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1 Redalyc Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Cejas, N.;Llado, N.;Barzón, S.;Mosca, L.;Kiener, O.;De Elías, R.;Cassinerio, A. Evaluación de inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA directo e Inmunoblot (IB) en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilo (ANCA) en distintos estados patológicos Bioquímica y Patología Clínica, Vol. 71, Núm. 3, 2007, pp Asociación Bioquímica Argentina Argentina Disponible en: Bioquímica y Patología Clínica ISSN (Versión impresa): info@aba-online.org.ar Asociación Bioquímica Argentina Argentina Cómo citar? Número completo Más información del artículo Página de la revista Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 Evaluación de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ELISA directo e Inmunoblot (IB) en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilo (ANCA) en distintos estados patológicos Evaluación de inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA directo e Inmunoblot (IB) en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilo (ANCA) en distintos estados patológicos Cejas, N. 1 Llado, N. 2 Barzón, S. 2 Mosca. L. 1 Kiener, O. 2 De Elías, R. 2 Cassinerio, A. 1 1 Laboratorio de Inmunologìa, Hospital de Niños de la Santísima Trinidad. Córdoba, Capital. 2 Laboratorio Central, Sanatorio Allende. Córdoba, Capital. Lugar de Trabajo: Laboratorio Central - Hospital Municipal de Agudos Dr. Leónidas Lucero Estorba Bahía Blanca Buenos Aires - República Argentina. Enviar Correspondencia a: Dra. Marta del Valle Servicio de Laboratorio Central Hospital Municipal de Agudos Dr. Leónidas Lucero Estorba Bahía Blanca Buenos Aires - Argentina mdelvalle01@yahoo.com.ar Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN Código Bibliográfico: RByPC Trabajo Recibido: Aceptado: RESUMEN Introducción: Los ANCA son marcadores útiles en las vasculitis de pequeños vasos aunque han sido descriptos en otros estados patológicos. Por IFI se observan dos patrones principales: c-anca asociado a proteinasa 3 (PR3) y p-anca asociado a mieloperoxidasa (MPO); también se han identificado patrones atípicos. La correcta interpretación de los resultados es fundamental para evitar falsos positivos o falsos negativos. Objetivos: Evaluar la concordancia entre IFI, ELISA e IB para ANCA en vasculitis y en otras patologías. Establecer un algoritmo con la máxima exactitud diagnóstica. Materiales y Métodos: se estudiaron 49 pacientes (29 F / 20 M) de los cuales 25 fueron niños (10 m 16 años) y 24 adultos (17-73 años). Los pacientes fueron divididos en: vasculitis (n= 10), colagenopatías (n= 7), enfermedades gastrointestinales asociadas a ANCA (EGIAA) (n= 12), otras patologías no asociadas a ANCA (OPNAA) (n= 20). A todos los sujetos se les determinaron los ANCA por IFI (etanol/formalina), ELISA e IB; en todas las metodologías se utilizaron equipos comerciales. Resultados: la concordancia entre las 3 metodologías fue del 100% en pacientes con vasculitis, con un 80% de ANCA (+), observándose asociación entre c-anca/pr3 y p-anca/mpo. En el resto de las patologías las 3 técnicas sólo concordaron en los resultados negativos. Los ANCA (+) fueron: colagenopatías (dos anti-pr3 por IB y uno anti-mpo por ELISA, todas las IFI negativas), EGIAA (cuatro anti-pr3 por ELISA e IB asociados a p-anca atípico y p-anca y un p-anca atípico con ELISA e IB (-)); en OPNAA (1 paciente con anti-pr3 y otro con anti-mpo, ambos en bajo título, en este grupo todas las IFI fueron (-)). Conclusiones: IFI, ELISA e IB fueron útiles para la pesquisa de pacientes con vasculitis y la IFI para pacientes con sospecha de EGIAA. De acuerdo a lo observado un resultado positivo por ELISA o IB debe ser confirmado por IFI. Un c-anca no necesitaría ser confirmado, ya que sólo estuvo asociado a PR3, un p-anca se confirmaría con ELISA o IB sin necesidad de utilizar neutrófilos fijados con formalina. Palabras claves ANCA, PR3, MPO, Vasculitis de pequeños vasos SUMARY Introduction: ANCA are useful immunological markers in small vessels vasculitis, although they are also present in other diseases. The IIF can show 2 main patterns: c-anca associated with proteinase 3 (PR3) and p-anca, associated with myeloperoxidase (MPO). Atypical patterns have also been observed. The correct interpretation of assays is important to avoid false results. Objectives: To evaluate the concordance among IIF, ELISA and IB for ANCA in vasculitis and other diseases. Establish and algorithm with the highest diagnostic accuracy. Material and Methods: 49 pacients were studied (29F/20M). Twenty five were children (10m 16yo) and 24 were adults (17-73 yo). The patients were grouped in vasculitis (n=10), colagen pathologies (n=7), digestive tract diseases associated with ANCA (DTDAA) (n=12), other diseases not associated with ANCA (ODNAA) (n=20). All sera were tested by the 3 methodologies in study using commercial kits. Results: The concordance of 3 assays was 100% in patients with vasculitis of whom 80% were ANCA (+), showing association between c-anca/pr3 and p-anca/mpo. In all the other diseases all 3 assays were negative. Positive ANCA were observed in colagenopathies (two anti PR3 by IB and one anti MPO by ELISA, al of them IIF negative), DTDAA (four anti PR3 by ELISA and IB associated with atypical p-anca and p-anca, and one atypical p-anca with ELISA and IB negative). In ODNAA (1 patient with anti-pr3 and other with anti-mpo, both with low titers; in this group all IIF were negative). Conclusions: IIF, ELISA and IB were useful for the screening of patients with vasculitis, as IIF was for patients suspicious of DTDAA. According with our observations, an ELISA or IB positive result must be confirmed by IIF. A positive c-anca result does not need to be confirmed since it was only associated with a PR3; a positive p-anca result could be confirmed by ELISA or IB without implying the use of formalin fixed neutrophils.

3 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº Trabajo: págs Pág 47 INTRODUCCIÓN Las vasculitis de pequeños vasos afectan capilares, arteriolas y vénulas, y se caracterizan por la presencia en suero de anticuerpos anti citoplasma de neutrófilos (ANCA). Estos autoanticuerpos fueron descriptos por primera vez en Australia en pacientes que sufrían glomerulonefritis rápidamente progresiva (GNRP) (1). Los ANCA reconocen dos antígenos principales: proteinasa 3 (PR3) y mieloperoxidasa (MPO), ambas enzimas ubicadas dentro de los gránulos azurófilos del neutrófilo (2.3).Para la detección de ANCA pueden utilizarse diferentes metodologías tales como inmunofluorescencia indirecta (IFI), enzimoinmunoensayo (ELISA), directo o de captura, e inmunoblot (IB) (4). La técnica más difundida es la IFI, con la cual pueden diferenciarse dos patrones característicos: un patrón citoplasmático (c-anca) y otro perinuclear con extensión nuclear (p-anca). Estos patrones de fluorescencia son reconocidos en neutrófilos humanos fijados con etanol; c-anca se define como una fluorescencia granular citoplasmática con acentuación internuclear la cual está fuertemente asociada a anticuerpos (Acs) anti-pr3 y es altamente específica de granulomatosis de Wegener (GW) (5,6). El patrón p-anca es un artefacto de la fijación de los neutrófilos con etanol debido principalmente a la migración de proteínas catiónicas de los gránulos hacia el núcleo cargado negativamente (4-7). La MPO es el principal antígeno asociado a p-anca y se encuentra con frecuencia en poliangeítis microscópica (PAM), síndrome de Churg-Strauss (SCS) y GNRP (4,7), aunque otras proteínas pueden dar un panca en etanol (7,8), como así también la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA) (9). Una imagen p-anca debe ser confirmada en neutrófilos fijados con formalina en los cuales el antígeno no se desplaza al núcleo, observándose un patrón c-anca. Con el objetivo de optimizar la utilidad diagnóstica de estos autoanticuerpos en pacientes con sospecha de vasculitis, en 1999 se llevó a cabo el Consenso Internacional sobre detección e informe de ANCA, que establece como requerimiento mínimo iniciar la pesquisa con IFI y sólo a los sueros positivos realizarles ELISA para PR3 y MPO; y como requerimiento óptimo que todos los sueros sean procesados por ambas metodologías (5). La interpretación de los patrones por IFI requiere del entrenamiento del observador, ya que además de ser una técnica subjetiva, con frecuencia se observan imágenes diferentes a las mencionadas