Escuela Universitaria de Ciencias de la Salud. PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA y SALUD PÚBLICA.

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1 Escuela Universitaria de Ciencias de la Salud PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA y SALUD PÚBLICA. DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS Día 1: Día 2: Recogida de muestras. Medios de cultivo. Tipos de Siembra Observación macroscópica y microscópica de bacterias y levaduras. Antibiograma Día 3: Lectura e interpretación del antibiograma. Interpretación crecimiento de levaduras en medio de cultivo cromogénico. 1

2 TEORIA Para un estudio microbiológico, lo primero y más importante es la recogida de una buena muestra, ya que de esto va a depender que los resultados obtenidos sean exactos. 1.- Recogida de la Muestra. Normas generales 1. La muestra debe recogerse antes de la implantación de una terapia de antimicrobiana. Ya que la presencia de antibiótico puede falsear una posible infección. 2. Hay que tener en cuenta el estadio de la enfermedad, así la toma de sangre para hemocultivo debe realizarse cuando está subiendo la fiebre, ya que éste es el momento en el que hay más posibilidad de encontrar microorganismos en sangre y en mayor cantidad. 3. En algunas muestras se necesita la colaboración activa del paciente, por ej. Esputo. 4. La muestra debe tomarse en cantidad suficiente y ser representativa de la lesión. 5. Debe ir acompañada de una orientación clínica, para realizar el procesamiento adecuado en cada caso. 6. La rapidez de la entrega de la muestra al laboratorio es fundamental, ya que algunos microorganismos son muy sensibles y puede que mueran o sean enmascarados antes de ser procesadas la muestra. Ej. Shigella es inhibida en poco tiempo por el resto de la flora intestinal. 7. Rotulación de la muestra para evitar errores en la manipulación. Supervisión del médico!! Normas especiales Dependen del tipo de muestra. LCR: Debe ser enviado inmediatamente al laboratorio, sobre todo si se sospecha una meningitis meningocócica, ya que éste germen tiende a lisarse. Incubación a 37ºC hasta su cultivo, igual que la sangre. Orina: Micción espontánea. Debe recogerse la primera de la mañana, después de un lavado de los genitales para evitar la contaminación con gérmenes que constituyen la 2

3 flora normal de piel. Debe desecharse la primera porción de la micción, así eliminamos los gérmenes que podrían encontrarse en uretra y que darían lugar a resultados erróneos. La orina debe enviarse rápidamente al laboratorio ya que, al ser un excelente medio de cultivo, los microorganismos como por ejemplo E. coli se pueden multiplicar rápidamente, y para cuando la muestra vaya a ser procesada haber alcanzado una concentración en orina compatible con la aceptada para el diagnóstico de infección del tracto urinario ( 10 5 unidades formadoras de colonias/ml), cuando en el momento de la recogida de la muestra la concentración era muy inferior a esta cifra. En caso de que no pueda ser enviada al laboratorio inmediatamente, mantener a 4º C, pues a esta temperatura las bacterias no se multiplican. 2.- Medios de cultivo Se denomina medio de cultivo a todos aquellos sustratos sólidos, líquidos o semisólidos que favorecen y permiten el desarrollo de los microorganismos en el laboratorio. Composición 1. Elementos básicos: Carbono. Normalmente lo proporcionan los azúcares. Hidrógeno y oxígeno. Nitrógeno. Lo proporcionan las peptonas y aminoácidos 2. Oligoelementos. Son el Na, K, Fe, Mg, Mn, etc. que se administran al medio en forma de sales. ClNa actúa regulando la presión osmótica. Extracto de carne. Constituye una de las bases más importantes del medio de cultivo por su riqueza nutritiva. Extractos de levadura. Es un factor de crecimiento importante para la mayoría de los microorganismos incluso para los más exigentes. Clasificación 1. Según su estado físico: Medios líquidos: Favorecen el crecimiento de microorganismos pero no pueden utilizarse para el aislamiento de gérmenes y la obtención de colonias, sino para observar 3

