecto de su factor de dilución en el punto PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA MEDICIÓN Preparación de la muestra Limpiar las muestras por fuera con abundante agua Abrir el molusco cortando el aductor Lavar el interior del molusco y remover la arena y otros materiales con abundante agua Sacar la carne de la concha por medio de la separación del músculo aductor y el tejido conectado a la bisagra. No utilizar calor ni anestésicos para abrir el molusco Drenar los tejidos removidos en un tamiz para remover el agua salada Tomar 100 a 150g del tejido removido y homogenizar en un blender para obtener una muestra representativa. Sub muestras de este homogenizado pueden ser

7 Página 7 de tomadas inmediatamente después de realizado el mezclado, mientras aún esté mezclado, o luego de mezclar nuevamente Procedimiento de Extracción Pesar 2.00g g del tejido homogenizado en un tubo de centrífuga de 50 ml Agregar 9.0 ml de metanol y homogenizar la muestra por medio de mezclado en vortex por 3 minutos al máximo nivel de velocidad Centrifugar a 5000 RPM o más por 10 minutos a 20 C y transferir el sobrenadante a un matraz aforado de 20 ml Repetir la extracción del residuo del tejido con 9 ml más de metanol y homogenizar por 1 minuto en ultraturrax Centrifugar a 5000 RPM o más por 10 minutos a 20 C y combinar el sobrenadante con el primer extracto en el matraz Aforar el matraz a 20 ml con metanol Análisis de los grupos de toxinas AO, PTX, AZA y YTX libres La determinación de los grupos de toxinas libres de AO, PTX, AZA y YTX es realizada luego de filtrar una alícuota del extracto metanólico a través de un filtro de jeringa compatible con metanol de 0.45 µm o 0.2 µm e inyectando entre 5 µl y 20 µl dependiendo de la sensibilidad del instrumento, al sistema LC/MSMS Hidrólisis Para detectar y cuantificar el contenido total de toxinas AO y DTX es necesaria una hidrólisis alcalina antes del análisis por LC/MSMS. En un vial de HPLC, traspasar 1.0 ml del extracto metanólico y agregar a este 125µl de NaOH 2.5M, homogenizar utilizando vortex por 0.5 minutos y calentar la mezcla utilizando bloque calefactor o baño de agua a 76 C por 40 minutos. Enfriar a temperatura ambiente, neutralizar con 125 µl de HCl 2.5 M y homogenizar en vortex por 0.5 minutos. Filtrar el extracto por medio de un filtro para jeringa compatible con metanol de 0.45 µm o 0.2 µm e inyectar a la columna HPLC. NOTA: Durante la hidrólisis los viales deben ser firmemente cerrados (El punto de ebullición del metanol es 65 C). Pesando el vial antes y después de su calentamiento se puede chequear si hubo una evaporación del metanol durante el proceso. También se puede chequear de manera visual marcando el vial antes de ponerlo a calentar y luego revisándolo. Si se observa evaporación del metanol, el volumen debe ser completado con metanol hasta el peso original antes de continuar con el proceso Etapa de concentración Si es necesario, se puede utilizar una etapa de concentración con el fin de alcanzar un límite de cuantificación más bajo (con una relación señal ruido de 10:1) de 40 µg/kg para AO y AZA1, y de 50 µg/kg para PTX2 y 60 µg/kg para YTX.

8 Página 8 de Limpieza Puede ser usada, si es necesario, para eliminar los efectos de la matriz. Posibles opciones son extracción líquido-líquido, SPE, etc. Si esta etapa es utilizada, la recuperación de esta etapa debe ser evaluada individualmente y reportada por el laboratorio Curva de calibración e inyección de muestra Se debe inyectar una curva de calibración cada día de análisis. La siguiente secuencia de inyecciones debe ser usada para el análisis de muestras: A. Una inyección de cada nivel de la curva de calibración (primer set) comenzando desde la concentración más baja hasta la más alta. B. Una inyección de un testigo reactivo preparado durante la extracción de muestras. C. Extractos de las muestras inyectados en duplicado si es posible, incluyendo un control de calidad positivo (Ejemplos: solución estándar de calibración intermedia, extracto fortificado, material de referencia certificado). D. Una inyección del testigo reactivo. E. Una segunda inyección de cada nivel de la curva de calibración (segundo set). La respuesta de la deriva intra lote, definida aquí como la variación entre las pendientes de las curvas de calibración del primer y el segundo set de estándares no debe ser 25%. NOTA: Aunque este procedimiento ha sido validado utilizando inyecciones en duplicado de las muestras, esto puede no ser práctico para análisis de rutina donde un gran número de muestras deben ser analizadas. Cada laboratorio debe chequear la repetibilidad intralaboratorio si se decide utilizar sólo una inyección por muestra. Para realizar la determinación de las toxinas, se debe graficar el área del pico contra la concentración de la solución de calibración inyectada. Se debe asegurar que la pendiente de la curva de calibración muestra una regresión lineal. El coeficiente de correlación, r 2, debe ser Se debe integrar las áreas de los picos de cada toxina detectada en cada inyección de muestra y con ello determinar el promedio de las áreas de pico para cada muestra. El testigo reactivo corresponde a metanol para el caso de los grupos de toxinas del AO, PTX, AZA y YTX que se presentan al estado libre; y metanol luego de la hidrólisis descrita en para el análisis del grupo total de AO. En este testigo reactivo no se deben detectar toxinas ( LOD o 10% del punto de calibración más pequeño).

9 Página 9 de 7.6 ANÁLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES Condiciones cromatográficas básicas (I) Tabla 3. Condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas. Columna Flujo Volumen de Inyección Temperatura de la columna Gradiente X-Terra MS C18, 150 mm largo * 3 mm diámetro, 3.5 µm tamaño de partícula Tiempo (minutos) 0.6 ml/min 10 µl 40 C Fase móvil A (%) Fase móvil B (%) Inicial Fase móvil A: 100% Agua + 2 mm acetato amónico, ph 9.5. Ver preparación en punto del método Fase Movil B: A 90% acetonitrilo;10% agua + 2 mm acetato amónico, ph 9.5. Ver preparación en punto del método NOTA: Las condiciones cromatográficas descritas anteriormente son para el equipo MS/MS Agilent 6430 Triple Cuadrupolo (medio alcalino). Si se dispone otro equipo las condiciones cromatográficas deben ser ajustadas según las condiciones de cada laboratorio. Los analitos que no puedan ser distinguidos por la espectrometría de masas, deben ser separados por medio de la cromatografía (AO y DTX-2) Detección por medio del Espectrómetro de Masas. Si no se dispone de estándares individuales, los parámetros del MS deben ser basados en aquellos optimizados para los estándares disponibles. Consecuentemente, los mismos valores de DP[V], CE[eV] y dwell time deben ser usados para la detección de cada grupo de toxinas (AO, PTX, AZA y YTX) dado que cada grupo tiene el mismo patrón de fragmentación.

10 Página 10 de La detección MS debe ser realizada utilizando dos transiciones por toxina. La transición de mayor intensidad es la utilizada para la cuantificación, mientras que la transición de menor intensidad es utilizada con fines confirmatorios. En las tablas 4, 5 y 6 se describen las condiciones del Espectrómetro de Masas. Tabla 4. Condicions MS (Agilent) Intrumento 1260/6430 Fuente de Ionización ESI Vcap Positivo 4500 V/ Negativo 4000 V Drying gas Flow 12 L/min Drying gas Temp. 350 C Nebulizer 55 psi Delta EMV Positivo 300V/ Negativo 600V Tabla 5. Condiciones MRM Segmento Tiempo Tipo de Válvula Delta EMV inicial (min) Scan Diverter (Pos/Neg) 1 0 MRM To Waste MRM To MS 300/ MRM To Waste 0 Tabla 6. Condiciones de Adquisición por espectrometría de masas Compuesto Ion Ion Dwell Frag CE(V) Cell Acc polaridad precursor Producto (V) (V) OA Negativo OA Negativo DTX Negativo DTX Negativo DTX Negativo DTX Negativo YTX Negativo YTX Negativo homo YTX Negativo homo YTX Negativo AZA Positivo AZA Positivo AZA Positivo AZA Positivo AZA Positivo AZA Positivo PTX Positivo PTX Positivo

11 Página 11 de 7.7 CÁLCULO DE RESULTADOS: Identificación y confirmación Identificar la presencia de cada toxina, con los estándares de referencia disponibles, comparando el tiempo de retención de los analitos en la muestra con aquellos de los estándares. Un analito es detectado cuando la desviación entre el tiempo de retención del analito y del estándar no excede el 3%. Para una correcta identificación, una buena línea base de separación entre el AO y su isómero DTX2 debe ser asegurada. Una resolución aceptable entre dos picos es considerada 1.5. Si la resolución es 1.0 las condiciones cromatográficas deben ser ajustadas. Para propósitos confirmatorios para cada toxina identificada, la señal ruido del ion producto con la menor intensidad debe ser 3. Para cuantificar, la transición con mayor intensidad es usada. La relación entre los dos iones (cuantificador y cualitativo) debe ser registrada Cuantificación La cuantificación de cada toxina es determinada usando el método de estándar externo de calibración. De acuerdo al enfoque seguido en el estudio de validación interlaboratorio del método y asumiendo una respuesta equi-molar, la curva de calibración construida para el AO es también usada para la cuantificación de DTX1 y DTX2; la curva de calibración construida para PTX2 es también usada para PTX1, la curva para AZA1 es también usada para la cuantificación de AZA2 y AZA3, y la curva de calibración para YTX es también usada para la cuantificación de homo YTX, 45 OH YTX y 45 OH homo YTX. Este enfoque puede ser cambiado cuando nuevos estándares de referencia certificados estén disponibles. La evaluación es basada en la ecuación lineal de la línea de regresión de las toxinas individuales con estándares disponibles. Cuando la señal de una toxina en una muestra analizada sea mayor que la señal del nivel más alto en la curva de calibración, el extracto deberá ser diluido con metanol para obtener una señal dentro de la curva de calibración y el factor de dilución (D) deberá ser tomado en cuanto en los cálculos.

12 Página 12 de Por lo tanto, a partir de la curva de calibración, la concentración de las toxinas de manera individual en cada muestra analizada es calculada siguiendo la siguiente ecuación: Donde: y = Área del pico cromatográfico b= Intercepto de la regresión lineal a = Pendiente de la curva de calibración V T = Volumen total del extracto crudo (20 ml) V H = Volumen del extracto usado para realizar la hidrólisis V F = Volumen final del extracto luego de la hidrólisis (y limpieza/concentración) W = Peso de la muestra de tejido (2g) D = Factor de dilución (Si el extracto fue diluido para entrar en la curva de calibración) Corrección por la recuperación y corrección por la matriz Con la finalidad de evaluar los efectos del procedimiento y de la matriz, un material de referencia o un extracto fortificado pueden ser usados para la corrección de la recuperación o de la matriz. NOTA: El procedimiento operativo estándar al que hace referencia este método ha sido validado por medio de un estudio interlaboratorios utilizando resultados no corregidos y corregidos. Para la determinación de las toxinas del grupo del AO, la corrección utilizando material de referencia certificado por lo general mejora las características de rendimiento. La referencia indica que cada laboratorio debe determinar los efectos de la matriz en su instrumentación y determinar si la corrección es necesaria. Para la determinación del grupo del AO, el material de referencia CRM-DSP-Mus-b puede ser usado para la corrección de la recuperación. Se encontró que la siguiente preparación del material de referencia certificado (MRC) fue apropiada:

13 Página 13 de A. Transferir 1.9g del homogenizado de MRC a un tubo de centrífuga de 50 ml (Esta cantidad debe ser pesada exactamente luego de mezclar completamente el contenido total de la botella) B. Extraer dos veces con metanol siguiendo el mismo procedimiento indicado en C. Diluir (1/50) el extracto crudo de MRC utilizando una micropipeta, transfiriendo 400 ul del extracto crudo a un matraz aforado de 20 ml y llevar al aforo con metanol D. Diluir (1/6) del extracto crudo de MRC utilizando una micropipeta, transfiriendo 3300 ul del extracto crudo a otro matraz aforado de 20 ml y llevar al aforo con metanol. Tabla 7. Concentración del MRC Mus-b para el grupo del AO para la corrección de la recuperación. NRC CRM-DSP- MUS-b Lote Concentración esperada (ng/ml) utilizando un factor de dilución de 1/6 Concentración esperada (ng/ml) utilizando un factor de dilución de 1/50 OA No aplica 19.2 (equivalente a 192 ug/kg) DTX (equivalente a 204 ug/kg) No aplica NOTA: Se debe chequear la concentración de los diferentes lotes de MRC ya que la concentración certificada puede cambiar. Cuando un MRC (recuperación respecto del procedimiento) o un extracto fortificado (efecto de la matriz) es utilizado para corregir, los valores de recuperación obtenidos en el análisis del MRC o del extracto fortificado deben ser usados de acuerdo a la siguiente expresión: Concentración corregida: µg toxina/kg = (µg/kg) CALIBRACIÓN EXTERNA * 100 %R CRM o extracto fortificado Donde: (µg/kg) CALIBRACIÓN EXTERNA = Concentración calculada por medio de calibración externa de acuerdo al punto %R CRM o extracto fortificado = Recuperación obtenida del análisis de un MRC o de un extracto