anteriormente. Además de c-anca y p- ANCA se describen patrones ANCA atípicos para los cuales no hay un criterio unificado para definirlos, lo que puede dar origen a resultados falsos positivos o falsos negativos (3,4,9). La revisión bibliográfica coincide en que la sensibilidad y la especificidad de los ELISA difiere significativamente entre los diferentes equipos comerciales y destaca la necesidad de establecer estándares internacionales que permitan una mejor interpretación de los resultados (10). Algunos autores cuestionan el actual esquema diagnóstico propuesto por el consenso y sostienen que la óptima utilización de un algoritmo diagnóstico debe ser evaluado por cada centro de salud de acuerdo a la población de pacientes estudiados, teniendo en cuenta la prevalencia de la enfermedad, los costos y la posibilidad de acceder a las distintas metodologías (6). OBJETIVOS - Evaluar la concordancia entre IFI, ELISA directo e Inmunoblot (IB) para ANCA en pacientes con vasculitis y en otras patologías. - Establecer un algoritmo con la máxima exactitud diagnóstica para la pesquisa de pacientes con patologías asociadas a ANCA. MATERIALES Y METODOS Tipo de estudio: Observacional, transversal y descriptivo. Población: se incluyeron en el estudio 49 pacientes (29 mujeres, 20 hombres) de los cuales 25 fueron niños entre 10 meses y 16 años y 24 adultos entre 17 y 73 años, los que tuvieron solicitud de ANCA entre febrero de 2006 a febrero de Las muestras fueron obtenidas en dos centros de salud de la Ciudad de Córdoba, incluyendo en el estudio los pacientes en los cuales pudo establecerse un diagnóstico a través de la historia clínica. El presente trabajo fue aprobado por el comité de ética e investigaciòn de ambas instituciones. Muestras: en todos los pacientes se realizó la extracción de sangre entera por punción venosa, obteniéndose suero por centrifugación, el cual fue fraccionado y conservado a 20 C hasta la realización de los ensayos. ELISA directo para Acs anti PR3 y MPO: se utilizó un equipo comercial para la determinación semicuantitativa de anticuerpos anti-pr3 y anti-mpo (QUANTA Lite TM PR3, QUANTA Lite TM MPO, INOVA, San Diego, USA). La PR3 y MPO purificadas de neutrófilos humanos fueron unidas a microplacas de poliestireno preservando su estado nativo. El desarrollo del ensayo se siguió de acuerdo a las instrucciones dadas por el fabricante. Se consideró negativo un resultado menor a 20 unidades, positivo débil de 21 a 30 unidades y positivo fuerte mayor a 30 unidades. Inmunoblot: se utilizó un equipo comercial en el cual se determinó en forma conjunta Acs anti-pr3, anti-mpo y anti membrana basal glomerular (MBG) (ANCA 3-Line, ORGEN- TEC Diagnostika, Alemania). Estos antígenos altamente purificados se unen a una membrana de nitrocelulosa. La identificación de anticuerpos anti-mbg se realiza para el diagnóstico diferencial entre GW y Síndrome de Goodpasture; ambas patologías cursan con hemorragia pulmonar y

4 Evaluación de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ELISA directo e Inmunoblot (IB) en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilo (ANCA) en distintos estados patológicos glomerulonefritis. Para la realización del ensayo se siguieron las instrucciones dadas por el fabricante. Se consideró negativo un resultado en el cual se observó una banda con menor intensidad que el cut-off, igual al cut-off como bordeline y positivo a una banda cuya intensidad fue mayor que la del cut-off. Inmunofluorescencia Indirecta: se utilizaron improntas comerciales de neutrófilos fijados en etanol o formalina (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido). Los sueros fueron diluidos de acuerdo a la edad de los pacientes, niños (1/10), adultos (1/20) en PBS. Para la realización del ensayo se siguió la técnica convencional para IFI utilizando anticuerpos de cabra anti inmunoglobulinas G, A y M humanas marcadas con isotiocianato de fluoresceína. Todas las muestras fueron procesadas con neutrófilos fijados en etanol. Se consideró c-anca al típico patrón granular citoplasmático con acentuación internuclear. Se consideró p-anca al patrón fluorescente perinuclear en neutrófilos fijados con etanol que luego cambia a un patrón c-anca en neutrófilos fijados con formalina. