Clase I. Generalidades en Microbiología Ambiental

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1 Clase I. Generalidades en Microbiología Ambiental Introducción La microbiología ambiental es el estudio de los microorganismos que existen en ambientes naturales o artificiales. El origen de los trabajos científicos en este campo se basan en las observaciones de Anthony van Lewenhoeck (1677). Los microorganismos existen como células aisladas o como agrupaciones celulares. Las células microbianas aisladas son capaces de llevar a cabo sus funciones vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción independiente de otras células. Además pueden alcanzar una elevada densidad poblacional en cultivos y son más fáciles de manipular para estudios genéticos, el descubrimiento de que el ADN constituye el material genético surgió de un estudio de transferencia genética en bacterias (1) Como ciencia biológica básica suministra herramientas más versátiles para determinar la naturaleza de los procesos característicos de la vida, Se ocupa de muchos problemas prácticos que son importantes en medicina, agricultura y la industria. Enfermedades importantes en humanos plantas y animales son causadas por microorganismos, desempeñan funciones importantes en la fertilidad de los suelos y en la producción animal, procesos industriales a gran escala se basan en microorganismos, este último condujo al desarrollo de la Biotecnología. En 1664 Robert Hooke descubrió los mohos, pero la primera persona que vió microorganismos en detalle fue Antonie van Leewenhoek. En el siglo XIX se pudo disponer de microscopios mejorados ampliando su uso y distribución. Figura 1. Microscopio de Robert Hooke (3) En 1676 Antony van Leeuwenhoek, contemporáneo de Hooke un pañero holandés sin formación científica, gran pulidor de lentes, consigue hacer del microscopio simple dotado de lente esférica una herramienta útil, describe las bacterias, a los que llama "animáculos" o pequeños animales. Escribió más de 300 cartas a la Royal Society de Londres y recibió la visita de Leibniz, que también creía en la vida microscópica. Figuras 3 y 4. Reseña histórica El progreso y el desarrollo de la ciencia de la microbiología tuvieron que esperar la disponibilidad de herramientas, técnicas y procedimientos que pudieran aplicar al estudio de estas pequeñas formas de vida. Aunque se sospechaba la existencia de organismos minúsculos su descubrimiento estuvo relacionado con la invención del microscopio. Los hermanos Jansen inventaron en 1590 el llamado microscopio compuesto. Constaba de un tubo con dos lentes convexas en cada extremo y ampliaba más que las lupas, que existían desde la Edad Media, aunque daba una imagen borrosa. En 1660 Robert Hooke publica su obra Micrografía, en la que hay reproducciones de sus observaciones hechas con microscopio compuesto, del tipo inventado por los hermanos Jansen. Figura 2. Antonie van Leewenhoek (3) LEOQ 1

2 por microbios. Impulsó el concepto de vacunación preventiva y estudió también las microorganismos positivos para la vida humana. En 1848 se describen las partes constitutivas del núcleo de la célula. En 1874 R. B. Tolles introdujo el uso de objetivos de inmersión que posibilitaron importantes descubrimientos. En 1882 Koch descubre el bacilo de la tuberculosis y en 1884, el vibrión del cólera. En 1884 Nicolaier descubre el bacilo del tétanos y Schaudinn el treponema de la sífilis. Figura 3. Microscopio de Leeuwenhoek (3). Durante el siglo XVIII, se introducen mejoras mecánicas y ópticas y se utilizan lentes acromáticas. Aparecen los primeros portaobjetivos tipo revolver. En este período los microscopios conjugan funcionalidad y diseño. A esta época pertenecen el "Microscopio variable" de George Adams y el "Microscopio compuesto". Durante las dos últimas décadas del siglo e inicios del siguiente Santiago Ramón y Cajal realiza importantes descubrimientos sobre las neuronas. En 1906 en compañía de Camilo Golgi reciben el Premio Nobel por trabajos científicos fundamentados en observaciones microscópicas realizadas mediante el teñido de muestras. Siglo XX Se introducen técnicas especiales: contraste de fase y ultramicroscopio y, utilizando óptica especial, se usan microscopios de luz ultravioleta en los que la menor longitud de onda mejora el poder resolutivo. Ernst Ruska y Max Knoll construyen en 1931 el primer microscopio electrónico. Funciona mediante bombardeo de electrones sobre la muestra. La imagen resultante aún es inferior a la que ofrecen los microscopios convencionales. a) b) Figura 4. Microscopios del s XVIII. a) Microscopio variable. b) Microscopio compuesto (4). Siglo XIX Louis Pasteur ( ) se ayuda del microscopio para demostrar que las infecciones son producidas Figura 5. Primer microscopio electrónico (4). James Hillier consigue un microscopio electrónico que supera a los convencionales en Se pasa de 2000 aumentos a Con los años, el propio LEOQ 2