14 Página 14 de Fortificado %R = (ng/ml) CALCULADO_ * 100 (ng/ml) TEORICO 7.8 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO. La Tabla N 8 resume los criterios que se deben cumplir por parte de los parámetros de control de calidad del procedimiento para el análisis cuantitativo de biotoxinas marinas lipofílicas. Tabla 8. Criterios de control de calidad para la aceptación del analisis cuantitativo de biotoxinas marinas lipofílicas. Parámetro de control de calidad Criterio Resolución cromatográfica La resolución entre AO y DTX2 1.0 Sensibilidad La señal ruido del product ion con la menor intensidad debe ser 3 Curva de calibración El factor de correlación r 2 derivado de una curva de al menos 5 niveles debe ser 0.98 Deriva de la respuesta Variación entre las pendientes de los dos set de curvas de calibración 25% Testigo reactivo Debe ser inyectado luego de la concentración más alta de la curva de calibración y luego de los sets de muestras como se describe en No se debe observar señales para toxinas lipofílicas ( LOD o 10% del punto de menor concentración en la curva de calibración) Deriva del tiempo de retención 3% 7.9 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS. Para expresar los resultados de un grupo de toxinas en µg equivalentes/kg o mg equivalentes/kg, es requerido el uso de factores de equivalencia de toxicidad (FET) indicados en la Tabla N 9. Estos FET fueron adoptados por el Panel científico de contaminantes en la cadena alimentaria de la Autoridad Europea de Inocuidad Alimentaria (EFSA)

15 Página 15 de Tabla 9. FET adoptados por EFSA para las biotoxinas marinas lipofílicas reguladas Grupo de Toxinas Análogo FET Expresión del resultado AO 1 Grupo AO DTX1 1 µg AO equivalentes/kg DTX2 0.6 Grupo PTX PTX2 1 PTX1 1 µg PTX equivalentes/kg AZA1 1 Grupo AZA AZA2 1.8 µg AZA equivalentes/kg AZA3 1.4 YTX 1 Grupo YTX homo YTX 1 45 OH YTX 1 mg YTX equivalentes/kg 45 OH homo YTX 0.5 Por lo tanto, luego de calcular el contenido individual de cada toxina/análogo, se debe multiplicar el valor obtenido por el FET antes de sumar el total de equivalentes para el respectivo grupo de toxinas. 8. CONTROL DE REGISTROS No aplica 9. CONTROL DE CAMBIOS No aplica

16 Página 16 de 10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES Responsabilidades con la ejecución del Método Ejecuta el método Elabora el informe de resultados Evalúa resultado del informe Aprueba el informe de resultados Técnico de Laboratorio Profesional Encargado de Laboratorio Profesional encargado del Laboratorio Jefatura de Sección Química de Alimentos Jefatura de Sub departamento

