REACTIVOS PARA 96 ANÁLISIS

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1 Mercodia MPO ELISA Instrucciones de uso REACTIVOS PARA 96 ANÁLISIS Fabricado por Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE Uppsala Suecia

2 EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS EMPLEADOS EN LAS ETIQUETAS = 96 Reactivos para 96 análisis Fecha de caducidad Consérvese entre 2 y 8 C. Núm. de lote Para uso diagnóstico in vitro Mercodia 2008, 2009, 2011

3 USO PRETENDIDO Mercodia MPO ELISA ofrece un método para establecer la cantidad de MPO humana en el plasma EDTA. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA La mieloperoxidasa (MPO), una glicoproteina que contiene hierro, es un complejo tetramétrico de vinculación covalente con un peso molecular de 150 kda. Está compuesta por dos cadenas alfa glucosiladas de MW kda y dos cadenas beta desglucosiladas de MW 14 kda. La MPO se encuentra abundantemente en los gránulos azurofílicos primarios de neutrófilos y está presente en los monocitos. Como respuesta a una invasión microbiana, los gránulos citoplásmicos de neutrófilos liberan la MPO en el espacio fagosómico y extracelular, catalizando la conversión de peróxido de hidrógeno e iones de cloruro (CI - ) a ácido hipocloroso, un potente agente oxidante. La mieloperoxidasa se emplea tradicionalmente como marcador de inflamaciones de las vías respiratorias causadas por asma o irritantes medioambientales. Asimismo, se cree que la MPO participa en las distintas fases de la aterogénesis y que puede influir en la propagación de la aterosclerosis. La relación entre los niveles elevados de MPO en suero y las enfermedades cardiovasculares (CAD) representa un importante papel de la MPO como marcador de inflamaciones en las CAD, permitiendo la identificación de pacientes con riesgo de padecer accidentes cardíacos a falta de necrosis miocárdica. PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO Mercodia MPO ELISA es un inmunoensayo enzimático combinado en fase sólida. Se basa en la técnica de sándwich en la que dos anticuerpos monoclonales se contraponen a determinantes antigénicos separados en la molécula de la MPO. Durante la incubación, la MPO de la muestra reacciona con anticuerpos anti-mpo vinculados a los pocillos de microtitración. Tras el lavado, se añade la peroxidasa junto con los anticuerpos anti-mpo y, después de una segunda incubación y un simple lavado que retire el anticuerpo etiquetado como enzima sin vincular, la vinculación se detecta por la reacción a la 3,3,5,5 -tetrametilbenzidina(tmb). La reacción se detiene añadiendo ácido para dar un final colorimétrico que se lea espectrofotométricamente. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagnóstico in vitro. En Norteamérica: Para uso exclusivo en investigación. No válido para procedimientos de diagnóstico. No válido para uso interno o externo aplicado a personas o animales. Ni el contenido de este paquete ni sus residuos deberán entrar en contacto con animales rumiantes o porcinos. La Stop Solution de este paquete contiene 0.5 M H 2 SO 4. Adopte las precauciones rutinarias correspondientes para manipular sustancias químicas peligrosas. Todas las muestras de pacientes deberán manipularse como muestras susceptibles de transmitir infecciones. 3

4 MATERIAL NECESARIO PERO NO INCLUIDO Pipetas para 25, 50, 100, 200, 250 y 1000 μl (son preferibles las pipetas de repetición para añadir la solución de la enzyme conjugate 1X, el Substrate TMB y la Stop Solution). Cubetas y probetas para la preparación de los reactivos Agua redestilada Lector de microplacas (filtro de 450 nm) Agitador de placas (velocidad recomendada de ciclos por minuto, movimiento orbital) Aparato para lavado de microplacas 4

5 REACTIVOS Cada paquete de MPO ELISA contiene reactivos para 96 pocillos, suficientes para 42 muestras y una curva de calibrado por duplicado. Para series de ensayos más amplias, emplee reactivos combinados de paquetes con números de lote idénticos. La fecha de caducidad del paquete completo se encuentra indicada en la etiqueta exterior. La temperatura de conservación recomendada es de 2-8 ºC. Coated Plate 1 placa 96 pocillos Lista para usar Ratón monoclonal anti-mpo 8 bandas de pocillo Para las bandas de microtitración sin utilizar, cierre la bolsa con una cinta adhesiva, guárdela a 2-8 C y utilícelas en los 8 meses siguientes. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 frascos 1000 μl Liofilizado Código de color amarillo Añada 1000 μl Concentración indicada en la etiqueta del frasco de agua redestilada Almacenamiento tras restitución: 2-8 C durante 8 semanas. por frasco Para conservar los Calibrators restituidos durante más de 8 semanas, almacénelos a - 20 C. Calibrator 0 1 frasco 1000 μl Listo para usar Código de color amarillo Sample Buffer 1 frasco 12 ml Listo para usar Código de color amarillo Assay Buffer 1 frasco 12 ml Listo para usar Código de color rojo Enzyme Conjugate 11X 1 frasco 1.3 ml Preparación, Peroxidasa mezclada con ratón monoclonal anti-mpo véase a continuación. Enzyme Conjugate Buffer 1 frasco 13 ml Listo para usar Código de color azul. Wash Buffer 21X 1 botella 50 ml Diluya el contenido Almacenamiento tras la dilución: 2-8 C durante 8 semanas. con 1000 ml de agua redestila da para crear la solución de wash buffer 1X. Substrate TMB 1 botella 22 ml Listo para usar Solución incolora Nota: Fotosensible. Stop Solution 1 frasco 7 ml Listo para usar 0,5 M H 2 SO 4 5

6 Preparación de la solución 1X de enzyme conjugate Prepare la cantidad necesaria de solución 1X de enzyme conjugate diluyendo Enzyme Conjugate 11X (1+10) en el Enzyme Conjugate Buffer o según la tabla siguiente. Mézclela lentamente. Cuando prepare la solución 1X de enzyme conjugate para toda la placa, vierta todo el contenido del Enzyme Conjugate Buffer en el frasco de Enzyme Conjugate 11X. Curva del Muestras por Enzyme Enzyme Número de bandas calibrador por duplicado Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 bandas (una placa) frasco 1 frasco 8 bandas μl 7.0 ml 6 bandas μl 5.0 ml 4 bandas μl 3.5 ml Almacenamiento tras la dilución: 2-8 C durante dos semanas. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS Un aspecto importante que debe tenerse en cuenta en las condiciones de manipulación previas al análisis es la prevención de la liberación artificial de MPO de neutrófilos en las muestras, lo que podría provocar la obtención de resultados falsamente altos. Se trata de un asunto particularmente importante, puesto que la MPO ha demostrado su potencial como marcador de enfermedades cardiovasculares en las que los informes han vinculado el aumento de las concentraciones de MPO circulatoria a un aumento del riesgo de padecer enfermedades coronarias, un aumento del riesgo en pacientes con síndromes coronarios agudo y la utilidad clínica en la identificación y el pronóstico de los pacientes con insuficiencias cardíacas. Las concentraciones mayores de MPO en plasma con heparina, citrato-plasma y suero se deben a la liberación in vitro de MPO de los neutrófilos, dependiendo dicho aumento de las concentraciones del tiempo a temperatura ambiente tras la extracción. El plasma EDTA está recomendado para medir la MPO porque los valores no se confunden con la liberación ex vivo difícilmente controlable de la MPO de neutrófilos y por lo tanto puede reflejar de una manera más precisa la concentración de MPO en circulación. Plasma EDTA El plasma EDTA es el tipo de muestra recomendado para los análisis de MPO. Extraiga la sangre mediante venipunción en tubos con EDTA como anticoagulante y separe la parte de plasma. Las muestras de sangre de plasma EDTA pueden conservase durante 1 hora a temperatura ambiente antes de centrifugarlas a 1500g durante 10 min. A continuación, el plasma separado pasa directamente a ser analizado o se congela hasta que llegue el momento de su análisis. Suero, plasma con heparina y citrato-plasma El suero, el plasma con heparina y el citrato-plasma pueden utilizarse en el ensayo. El suero o la presencia de anticoagulante de heparina o citrato no afectarán a la medición del propio analito. Sin embargo, al valorar los resultados deberán tenerse en cuenta los posibles efectos derivados de la manipulación previa al análisis. 6