3 Hillier contribuiría a construir aparatos con una capacidad de 2 millones de aumentos. Una dimensión totalmente fuera de las posibilidades de los microscopios tradicionales Se desarrolla el microscopio electrónico de barrido. Tornillo Macrométrico: Tornillo de paso largo y por el cual se ejecutan desplazamientos grandes amplios y perceptibles a simple vista. Tornillo Micrométrico: En contraposición al anterior su paso es pequeñisimo y sus desplazamientos imperceptibles, debe usarse con sumo cuidado G. Binnig y H. Rother, desarrollan el llamado microscopio de efecto túnel. Con esta tecnología se observan los átomos individualizados por primera vez G. Binnig y H. Rother, desarrollan el llamado microscopio de fuerza atómica S. Chou y P. Krauss consiguen, mediante el efecto túnel, realizar la grabación de datos de mayor densidad conocida: 65 gigabits por centímetro cuadrado. Descripción de las partes del Microscopio Parte Mecánica Pie base o soporte basal: Es una pieza maciza y pesada para asegurar la estabilidad del aparato y servir de soporte a sus demás partes. Platina: Pieza metálica redonda o cuadrada donde se colocan las preparaciones; tiene en el centro una abertura circular por la que pasan los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación. La preparación se sujeta a las platinas fijas, con dos palanquitas móviles. Tubo: En el esta instalado el sistema óptico, constituido por dos tubos o cuerpos, son corrientes hoy en dia los binoculares que facilitan la visión con los dos ojos. Revolver: Pieza circular y giratoria en la que se insertan los objetivos. Brazo o soporte vertical: Parte por la cual debe asirse el microscopio para llevarlo de un lugar a otro. Carro o escuadra,pinzas: Parte mecánica accionable mediante dos tornillos que permiten movimientos laterales o longitudinales para colocar la preparación en posición de observación. Figura 6. Microscopio óptico (Nikon.usa) (4) Parte Óptica Objetivos: Son los elementos más importantes del microscopio, se coloca cerca del material u objeto que se va a ver, formados por la reunión de varias lentes para corregir las aberraciones. Deben tratarse con mucho cuidado cualquier golpe puede variar la posición de las lentes y averiarlas. Se atornillan en el revolver. Son de dos clases, a) En seco, son los más empleados, entre la lente frontal y el porta objetivos solo hay aire, pertenecen los objetivos 10X y 40X, b) se llaman así porque debe interponerse entre la lente frontal y le preparación un líquido como por ejemplo aceite de inmersión. El aceite permite que entre más luz en el objetivo. Oculares: Los forman dos lentes separados por un diafragma y van montados en la extremidad superior del tubo, esta ubicado cerca del ojo del observador y produce un aumento secundario de la imagen creada por el objetivo. La lente superior se llama lente ocular; la inferior lente de campo. Sistema de Iluminación LEOQ 3

4 Se encuentra situado bajo la platina y tiene la misión de iluminar los objetivos por medio de la luz transmitida, consta de: Diafragma: Va montado bajo la platina y permite graduar la fuente luminosa; el más usado es el tipo iris accionable mediante manecilla lateral. Condensador: Sistema de lentes cuya función es condensar el haz de rayos luminosos, al enfocar la luz sobre el objeto permite una iluminación más uniforme del campo microscópico. Actualmente casi todos los microscopios utilizados en microbiología son microscopios de luz compuestos; es decir, utilizan una serie de lentes para amplificar los objetos. Clases de microscopios -Microscopio de Campo Claro: Llamado también de luz brillante o convencional, la zona de observación esta intensamente iluminada, mientras que los objetos iluminados aparecen oscuros. La sombra resultante se amplifica y observa. Así la imagen aparece como un objeto sombreado en un campo brillante (fondo) - Microscopio de Campo Oscuro: La observación se realiza sobre un fondo negro en el que se destacan los objetos brillantemente