4 el tipo de respiración; aerobios estrictos, anaerobios estrictos, microaerófilos y anaerobios facultativos. Medios sólidos: Llevan en su composición una sustancia solidificante que es el agar. Es una sustancia polisacarídica, obtenida de algas marinas y cuya propiedad fundamental es la de formar gel. La gelatina también es una sustancia solidificante, en este caso de naturaleza proteica, pero tiene el inconveniente de que algunos gérmenes actúan sobre ella licuándola por la acción de enzimas proteolíticos producidos por los mismos. Las sustancias solidificantes se añaden al medio en una proporción del 1-2%. 2. Según el crecimiento bacteriano que permitan. Medios enriquecidos. Son aquellos que contienen una serie de sustancias que favorecen el crecimiento de todos los microorganismos: Columbia. Medios de enriquecimiento. Son aquellos que llevan un sustrato determinado para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos: Caldo Selenito. Medios selectivos y diferenciales. Son aquellos que llevan sustancias inhibitorias que impiden el crecimiento de determinados microorganismos. Ej. Levine, MacConkey Infecciones fúngicas Para poder establecer la etiología de las micosis, al igual que sucede con la mayoría de las enfermedades infecciosas de etiología bacteriana, se utilizan principalmente técnicas de diagnóstico directo, bien por el aislamiento del hongo causal o mediante la detección de alguno de sus componentes estructurales. En la mayoría de los casos el diagnóstico microbiológico se realiza mediante cultivo, a partir de muestras clínicas adecuadas. Las levaduras del género Candida constituyen la principal causa de micosis invasivas. La especie que con más frecuencia se aísla a partir de muestras clínicas es C. albicans, pero otras especies, tales como C. glabrata, C. tropicalis. C. parapsilosis, C. krusei, C. guillermondi y C. dublinensis, también se aíslan con relativa frecuencia. Candida spp. crece bien en los medios de cultivo que habitualmente se utilizan en bacteriología, dando lugar a colonias de crecimiento rápido (18-24h), circulares, lisas, blaquecinas, muy parecidas a las de las bacterias. La apariencia macroscópica de las distintas especies de Candida es muy uniforme y lo mismo sucede con su aspecto 4

5 microscópico. Con la tinción de Gram, aunque no es una tinción para hongos, se tiñen como los Gram positivos de color violeta. La identificación a nivel de especie tiene importancia ya que sirve para orientar el tratamiento empírico hasta que se disponga de los datos de sensibilidad a los antifúngicos. Para ello se pueden utilizar medios diferenciales cromogénicos en los que las especies C. albicans, C. tropicalis y C. krusei se identifican porque crecen dando lugar a colonias con colores característicos. Las otras especies dan lugar a colonias con diversas gamas de colores que no permiten su identificación, por lo que es necesario realizar pruebas adicionales como asimilación de distintos azúcares y otros compuestos. 4.- Antibiograma El antibiograma es el método usual para determinar la sensibilidad in vitro de un microorganismo frente a los antimicrobianos. El estudio de la sensibilidad antimicrobiana de las bacterias es necesario porque el espectro de actividad de los antimicrobianos es limitado y las bacterias tienen capacidad para desarrollar resistencia. Para ello es necesario conocer los conceptos concentración mínima inhibitoria (CMI), que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas, y concentración mínima bactericida (CMB) que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en unas condiciones normalizadas. El estudio de la CMI es el que se realiza de forma habitual en los laboratorios de microbiología. Para llevarlo a cabo se utilizan procedimientos de referencia y cepas control que proporcionan a estos métodos unos resultados reproducibles, comparables y que permiten clasificar los microorganismos en diferentes categorías: a) sensible: Cuando la CMI de un antibiótico para una bacteria se puede conseguir in vivo con dosis terapéuticas y la experiencia ha demostrado su eficacia b) resistente: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener. c) intermedio: Cuando las bacterias se inhiben a concentraciones que no se alcanzan con dosis terapéuticas, pero que pueden alcanzarse con dosis más altas sin que sean tóxicas ó cuando el antibiótico se encuentra a altas concentraciones en el lugar de la infección, generalmente en las vías de eliminación. 5