7 Almacenamiento Las muestras de sangre de plasma EDTA pueden conservarse durante 1 hora a temperatura ambiente antes de centrifugarlas a 1500g durante 10 min. A continuación, el plasma separado pasa directamente a ser analizado o se congela a temperaturas inferiores a los -20 C hasta que llegue el momento de su análisis. DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS Normalmente las muestras deberían diluirse 1:5 (50 μl de muestra μl de Sample Buffer) antes de someterlas a análisis. 7

8 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Todos los reactivos y las muestras deben llevarse a temperatura ambiente antes de su uso. Prepare una curva de calibrado para cada turno de ensayo. 1. Recomponga el Calibrator 1-5 con 1000 µl de agua redestilada para cada frasco 2. Prepare la solución 1X de enzyme conjugate, la solución 1X de wash buffer y las muestras. 3. Prepare pocillos de microplacas suficientes para incorporar los Calibrators y las muestras por duplicado. 4. Utilice la pipeta de 25 µl y pase dicha cantidad de cada Calibrator y de las muestras a los pocillos correspondientes. 5. Añada 100 µl del Buffer Assay a cada pocillo. 6. Incube en un agitador de placas ( rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18-25 C). 7. Lave 6 veces con 700 μl de solución 1x de wash buffer por pocillo usando un lavador de placas automático en la función de lavado con agua abundante. Tras realizar el último lavado, vuelque la placa y golpéela con firmeza sobre el papel absorbente. No incluya el paso de impregnación en el proceso de lavado. O de forma manual, Descarte el volumen de la reacción volcando la microplaca en una pileta. Añada a cada pocillo 350 μl de solución 1X de wash buffer. Deseche la solución de lavado, golpee con firmeza varias veces. sobre el papel absorbente para eliminar el exceso de líquido. Repita esta acción 5 veces. Evite la impregnación prolongada durante el lavado. 8. Añada a cada pocillo 100 µl de solución 1X de enzyme conjugate. 9. Incube en un agitador de placas ( rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Lave siguiendo las indicaciones anteriores. 11. Añada a cada pocillo 200 µl de Substrate TMB. 12. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-25 C). 13. Añada a cada pocillo 50 µl de Stop Solution. Coloque la placa sobre un agitador durante unos 5 segundos para asegurarse de que se mezcla bien. 14. Lea la densidad óptica a 450 nm y calcule los resultados. Haga una lectura cuando hayan transcurrido 30 minutos. Nota: Para evitar la contaminación entre la mezcla y el sustrato, se recomienda usar pipetas distintas. 8

9 CONTROL DE CALIDAD INTERNO Los grupos de suero internos con concentraciones de MPO baja, media y alta deberán probarse de forma rutinaria como muestras y sus resultados se registrarán día tras día. Es conveniente que el laboratorio emplee se acostumbre a registrar los datos siguientes de cada prueba: Número de lote del paquete, fechas de dilución y/o restitución de los componentes del paquete, valores DO para los Calibrators y controles. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Nota: El Calibrator 0 (vacío) no debe emplearse para calcular la curva de calibrado. Cálculo informatizado La concentración de MPO en muestras desconocidas deberá calcularse, en la medida de las posibilidades, empleando una reducción de los datos informatizados. Utilice las absorbencias obtenidas frente a las concentraciones conocidas de los Calibrators 1-5 y el análisis de regresión spline cúbica para construir la curva de calibrado. Multiplique las concentraciones de MPO que se han calculado por el factor de dilución (p. ej., x5) Cálculo manual 1. Divida los valores de absorbencia obtenidos para los Calibrators 1-5, compárelos con la concentración de MPO en un papel cuadriculado y dibuje a mano la curva de calibrado. 2. Lea la concentración de las muestras en la curva de calibrado. 3. Multiplique las concentraciones de MPO por el factor de dilución (p. ej., x5). 9

10 Ejemplo de ficha Pocillos Identidad A 450 Conc. μg/l** 1A-B Calibrator / C-D Calibrator 1* 0.101/ E-F Calibrator 2* 0.195/ G-H Calibrator 3* 0.453/ A-B Calibrator 4* 1.479/ C-D Calibrator 5* 2.471/ E-F Muestra / G-H Muestra / A-B Muestra / *Concentración indicada en la etiqueta del frasco **Resultado multiplicado por el factor de dilución (x5) Curva de calibrado Aquí se muestra una curva de calibrado típica. No utilice esta curva para calcular los resultados de la prueba real. Concentración (μg/l) 10