iluminados, la imagen aparece brillante contra un fondo oscuro, para esto el microscopio óptico debe tener un condensador especial que dirige el paso del haz de tal manera que solo penetran en el objetivo. El haz de luz se dirige sobre el objeto desde los lados, se amplifica y observa la luz reflejada del objeto. La única luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que, al ser dispersada por la muestra, incide sobre el objetivo. La resolución es bastante alta, y puede observarse en ellos objetos difícilmente visibles en M. de Campo claro y de M. de contraste de fases Este tipo de microscopia es útil particularmente para observar el movimiento de los microorganismos, porque no necesita tinción, dado que los penachos de flagelos suelen poder resolverse por esta técnica. -Microscopio de Fluorescencia: Se utiliza para analizar muestras capaces de emitir fluorescencia; esto es capaces de emitir una determinada longitud de onda. Algunos compuestos químicos absorben la energía de las ondas ultravioleta y la emiten como ondas visibles de mayor longitud. Uno de estos cuerpos puede aparecer de un color a la luz ordinaria y de un color completamente diferente a la luz ultravioleta. Dichos compuestos se llaman fluorescentes y el fenómeno recibe el nombre de fluorescencia. Determinadas células poseen sustancias capaces de fluorescer, como por ejemplo las clorofilas, o por haber sido tratadas con un colorante fluorescente. -Microscopio de luz ultravioleta: La microscopia ultravioleta permite una resolución algo mejor y por consiguiente, mayor amplificación que la que se obtiene con el microscopio óptico corriente. La razón de esto es que la radiación ultravioleta tiene menor longitud de onda que la luz visible ( nm frente a nm). Como se deduce de la fórmula para calcular el poder de resolución, este empleo duplica aproximadamente el poder que se obtiene con el microscopio de campo claro. La ventaja principal es que hace visible la absorción específica de algunas sustancias. La absorción característica en el ultravioleta de ciertos cuerpos permite su localización, diferenciación y determinación en preparaciones adecuadas aún en estado vivo. Como las radiaciones ultravioleta son invisibles, las imágenes se hacen visibles recogiéndolas en una emulsión fotográfica, utilizando un tubo convertidor de imagen o presentándolas en una pantalla de televisión después de recogerlas en un fototubo sensible al ultravioleta. -Contrate de Fases: Se desarrollo para poder incrementar las diferencias de contraste entre las células y el medio que las rodea, lo que permite su visualización sin necesidad de tinción. Emplea iluminación regulada de la preparación, lo que se realiza por un sistema objetivo de contraste de fases especial, y un condensador acoplado al microscopio óptico ordinario. Se basa en el hecho de que las células poseen diferente índice de refracción que el medio, y por lo tanto producen un desvío en los rayos de luz que las atraviesan. La luz al pasar de un medio a otro de densidad ligeramente diferente, experimenta una desviación o refracción, de su dirección primitiva (con el microscopio de campo claro no se pueden hacer perceptibles a la vista las ligeras variaciones de espesor o densidad, o de índice de refracción, aunque se produzcan pequeñísimas desviaciones en las ondas incidentes que atraviesan el material de observación). El conjunto óptico de contraste de fases transforma las desviaciones de las ondas incidentes en las correspondientes variaciones de luminosidad. Se usa habitualmente en investigación porque permite la observación en montajes húmedos (en los que la muestra permanece viable o células vivas). No se necesita tinción y se puede LEOQ 4

5 observar el movimiento de los componentes celulares. -Microscopio Electrónico: Funciona mediante bombardeo de electrones sobre la muestra. Emplea ondas de electrones y campos magnéticos para producir la imagen, luego es proyectada sobre una pantalla. La Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) permite obtener imágenes de la superficie con un gran grado de detalle y profundidad de foco. Tiene la ventaja de su enorme amplificación, porque a causa de la pequeñísima longitud de onda del haz de electrones que utiliza para amplificar el objeto, puede aumentar 100 veces el poder de resolución del microscopio óptico. Un cátodo acelera electrones con un potencial de v, como son fácilmente absorbidos en el aire deben viajar en el vacío. Un condensador magnético entre el cátodo y la muestra alinea los electrones, así que estos pasan uniformemente a través de la muestra. Las diferencias de densidad hace que algunos electrones sean absorbidos por la muestra. Una vez pasan los electrones son deflectados por un objetivo magnético similar al de las ondas de luz pasando a través del objetivo óptico, un proyector intermediario de imagen aumenta una porción de los electrones. Los electrones no pueden verse directamente pero producen una imagen visible sobre una cámara fluorescente como un tubo de televisión. La muestra debe montarse en una delgada película con propiedades de absorción de electrones, se cubre con oro y otro metal para dar un fuerte contraste. La longitud de onda de los electrones es más corta que la de la luz. Ver figura 5 y 7. Limitaciones: a) Las células no pueden observarse en estado vivo y en actividad. b) No se proporciona ninguna indicación sobre la naturaleza química de las estructuras que revela. -Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) proporciona información sobre las estructuras cristalinas presentes en superficie. En su versión de alta resolución (HRTEM) permite visualizar os átomos en sus posiciones, dislocaciones, bordes de grano, etc. Los métodos de microscopia electrónica se complementan con analizadores de los rayos X emitidos durante el examen microscópico (EDX), que son característicos de cada elemento. Esto permite completar la imagen con un análisis de su composición química. -Microscopio de fuerza atómica: Similar al del efecto túnel. La aguja entra en contacto con la muestra y detecta los efectos de las fuerzas atómicas. La resolución es similar al del efecto túnel pero sirve para materiales no conductores, como muchas muestras biológicas. -Microscopio de efecto de tunel: Dispone de una aguja tan afilada que en su extremo sólo hay un átomo. Esta punta se sitúa sobre el material y se acerca hasta la distancia de 1 nanómetro (10 a la menos 9 metros). Una corriente eléctrica débil genera una diferencia de potencial de 1 voltio. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la topografía atómica de la muestra. (Microscopio de Efecto Túnel de Barrido: STM, Microscopio de Fuerza Atómica AFM) permiten reconstruir imágenes de la superficie átomo a átomo, e incluso trasladarlos de posición.. En consecuencia, el concepto de superficie es tan preciso como se quiera, desde la primera capa de átomos a un espesor de recubrimiento de varias micras. El conocimiento aportado por las técnicas modernas no solo permite identificar los agentes de los cambios de comportamiento sino visualizar determinados procesos como el crecimiento de capas o el rozamiento entre superficies. Propiedades de las lentes Las amplificaciones de las lentes objetivo y ocular proporcionan la amplificación total del microscopio compuesto. El aumento máximo que en la mayoría de las condiciones se puede obtener es cercano a 100 veces 100X; y la mayoría tienen lentes objetivos que amplifican (10X, 40X y 100X), montados en el revolver o pieza giratoria o nasal; la mayor parte de los lentes oculares amplifican 10X. Así utilizando el ocular 10X con objetivos varios, se obtienen amplificaciones totales de 100X (10x10), 400X (40x10) o 1000X (10x100). Generalmente para mcroorganismos se usan aumentos de 1000X. Porque no usar un ocular de 50X o 100X para obtener amplificaciones de 50000X y 10000X, y así sucesivamente? Teóricamente, sí podría hacerse; sin embargo con ello no se logra nada, porque esta amplificación no muestra detalles adicionales. La razón es el poder de resolución (capacidad de distinguir entre dos objetos adyacentes). LEOQ 5

6 Poder de Resolución: El aumento util de un microscopio esta limitado por el poder de resolución, que es la capacidad de producir imágenes distintas de dos puntos adyacentes (puntos significa aquí dos objetos o detalles de un objeto). El poder de resolución de un microscopio óptico está determinado por la longitud de onda de la luz y por una propiedad del objetivo y de la lente condensador, conocida como apertura numérica (AN). El poder de resolución de un microscopio óptico se calcula utilizando la siguiente fórmula: Poder de Resolución = la utilidad de la ampliación que se obtiene; y obviamente, cuanto más corta sea la longitud de onda de la luz empleada y más grande la NA del lente, mayor será el poder de resolución del microscopio. La longitud de onda media de la luz visible que