17 11. ANEXOS Página 17 de ANEXO A: Otras opciones de condiciones cromatográficas según el equipamiento del laboratorio Condiciones LC Las condiciones cromatográficas deben ser ajustadas según las condiciones de cada laboratorio. Los analitos que no puedan ser distinguidos por la espectrometría de masas, deben ser separados por medio de la cromatografía (Ejemplo AO y DTX-2) A continuación se presentan ejemplos de las posibles condiciones cromatográficas para este procedimiento. Sin embargo, el operador puede usar las condiciones que estime convenientes A. Condiciones cromatográficas ácidas Fase móvil A: 100% agua con 2mM formato de amonio + 50 mm de ácido fórmico: Preparación de 1000 ml: Disolver 128 mg de formato de amonio (6.1.4) en agua y transferir a un matraz volumétrico de 1000 ml; agregar 1.9 ml de ácido fórmico (6.1.3) y aforar con agua. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y utilizada por una semana. Fase móvil B: 95% acetonitrilo: 5% agua con 2 mm de formato de amonio + 50 mm de ácido fórmico: Preparación de 500 ml: Disolver 64 mg de formato de amonio (6.1.4) en ml de agua en un matraz aforado de 500 ml; agregar 944 ul de ácido fórmico (6.1.3) y aforar con acetonitrilo. Esta solución es almacenada a temperatura ambiente y puede ser utilizada por una semana. Las Tablas 1-A y 2-A muestran condiciones cromatográficas probadas como adecuadas para condiciones ácidas Tabla 1-A: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C8 bajo condiciones ácidas. Columna Flujo Volumen de Inyección BDS-Hypersil C8, 50 mm largo * 2 mm diámetro, 3 um tamaño de partícula 0.2 ml/min 5 ul 10 ul (Dependiendo de la sensibilidad del MS) Temperatura de la columna C Tiempo (minutos) Fase móvil A (%) Fase móvil B (%) Gradiente

18 Página 18 de Tabla 2-A: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C18 bajo condiciones ácidas. Columna Flujo Volumen de Inyección Temperatura de la columna X-Bridge C18, 50 mm largo * 2.1 mm diámetro, 2.5 um tamaño de partícula 0.3 ml/min 5 ul 20 ul (Dependiendo de la sensibilidad del MS) 25 C Tiempo (minutos) Fase móvil A (%) Fase móvil B (%) Gradiente B. Condiciones cromatográficas básicas (I) Fase móvil A: 0.05 % v/v amoniaco en agua (ph = 11): Preparación 1000 ml: Agregar con una pipeta 0.5 ml de amoniaco a 1000 ml de agua y mezclar. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser utilizada por un mes. Fase móvil B: 0.05% v/v amoniaco en 90% de acetonitrilo: Preparación 1000 ml: Agregar con la ayuda de probetas 900 ml de acetonitrilo y 100 ml de agua en una botella de 1000 ml; agregar con una pipeta 0.5 ml de amoniaco y mezclar. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada por un mes. Tabla 1-B: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C18 bajo condiciones básicas I. Columna Flujo Volumen de Inyección Temperatura de la columna Gradiente X-Bridge C18, 150 mm largo * 3 mm diámetro, 5 o 3.5 um tamaño de partícula 0.4 ml/min 10 ul 40 C Tiempo (minutos) Fase móvil A (%) Fase móvil B (%)

19 Página 19 de C. Condiciones cromatográficas básicas (II) Fase móvil A: 100% agua + 2 mm bicarbonato de amonio, ph 11: Preparación 500 ml: Disolver 79 mg de bicarbonato de amonio en 30 ml de agua y agregar a un matraz aforado de 500 ml; agregar 7.5 ml de hidróxido de amonio y llevar al aforo con agua. Chequear el ph. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada hasta 48 horas luego de su preparación. Fase móvil B: 90% acetonitrilo: 10% agua + 2 mm bicarbonato de amonio, ph 11: Preparación 500 ml: Disolver 79 mg de bicarbonato de amonio en 33 ml de agua y agregar a un matraz aforado de 500 ml; agregar 17.5 ml de hidróxido de amonio y llevar al aforo con acetonitrilo. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada luego de 48 horas de su preparación. Tabla 1-C: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C18 bajo condiciones básicas II Columna Flujo Volumen de Inyección Temperatura de la columna X-Bridge C18, 150 mm largo * 2.0 mm diámetro, 3.5 um tamaño de partícula 0.3 ml/min 5uL - 10 ul 30 C Tiempo (minutos) Fase móvil A (%) Fase móvil B (%) Gradiente