6 El medio de cultivo en el que se realizan la mayoría de los antibiogramas (excepto para bacterias exigentes) es el medio Muëller-Hinton (extracto de carne, aminoácidos y almidón. Este medio se puede usar en estado líquido o sólido. Métodos 1.- Difusión en agar, que se puede realizar: a) disco-placa. Con este sistema se puede probar la eficacia de varios antimicrobianos al mismo tiempo realizando una siembra de una suspensión bacteriana, con un inóculo normalizado sobre la superficie de un medio sólido, colocando sobre la misma discos de papel impregnados de una cantidad conocida de antibiótico. Por el agua del medio los antimicrobianos difunden y se crea un gradiente de concentraciones decrecientes a medida que nos alejamos del disco. Tras un periodo de incubación se obtiene, alrededor del disco, una zona de inhibición del crecimiento bacteriano. La valoración del halo se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el diámetro del halo de inhibición y la carga del antibiótico del disco. Los resultados se expresan en términos de categoría clínica (S, I, R). Es un método sencillo y útil para determinar la sensibilidad de microorganismos de crecimiento rápido, no se debe usar en bacterias de crecimiento lento y anaerobios. Es el método que vamos a utilizar en las prácticas. b) test epsilon (E test). Es un método que utiliza tiras de plástico que contienen un gradiente de antibiótico para la determinación cuantitativa de la sensibilidad o resistencia de los microorganismos. El fundamento es el mismo que el del método disco-placa. Es una técnica sencilla que puede ser utilizada en la mayoría de los microorganismos (aerobios, anaerobios y levaduras) Dilución. Son los métodos cuantitativos de referencia para determinar la sensibilidad y resistencia de las bacterias. Consiste en determinar el crecimiento de una bacteria en presencia de concentraciones crecientes de un antibiótico. Se pueden realizar en medio sólido o líquido; este último en forma de macrodilución en tubo o microdilución en placas de plástico con múltiples pocillos. En los medios líquidos, cuando las bacterias se multiplican aparece turbidez, pero cuando el antibiótico inhibe el crecimiento el medio no se vuelve turbio; la dilución del antibiótico correspondiente al 6

7 primer tubo o pocillo en que no existe crecimiento es la CMI. A partir de los tubos, donde no hay crecimiento se puede determinar la CMB, resembrando el contenido de estos tubos sobre un medio de cultivo y observando si existe o no desarrollo de colonias Métodos mecanizados y automatizados La introducción de estos sistemas ha relegado a los métodos anteriores en el uso cotidiano del laboratorio de microbiología. La mayoría emplea sistemas de microdilución y la lectura se hace determinado el crecimiento bacteriano por espectrofotometría y nefelometría. La lectura se realiza de forma automática o semiautomática y puede ofrecer la información en forma de CMI o definir si la bacteria es sensible, resistente o intermedia. En todos estos sistemas la interpretación de los resultados la realiza un ordenador que llevan incorporado. La determinación de la sensibilidad de bacterias como micobacterias, treponemas, clamidias, micoplasmas y rickettsias, por tratarse de microorganismos con unas características muy especiales, requieren técnicas complejas. Lectura e interpretación del antibiograma: Con una regla milimetrada se miden los diámetros de los halos de inhibición que aparezcan alrededor de los discos de antimicrobianos. Los resultados se comparan con unas tablas en las que se correlacionan diámetros de halo con categorías clínicas (S, I, R). 7

8 PRÁCTICA DIA 1 Muestras que se van a procesar en las prácticas: Frotis nasal. Subcultivo de Candida spp. en medio cromogénico diferencial. Medios que se usan en la práctica. Columbia: Está compuesto de extracto de carne, extracto de levadura, peptonas, glucosa, NaCl y sangre (ésta favorece el crecimiento de microorganismos. patógenos para el hombre). Tioglicolato: Medio semisólido compuesto de Cistina (aminoácido azufrado que actúa con función reductora) tioglicolato, agar y resazurina que se colorea de rosa en presencia de oxígeno. Este medio sirve para conocer si los microorganismos son aerobios estrictos, anaerobios estrictos, microaerófilos o anaerobios facultativos. Chromagar: medios diferenciales cromogénicos en los que las especies diferentes especies de Canddida spp. se identifican porque crecen dando lugar a colonias con colores característicos. Inoculación o Siembra: * Tioglicolato: Una vez tomada la muestra con la torunda, introducirla en el tubo hasta el fondo y sacarla. Flamear la boca del tubo antes y después de introducir la torunda. * Columbia: En el borde de la placa, hacer la inoculación con la torunda, haciendo estrías muy juntas hasta cubrir aproximadamente un tercio de su superficie. A partir de este punto y con el asa previamente esterilizada y enfriada continuar la siembra, tocando las últimas estría y realizando estrías en otra dirección más separadas (siembra por agotamiento). * Chromagar: siembra por agotamiento. TODOS LOS MEDIOS DE CULTIVO SERÁN INCUBADOS EN LA ESTUFA A 35ºC DURANTE 24 HORAS. Inicio siembra Esterilizar el asa 8

9 Observación macroscópica de colonias de levaduras en medio de Columbia. Subcultivo en medio cromogénico diferencial PRÁCTICA DIA 2 Antibiograma. Técnica de difusión con discos: Se prepara una suspensión bacteriana con una turbidez equivalente al 0,5 de McFarland en solución salina. Se introduce una torunda en dicha suspensión y con la torunda se hace una siembra en tapiz en la superficie del medio. Sobre ella se colocan los discos de antibióticos, que llevan una carga determinada. Se incuba a 37º C durante horas. Observación microscópica: 1.- Tinción de Gram Esta tinción nos sirve para clasificar a los microorganismos en dos grandes grupos, Gram positivos y Gram negativos. A la vez podemos observar la forma de las bacterias: cocos, bacilos, etc. y cómo se agrupan: parejas, cadenas, etc. Fundamento: La tinción permite dividir las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Se cree que la diferencia de espesor, la concentración de cargas y la composición química de la pared celular, son las responsables de la coloración final con la que permanecen las bacterias teñidas por este método. Las bacterias Gram positivas permiten que un colorante básico (violeta de genciana) se una a las estructuras de la pared, la membrana y el citoplasma; esta unión se refuerza con la adición de lugol. La acción decolorante del alcohol, se ve impedida por las características de la pared celular antes mencionadas de forma que la bacteria 9

10 permanece teñida con el colorante inicial; la adición de un segundo colorante (safranina) no modifica dicha coloración y la bacteria se observará con una tonalidad azul-violeta. En las bacterias Gram negativas, el alcohol arrastra al colorante inicial (por la distinta naturaleza de la pared celular) de manera que la adición de safranina tiñe finalmente la bacteria de color rojo. Técnica. Suspensión Extensión Fijación. Para que las proteínas queden fijadas al porta pasaremos el porta tres veces por la llama del mechero (fijación con calor). Dejar enfriar antes de teñir. Cubrir el porta con Violeta de genciana y dejar actuar 1 min. Lavar con agua. Lugol. Actúa de mordiente formando un complejo con el violeta de genciana que hace que se fije al colorante. 30 seg. Lavar con agua. Decolorar con alcohol seg. Lavar con agua para impedir que el alcohol siga ejerciendo su acción. Safranina. Colorante de contraste. 1 min. Lavar con agua. Secar. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. 2.- Examen en fresco: Se realiza colocando el material a estudiar entre porta y cubreobjetos, observándose posteriormente con objetivo de mediano aumento (40X) sin aceite de inmersión. Un hecho a tener en cuenta es que se trabaja con microorganismos vivos, por lo que se deben extremar los cuidados para evitar la contaminación. Procedimiento: 1. Depositar con el asa una gota de agua en el centro del porta. 2. Tocar con el asa estéril una colonia. 3. Resuspender el material recogido en la gota de agua. 4. Cubrir con el cubre. 5. Observar al microscopio con el objetivo de 40X. 10

11 PRÁCTICA DIA 3 Lectura del antibiograma Lectura de Cromogen 11

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