se usa en los microscopios ópticos es de 0.5 µm. El poder de resolución máximo que se puede obtener con lentes comunes es de cerca de la mitad de longitud de las ondas de luz o aproximadamente 0.25 µm, de acuerdo al ejercicio anterior. La relación entre longitud de onda y poder de resolución se muestra en la Figura 7. Longitud de Onda de la Luz AN del objetivo + AN del condensador A partir de esto se puede ver que el poder de resolución puede aumentarse bien sea disminuyendo la longitud de onda de la luz, bien sea aumentando la AN. La escala de luz visible esta entre nm. Del mismo modo, el grado en que pueden alterarse los objetivos es ilimitado; la máxima AN para el objetivo de luz en seco es aproximadamente de 0.85 y para el de inmersión en aceite es ligeramente mayor de (1.2 a 1.4). Para ilustrar esto mejor, pensemos que la longitud de onda que estamos utilizando es Esta longitud de onda puede seleccionarse utilizando un filtro verde. El objetivo de inmersión en aceite utilizado tiene una apertura numérica de 1.25 y el condensador de 0.9. Sustituyendo estos valores en la ecuación indicada arriba, tenemos que: Poder de resolución = 0.55/ = 0.255µm. Un poder de resolución de µm significa que si dos puntos están separados menos µm, aparecerán como un solo punto. Deben estar separados más de µm para aparecer como dos objetos distintos. Un aumento en exceso del poder de resolución, no desempeña ninguna función útil. Además el poder de resolución en principio depende de la longitud de onda de la iluminación que se utilice. Esta relación se define de acuerdo a la siguiente formula: Poder de resolución = longitud de onda de la luz NA Donde NA es la apertura numérica de la lente. Cuanto mayor sea el poder de resolución, mayor es Figura 7. Efecto que la longitud de onda de la fuente de radiación tiene sobre el poder de resolución de un microscopio. a) La luz visible no detecta objetos menores de 0.25 µm, con ésta por ejemplo no se pueden ver las fimbrias, los virus o los espacios entre dos bacterias. B) El rayo de electrones si detecta la fimbria, los virus y el espacio entre las dos bacterias. La microbiología como ciencia no se desarrollo hasta la última parte del siglo XIX, esto debido a que además del microscopio fue necesario idear otras técnicas para el estudio de los microorganismos, su desarrollo como ciencia independiente se debe a que respondió interrogantes como Existe la generación espontánea? Y Cuál es la causa de las enfermedades infecciosas? A dicho desarrollo contribuyo Pasteur cuando demostró que la vida no se originaba espontáneamente y que las bacterias que aparecían en los alimentos putrefactos se deben a la presencia en el aire de estas. LEOQ 6

7 Esto lo tuvo que defender creando otro experimento con un matraz en cuello de cisne y sometiendo a fuego el liquido, de manera que permanecía estéril, no se descomponía, ni aparecía microorganismos, este experimentó bastó para aclarar de modo definitivo la controversia acerca de la generación espontánea. Aunque Pasteur tuvo éxito John Tyndall y Ferdinand Cohn descubrieron que la esterilización no era suficiente esto ocurría debido a la presencia de endosporas estructuras termorresistentes dentro de las células de cultivos viejos de Bacillus. Robert Koch en publico un trabajo sobre carbunco, una enfermedad del ganado que en ocasiones también afecta el hombre causada por una bacteria que formadora de esporas Bacillus anthracis. En comenzó a estudiar la tuberculosis Koch empleó todos los métodos desarrollados anteriormente: microscopia, tinción de tejidos, aislamiento en cultivos puros e inoculación en animales. El Mycobacterim tuberculosis es muy difícil de teñir por lo que Koch desarrollo la coloración de Ziehl-Nielsen, usada hoy para teñir bacterias ácido alcohol reistentes, en anunció su descubrimiento, por este trabajo le fue otorgado el premio nobel en 1.905, justo cinco años antes de su muerte. También se le atribuye el descubrimiento del Vibrio cholerae así como la importancia de la filtración de aguas en el control de esta enfermedad. Durante el siglo XX han ocurrido grandes cambio: avances en el campo de la microbiología medica e inmunología en la primera parte del siglo, otros avances se han registrado en el campo de la microbiología agrícola. Posteriormente los estudios para microbiología del suelo aportaron descubrimientos sobre usos importantes de los microorganismos tales como la formación de antibióticos y productos