11 RESTRICCIONES DEL PROCEDIMIENTO Como sucede con las pruebas de diagnóstico, un diagnóstico definitivo no debería basarse en los resultados de una única prueba, sino que correspondería al médico realizarlo tras haber valorado todos los resultados clínicos. Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo. VALORES ESPERADOS La práctica correcta dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores. CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO Límite de detección El límite de detección se define como la Capacidad de Detección según la norma ISO Parte 1. La Capacidad de Detección deberá considerarse parte de la validación de un método en lugar de tomar la concentración más baja que pueda medirse. El límite de detección es más bajo que la concentración del Calibrator 1 establecida con la metodología descrita en la norma ISO1183- Parte 4. La concentración para las muestras con una absorbencia por debajo del Calibrator 1 no debería calcularse. En su lugar, se expresarán como menos que o igual a ( ) la concentración indicada en el frasco para el Calibrator 1. Efecto gancho Las muestras con concentraciones de hasta µg/l han sido analizadas sin reflejar resultados altamente bajos. Recuperación La recuperación tras la incorporación es del 85-96% (89% de media). La recuperación tras la dilución es del % (101% de media). Precisión Cada muestra fue analizada en 4 réplicas en 33 ocasiones diferentes. Muestra Valor de media (µg/l) en % de ensayos Coeficiente de variación entre % de ensayos % total de ensayos

12 Especificidad Se han hallado las siguientes reacciones cruzadas: TPO 0.01% CRP 0.01% EPO 3.53% Lisozima 0.03% Elastasa 0.12% Alfa-1-antitripsina 0.01% CALIBRADO El paquete MPO ELISA ha sido calibrado en contraposición con un preparado comercial de MPO, altamente purificado y plenamente validado. La concentración de mieloperoxidasa se expresa en μg/l. GARANTÍA Los datos sobre el rendimiento presentados fueron obtenidos con el procedimiento indicado. Todo cambio o modificación en el procedimiento no recomendado por Mercodia AB podría influir en los resultados, en cuyo caso Mercodia AB declina todas las garantías expresas, implícitas o legales, incluida la garantía implícita sobre comerciabilidad e idoneidad de uso. En tal caso, Mercodia AB y sus distribuidores autorizados no se responsabilizarán de los daños y perjuicios indirectos o resultantes. 12

13 REFERENCIAS Baldus S. et al. (2003) Myeloperoxidase Serum Levels Predict Risk in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation 108: Brennan M-L. et al. (2003) Prognostic value of Myeloperoxidase in Patients with Chest Pain. The New England Journal of Medicine 349: Carr A C. et al. (2000) Oxidation of LDL by Myeloperoxidase and Reactive Nitrogen Species. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20: Hazen S L. et al. (1999) Formation of Nitric Oxide-Derived Oxidants by Myeloperoxidase in Monocytes. Circ. Res. 85: Nambi V. (2005) The Use of Myeloperoxidase As a Risk marker for Atherosclerosis. Current Atherosclerosis Reports 7: Zhang R. et al. (2001) Association between myeloperoxidase levels and risk of coronary artery disease. JAMA. 286: Klebanoff SJ. (2005) Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol 2005;77: Scheffer PG. et al. (2009) Myleoperoxidase concentrations in EDTA-plasma of healthy subjects are discordant with concentration in heparin-plasma and serum. Clin Biochem 42: Shih J. et al. (2008) Effect of Collection Tube Type and Preanalytical Handling on Myleoperoxidase Concentrations. Clin Chem 54: Schindhelm RK. et al. (2009) Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification? Clin Chem 55:

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16 RESUMEN DE LA HOJA DE PROTOCOLO Añada los Calibrators y las muestras 25 μl Añada el Assay Buffer Incube Lave la placa con la solución 1X de wash buffer Añada la solución 1X de enzyme conjugate Incube Lave la placa con la solución 1X de wash buffer Añada Substrate TMB Incube Añada la Stop Solution Mida A μl 1 hora a ºC en un agitador de placas 6 veces 100 μl 1 hora a ºC en un agitador de placas 6 veces 200 μl 15 minutos 50 μl Agite durante 5 segundos para que se mezcle. Valore los resultados Versión 6.0

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