20 Página 20 de 11.2 Detección por medio del Espectrómetro de masas Antes del análisis de las muestras, los parámetros del espectrómetro de masas (MS) deben ser previamente optimizados con los estándares de las toxinas con el objetivo de alcanzar el máximo nivel de sensibilidad en el análisis. Estos parámetros dependen del modelo del instrumento. Si no se dispone de estándares individuales, los parámetros del MS deben ser basados en aquellos optimizados para los estándares disponibles. Consecuentemente, los mismos valores de DP[V], CE[eV] y dwell time deben ser usados para la detección de cada grupo de toxinas (AO, PTX, AZA y YTX) dado que cada grupo tiene el mismo patrón de fragmentación. Cada pico cromatográfico debe ser definido por un rango de al menos 10 a 15 puntos de datos por pico para obtener una descripción lo más precisa del pico. La detección MS debe ser realizada utilizando dos transiciones por toxina. La transición de mayor intensidad es la utilizada para la cuantificación, mientras que la transición de menor intensidad es utilizada con fines confirmatorios. Tabla 10. Ejemplo de parámetros para un sistema 3200 Qtrap LC/MSMS (Aplied Biosystem/SCIEX)

21 Página 21 de Tabla 11. Ejemplo de condiciones de fragmentación MS/MS para un sistema 3200 Qtrap LC/MSMS (applied biosystem/mds SCIEX) *= Si no existe la toxina individual disponible, los valores deben ser basados en aquellos optimizados para los estándares disponibles (usualmente PTX2 para el grupo de PTX y AZA1 para el grupo AZA)

22 Página 22 de ANEXO B Procedimiento para la extracción de toxinas lipofílicas a partir de mejillones procesados* Durante el procesamiento de los moluscos existe una pérdida de agua, por ejemplo cuando se producen moluscos al vapor o en autoclave (conservas). El proceso al vapor en general resultará en una pérdida del 30% de agua y el autoclave en un 50%. Con el fin de corregir esta pérdida de agua y facilitar las etapas de homogenización y extracción, esta agua debe ser agregada al molusco procesado antes de aplicar el método analítico. Esto es necesario si la concentración de toxina determinada está relacionada con el límite regulatorio establecido para moluscos bivalvos frescos. 1.Mejillones en conserva a. Envasados en aceite, salsa, caldo y agua: Seguir el método oficial AOAC Si la proporción sólido/líquido es alta (Ejemplo mayor a 50/50) y/o si se obtiene una mezcla heterogénea, agregar agua. Tomar este factor de dilución en cuenta cuando se calcule la concentración total del producto. Realizar la extracción como lo indica el método (7.5.2) y luego de esta aplicar procedimientos adecuados de limpieza como SPE. Se deben incluir controles de calidad adecuados como por ejemplo determinar la recuperación y/o corregir el efecto de la matriz, si se hace necesario. b. Envasados en salmuera ( u otra salsa no comestible) Separar la carne del mejillón del líquido. Lavar el tejido del mejillón con agua, permitir que el mejillón se drene. Pesar el mejillón drenado. Reconstituir el tejido del mejillón a 50/50 tejido/agua con agua desionizada. Homogenizar el tejido y agua en conjunto. Realizar la extracción de acuerdo al método (7.5.2) Ejemplo: Para 100g de mejillón agregar 100g de agua Fórmula: Agua pesada = Mejillón pesado * 50/50 2.Mejillones cocidos al vapor Pesar el tejido de molusco. Reconstituir el tejido de molusco en 70/30 tejido/agua con agua desionizada. Homogenizar el tejido con el agua. Realizar la extracción de acuerdo al método (7.5.2). Ejemplo: Para 100g de molusco al vapor agregar 42.5g de agua Fórmula: Agua pesada = Molusco pesado * 30/70

23 Página de 3.Mejillones procesados (envasados en bolsas de vacío) Cuando se indique que no hay agua o salsa agregada, todo el líquido presente en la bolsa de vacío debe ser incluido en la muestra. Cuando los moluscos estén en su concha, el líquido debe ser guardado, los moluscos desconchados y se debe agregar el líquido antes de homogenizar. Realizar la extracción como lo indica el método (7.5.2) *Los procedimientos recién descritos pueden ser aplicados a especies de moluscos diferentes a mejillones, tomando en cuenta que se debe conocer la cantidad de agua perdida durante el procesamiento. En la actualidad, las pérdidas de agua durante el proceso de vapor y conserva para las otras especies de moluscos consideradas en el alcance de este método no están descritas.