TESTOSTERONA LIBRE. Cat. DA-2924 VER.1

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1 TESTOSTERONA LIBRE Cat. DA-2924 VER.1 Inmunoensayo de la ima para la Determinación Cuantitativa de la Concentración de Testosterona Libre en Suero o Plasma Humano. Solo para diagnóstico In Vitro Para uso exclusivo de laboratorios clínicos o de gabinete Conservar entre 2 C a 8 C NOMBRES COMUNES Y DE PROPIEDAD Inmunoensayo de la ima de Testosterona Libre USO DESTINADO Para la determinación cuantitativa de la concentración de testosterona libre en suero o plasma humano. INTRODUCCIÓN La Testosterona, (17â-Hydroxy-4-androsterona-3-uno), un esteroide C19, es el andrógeno secretado naturalmente mas potente 1. En hombres normales en postpubertad, la testosterona es secretada primariamente por los testículos con solo una pequeña cantidad derivada de la conversión periperal de 4-Androsterona-3, 17-diona (ASD) 2. En mujeres adultas, ha sido estimado que cerca del 50% de la testosterona en suero se deriva de la conversión periperal de ASD secretada por los adrenales y ovarios, tomando en cuenta la secreción directa de testosterona por estas glándulas. En los hombres, la testosterona esta principalmente sintetizada en las células intersticiales de Leydig y en los testículos, y está regulada por la hormona estimulante de célula intersticial (ICSH), o la hormona Luteinizante (LH) de la pituitaria anterior (equivalente femenino de ICSH) 3. La testosterona es responsable para del desarrollo de las características sexuales secundarias, tales como los accesorios de los órganos sexuales, la próstata, las vesículas seminales y el crecimiento del vello púbico, facial y auxiliar. Las mediciones de testosterona han sido muy útiles en la evaluación de estados hipogonadales. El incremento de los niveles de testosterona en hombres puede ser encontrado en una completa resistencia andrógena (feminización testicular). Las causas comunes del decremento de niveles de testosterona en hombres incluye: hipogonadismo, orquidectomia, terapia de estrógeno, síndrome de Klinefelter, hipopituitarismo y cirrosis hepática 2-4. En las mujeres, los niveles de testosterona son normalmente encontrados a ser menores que aquellos encontrados en hombres sanos. Las testosterona en las mujeres tiene tres orígenes. Esta es secretada en pequeñas cantidades tanto por las glándulas adrenales y los ovarios, y en mujeres sanas el 50-60% de la producción de testosterona diaria proviene del metabolismo periferal de la prohormona, primordialmente androstenediona. Las causas comunes de la disminución en los niveles de testosterona en suero en las mujeres incluye ovarios poliquisticos (Síndrome Stein-Leventhal), tumores en ovarios, tumores adrenales e hiperplasia adrenal. La virilización en mujeres está asociada con la administración de andrógenos y endogenos en la sobreproducción de testosterona. Esto parece ser una correlación entre los niveles de testosterona en suero y el decremento de virilización en mujeres, a pesar de que aproximadamente 25% de las mujeres con decrementos variables de virilismo tienen niveles de testosterona en suero que caen dentro de los rangos de referencia femeninos. La testosterona se une a la mayoría de las proteínas de transporte; se une débilmente a la albumina y a la proteína de unión del cortisol (25-65% mujeres 45-85% varones) y se encuentra fuertemente unida a la hormona sexual globulina (SHBG) (mujeres 35-75% - varones 14-50%)8. Una pequeña fracción no unida existe como Testosterona libre, sin embargo esta forma es biológicamente activa. Por lo tanto, la concentración de hormona libre es un mejor indicador de la actividad biológica que la testosterona total. PRINCIPIO DE LA PRUEBA Ensayo Inmunoenzimático Competitivo (Tipo 7) Los reactivos esenciales requeridos por un análisis Inmunoenzimométrico incluyen el anticuerpo, conjugado enzima-antígeno y antígeno nativo. Una vez mezclado el anticuerpo biotinlado, conjugado enzima-antígeno y un suero que contienen el antígeno nativo, una reacción de la competición resulta entre el antígeno nativo y el conjugado enzima-antígeno para un número limitado de sitios atados de anticuerpo. La interacción es ilustrada por la ecuación seguida: Ag + Ag + Ab Btn k a k -a + Ab cw = Anticuerpo Inmovilizado Monoespecífico (Cantidad Constante) Ag = Antígeno Nativo (Cantidad Variable) Ag = ima-antígeno Conjugado (Cantidad Constante) = Complejo Antígeno-Anticuerpo Ag Ab Btn = Conjugado ima-antígeno-complejo Anticuerpo k a = Valor Constante de Asociación k -a = Valor Constante de Disociación K = k a / K -a = Equilibrio Constante Una reacción simultánea ocurre entre el biotina adjunta al anticuerpo y la estreptavidin inmovilizada en el micropozo. Este afecta la separación del anticuerpo atado a la fracción después de la decantación o la aspiración. Esta interacción esta ilustrada abajo: + Ag Ab Btn- + Estreptavidina cw Complejo Inmovilizado La actividad enzimática en la fracción del anticuerpo-limite es inversamente proporcional a la concentración del antígeno nativo. Utilizando di versas referencias del suero de los valores conocidos del antígeno, una curva de la reacción a cierta dosis puede ser generada de la cual la con- Distribuido por: DIAGNÓSTICA INTERNACIONAL S.A. de C.V. Rudyard Kipling 4886 Col. Jardines de la Patria CP Zapopan, Jalisco, México Lada sin costo: c/ 10 líneas Tel: 01 (33) c/ 10 líneas 1

2 centración del antígeno de un desconocido puede ser comprobada. REACTIVOS Materiales abastecidos con el equipo de prueba Calibradores Testosterona Libre - 1 vial c/u. Iconos A-G Siete viales que contienen suero de referencia para Testosterona Libre con concentraciones aproximadas de 0 (A), 0.2 (B), 1.0 (C), 2.1 (D), 5.6 (E), 13.8 (F) Y 37.5 (G) en pg/ml. Almacenar Un conservante se ha añadido. Los calibradores pueden ser expresados en concentración molar (pm/l) solo hay que multiplicarse por Por ejemplo: 1 pg/ml x 3.47 = 3.47 pm/l * Los niveles exactos están en Las etiquetas y pueden variar entre cada lote Reactivo de la ima de Testosterona Libre Un vial de Testosterona (Análoga)-Peroxidasa de rábano picante (HRP) en una matriz estabilizante de proteínas con colorante rojo. Almacenar Reactivo de Biotina Testosterona Libre Una botella de reactivo que contiene Testosterona Biotinilado anti-igg de conejo purificado conjugado en tampón, colorante amarillo y conservante. Almacenar Microplaca revestida de Estreptavidina - 96 pozos. Una microplaca de 96 pocillos recubiertos con 1.0 µg/ml de estreptavidina, envasada en una bolsa de aluminio con un desecante. Almacenar Solución de Lavado Concentrado Un vial que contiene un agente tensoactivo en solución salina tamponada. Un preservativo ha sido añadido. Almacenar Substrato A Un vial que contiene Tetrametilbencidina (TMB) en solución buffer. Almacenar Substrato B Un vial que contiene peróxido de hidrogeno (H2O2) en solución buffer. Almacenar Solución de Paro Un vial que contiene un ácido fuerte (1N HCl). Almacenar entre 2 y 30 C. INSTRUCTIVO NOTA 1: No utilice los reactivos después de la fecha de vencimiento del kit. NOTA 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) días cuando están almacenados en 2-8ºC. NOTA 3: Los reactivos son para una sola microplaca de 96-pozos. Materiales requeridos pero no abastecidos 1. Micropipetas de precisión de 20 µl, 50 µl y 100 µl 2. Dispensador para las entregas repetidas de ml y ml de volumen con una precisión de mejor de 1.5% 3. Dispensador de conjugado con volumen ajustable ( µl) 4. Lavador de Microplaca o una botella de apretón (opcional). 5. Lector de Micro placas capaz de leer absorbancia a una longitud de onda de 450nm y 620nm. (el filtro de 620nm es opcional). 6. Papel absorbente para retirar excesos de los pozos de la microplaca. 7. Plástico o cubierta de microplaca para los pasos de incubación. 8. Aspirador (opcional) para los pasos de lavado. 9. Timer 10. Materiales del control de calidad externos. PRECAUCIONES Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser no-reactivos para el antígeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer el aseguramiento que los agentes infecciosos están ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los Buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden encontrar en el centro para el control de enfermedad/el instituto nacional de la salud, Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos, 2da Edición, 1988, publicación No. (CDC) de HHS. RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION Los especímenes deben ser sangre, suero en tipo y tener las precauciones generales en la colección de muestras del venipunctura. Para la comparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno del suero de la mañana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo liso de venipunctura de tapón rojo sin aditivos o anticoagulantes (para suero) o tubos de evacuación contenidos con EDTA o heparina. Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las células. Las muestras se pueden refrigerar en 2-8 C por un período máximo de cinco (5) días. Si el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20 C por hasta 30 días. Evite congelar y descongelar. Cuando analice en duplicado, se requiere ml del espécimen. PREPARACION DE LOS REACTIVOS SOLUCION DE LAVADO. Diluir el contenido del concentrado de lavado con 1000 ml de agua destilada o desionizada en un contenedor adecuado. Almacénese a temperatura ambiente entre los C por no mas de 60 días. SOLUCIÓN DE TRABAJO SUSTRATO. Estable por 1 año. Vierta el contenido del frasco etiquetado con Solución A en el frasco etiquetado con Solución B. Mezcle y guarde a 2-8 C. Coloque la tapa amarilla sobre el frasco transparente para una fácil identificación. Mezcle y etiquete acordemente. Almacénese a 2-8 C. Nota: No se use el sustrato de trabajo si este se ve azul. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Antes de proceder con el análisis, traiga todos los reactivos, referencias del suero y controles a temperatura ambiente (20-27 C). 1. Saque los micropozos necesarios para cada suero de referencia, controles y muestras. Guarde los micropozos nuevamente dentro de la bolsa de aluminio, séllela y almacénela en 2-8 C. 2. Pipetee ml (20 µl) de los sueros de referencia, controles y muestras en los pozos correspondientes. 3. Agregue ml (50μL) de la solución del Reactivo de la ima Testosterona Libre a todos los pozos (Vea la Sección de Preparación de Reactivos). 4. Golpear suavemente uno de los extremos de la microplaca por segundos para mezclar. 5. Agregue ml (50μL) del Reactivo Biotina Testosterona Libre a 2

3 todos los pozos. 6. Golpear suavemente uno de los extremos de la microplaca por segundos para mezclar. 7. Cubra e Incube 60 minutos a temperatura ambiente. 8. Deseche el contenido de la microplaca por decantación o aspiración. Si decanta, después golpee ligeramente la placa seca con el papel absorbente. 9. Agregue 350μL de la solución de lavado (véase la sección de la preparación del reactivo), decántelo o aspírelo. Repita dos (2) veces adicionales para un total de tres (3) lavados. Un lavador automático o manual de placas puede ser utilizado. Siga las instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si se emplea una botella de apretón, llene cada micropozo bien, presionando el envase (evite burbujas de aire) para dispensar la solución de lavado. Decante y repita dos (2) veces adicionales. 10. Agregue ml (100μL) de la solución de Substrato a todos los pozos (véase la sección de la preparación el reactivo). Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias de tiempo de reacción entre los pozos. NO AGITE DESPUES DE ADICIONAR EL SUSTRATO 11. Incube en la temperatura ambiente por quince (15) minutos. 12. Agregue ml (50μL) de la solución de paro a cada pozo y mezcle suavemente por segundos. Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias del tiempo de reacción entre Los pozos. 13. Lea la absorbancia en cada pozo a 450nm (con una longitud de onda de referencia de nm para reducir al mínimo imperfecciones del pozo) en un lector del micro placa. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta (30) minutos de agregar la solución de paro. CALCULO DE RESULTADOS Una curva en la reacción se usa para comprobar la concentración de Testosterona Libre en especímenes desconocidos. 1. Registre la absorbancia obtenida del listado del lector del micro placas conforme al ejemplo Trace la absorbancia para cada referencia duplicada del suero contra la concentración correspondiente de Testosterona Libre en pg/ ml en el papel de gráfico lineal. (No promedie los duplicados de las referencias del suero antes de dibujar). 3. Conecte los puntos y dibuje la mejor curva a través de los puntos trazados. 4. Para determinar la concentración de Testosterona Libre para un desconocido, localice la absorbancia media de los duplicados para cada desconocido en el eje del gráfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la concentración (en pg/ml) del eje horizontal del gráfico (los duplicados del desconocido se pueden hacer un promedio según lo indicado). En el siguiente ejemplo, el promedio de absorbancia (1.367) intersecta la curva de respuesta en (1.67 pg/ ml) la concentración de Testosterona libre. (vea la figura 1). PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD Para que el ensayo sea válido, se deben considerar los siguientes criterios: 1. La absorbancia (OD) del calibrador 0 pg/ml debe ser Cuatro de los seis pool de control de calidad deben estar dentro de los rangos establecidos. CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la curva de la reacción para monitorear el buen funcionamiento del análisis. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada método de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos proveídos. Los métodos estadísticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias. El laboratorio individual debe tener límites de funcionamiento aceptables de análisis. Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio experimental en las condiciones o degradación del kit de reactivos. Reactivos frescos deben usarse para determinar la razón de las variaciones. I.D. Muestra Cal A Cal B Cal C Cal D Cal E Cal F Cal G Paciente Pozo Número Ejemplo 1 Abs (A) A B C D E F G H A B C D G H A B Media Abs (A) Valor pg/ml Nota: Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas solamente no deben usarse para basarse en la curva preparada con cada análisis. Absorbancia Paciente Figura Testosterona libre (pg/ml) ANALISIS DE RIESGO A) Rendimiento del Ensayo 1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo se mantenga constante para lograr resultados reproducibles. 2. El pipeteo de las muestras no debe extenderse a más de diez (10) minutos para evitar la desviación del análisis. 3. Muestras altamente lipémicas, hemolizadas o ampliamente contaminadas no deben utilizarse

4 4. Si se utiliza más de una (1) placa, se recomienda repetir la curva de respuesta de dosis. 5. La añadidura de la solución de sustrato inicia una reacción cinética, la cual termina con la adición de la solución de paro. Ambas adiciones deben realizarse en la misma secuencia para eliminar cualquier desviación de tiempo durante la reacción. 6. Los lectores de placa leen verticalmente. No toque el fondo de los pozos. 7. La falla al remover la solución adherente de manera adecuada en los pasos de lavado de aspiración o decantación pueden resultar en una mala réplica y resultados falsos. 8. Utilice componentes del mismo lote. No mezcle reactivos de distintos lotes. 9. El pipeteado exacto y preciso después de la hora exacta, así como los requisitos de temperatura prescritos son esenciales. Cualquier desviación de estos puede dar resultados Inexactos. 10. Todos los estándares nacionales aplicables, incluyendo reglamentos y leyes no están limitados a los procedimientos de laboratorio, deben seguirse estrictamente para garantizar el cumplimiento y el uso adecuado del dispositivo. 