industriales abriendo el campo de la microbiología industrial después de la segunda guerra mundial. Finalmente la microbiología del suelo sentó bases sólidas para la microbiología acuática estudio de procesos microbianos que ocurren en lagos, ríos y océanos. para el tratamiento de residuos, muchos de los cuales son microbianos, por ello se desarrollado la microbiología sanitaria. Para suministrar agua potable adecuada se han establecido métodos que eliminan las bacterias peligrosas de las redes de agua. Hacia finales del siglo XX todas estas subdisciplinas se han unido en un área llamada ecología microbiana, como conceptos aplicados, también se han desarrollado los conceptos básicos de la función microbiana. En la primera parte del siglo los avances fueron el descubrimiento de nuevas bacterias y su clasificación lo cual requirió conocer los nutrientes y productos que se forman dando lugar a la fisiología microbiana así como a el estudio de las enzimas y de las reacciones químicas que dirigen, bioquímica microbiana. En cuando se descubrió el intercambio genético en bacterias, se consolidó como campo de estudio la genética bacteriana. El desarrollo de estos campos permitió a principios de los 70s, un conocimiento avanzada del ADN, ARN y la síntesis de proteínas. Surgió la Biología Molecular debido en gran parte por el estudio con bacterias. El estudio de los virus es otro avance, principalmente por los virus que infectan bacterias bacteriófagos. Estos avances permitieron manipular el ADN bacteriano e introducir ADN de origen exógeno en bacterias y controlar su replicación. Técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos usadas en el establecimiento de relaciones filogenéticos en procariotas, permitiendo conocer la historia evolutiva de los microorganismos. Ver Figura 8. Una rama se centra en el estudio de procesos capaces de suministrar agua saludable a la sociedad. El manejo de desperdicios, especialmente desechos domésticos requiere el desarrollo de procesos de ingeniería a gran escala LEOQ 7

8 Figura 8. Arbol filogenético Universal, construido ha partir de la comparación de las secuencias de los ARN ribosómicos16s y 18s (1). Estructura celular La célula es la unidad fundamental de toda la materia viva, aislada de otras células por una membrana (celular) citoplasmática que separa el exterior del interior celular, a través de ella entran y salen nutrientes, es muy fina y necesita de una pared celular para protección y darle firmeza, las células animales por ejemplo no tiene pared celular dentro de ella hay materiales químicos y se halla el núcleo o nucleoide donde esta la información genética y una complicada mezcla de sustancias y estructuras llamada el citoplasma, donde se encuentra la maquinaria para el crecimiento y el funcionamiento celular. Ver Figura 9. Todas las células contiene proteínas, ácidos nuclicos, lípidos y polisacáridos, denominadas macromoléculas. Células procariotas y eucariotas Se ha puesto de manifiesto dos tipos básicos de células estructuralmente diferentes. Procariotas y Eucariotas. Ver Figura 9 y 10. Las eucariotas tiene un núcleo que encierra varias moléculas de ADN y se divide por mitosis al contrario de la región nuclear llamada nucleoide de las procariotas, no esta rodeada por una membrana, consta de una sola molécula de ADN, su división no es mitótica. Además del núcleo, las eucariota contienen estructuras internas rodeadas por membrana como LEOQ 2

9 las mitocondrias y cloroplastos, también poseen un citoesqueleto. A partir de estudios sobre secuencias de RNA ribosómico se pueden definir tres linajes celulares evolutivamente diferentes dos son procarióticos y uno es eucariótico. Las procariotas representan dos ramas evolutivas o grupos: Bacteria y Archaea. El eucariótico es Eukarya, existen varios grupos de microorganismos eucarióticos: algas, hongos y protozoos, además las formas pluricelulares de vida (plantas y animales) están formadas por células eucarióticas. Ver Figura Christon J. Hurst., et al. Manual of Envoronmental Microbiology. Second Edition. ASM Press, Washingto, D.C. 2002, páginas Pelczar J. Michael. Elementos de Microbiología Ed. Mc Graw-Hill México. Pg Brock Madigan. Biología de los microorganismos. Prentice Hall, Madrid Octava Edición. Pg En línea: 4. Consulta en Febrero del vo.htm. Consulta en Febrero de owth/mgdirect.html Consulta en Mayo de Figura 9. Célula procariótica (6). Figura 10. Célula eucariota (6). Referencias LEOQ 2