11. Es importante calibrar todo el equipo ej. Pipettes, Readers, Washers and/or the automated instruments used with this device, and to perform routine preventative maintenance. B) Interpretación 1. Los resultados de laboratorio por sí solos son sólo un aspecto de la determinación de la atención al paciente y no debe ser la única base para la terapia, particularmente si los resultados entran en conflicto con otros determinantes. 2. Los resultados de exámenes válidos, controles y otros parámetros deben estar dentro de los rangos indicados y los requisitos de ensayo. 3. Si el kit de ensayo se modifican, como por partes de mezcla de kits diferentes, podría producir resultados falsos resultados en la prueba, o que los resultados se interpreten incorrectamente, en este caso Monobind no tendrá ninguna responsabilidad 4. Si se utiliza la reducción de datos controlada por computadora para interpretar los resultados de la prueba, es imperativo que los valores previstos por los calibradores, caigan dentro del 10% de las concentraciones asignadas. VALORES ESPERADOS En concordancia con los intervalos 5 de referencia establecidos para una población adulta normal los rangos esperados para el Sistema de Prueba de ELISA para Testosterona Libre AccuBind TM son detallados en la Tabla 1. TABLA 1 Valores esperados para Testosterona Libre ELISA Accubind Masculinos Femeninos Es importante mantener en mente que el establecimiento del rango de valor el cual se espera encontrarse por un método dado por una población de personas normales es dependiente a la multiplicidad de factores: la especificidad de los métodos, la población analizada y la precisión de los métodos en manos de los analistas. Por esta razón cada laboratorio debe depender del rango esperado de valores establecidos por el fabricante solo hasta un rango interior que puede ser determinado por el analista usando el método con una población indígena al área en el que el laboratorio esta ubicado. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO A) Precisión La precisión dentro y entre el análisis de la prueba de Testosterona Libre por sistema de microplaca fue determinada por análisis en tres diferentes niveles de suero de control. El número, valor principal, desviación Standard y coeficiente de variación para cada uno de estos controles de suero son presentados en la tabla 2 y tabla 3. TABLA 2 Precisión Dentro de Análisis (Valores en pg/ml) Muestra N X SD CV Bajo % Normal % Alto % TABLA 3 Precisión Entre Análisis (Valores en pg/ml) Muestra N X SD CV Bajo % Normal % Alto % * Según lo medido en diez experimentos en duplicado B) Especificidad El % de reactividad cruzada del anticuerpo de Testosterona libre para seleccionar sustancias fue evaluada agregando la sustancia que interfería a una matriz del suero en las varias concentraciones. La reactividad cruzada fue calculada derivando un cociente entre la dosis de la sustancia que interfería a la dosis de testosterona necesaria para desplazar el mismo trazo de la absorbancia. Sustancia Reactividad Cruzada Testosterona Androstenediona Dihidrotestosterona Cortisona Corticosterona Cortisol Espirolactona Progesterona α-OH Progesterona DHEA sulfato Estradiol Estrona Estriol

5 Hemolisis Rubéola Lipemia REFERENCIAS 1. Dorfman, RI and Shipley, RA, ED: Androgens, New York.: Johm Wiley and Sons, Horton R, Tait JF; Androstenedione production and interconversion rates measured in peripheral blood and studies on the possible site of conversion of testosterone. J.Clin Invest 45: , Faiman C and Winter, JSD, Reyes, FI Clin Obstet Gynaecol, 3, 467 (1976). 4. Sizonenka, PC, Pediatrician, 14, 191 (1987). 5. Cummings DC, Wall SR: Non sex hormone binding globulin bound testosterone as a marker for hyperandrogenism. J. Clin Endocrinol Metab. 61: , Lashansky, G, et al., J Clin Endocrinol Metab, 58, 674 (1991) 7. Tietz, NW, Ed: Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd Ed. Phliadelphia, WA Saunders Co, Smits SW: Free Testosterone, AACC Endo; 11(3), (1993) FABRICADO POR: MONOBIND INC. 100 NORTH POINTE DRIVE LAKE FOREST, CA USA 5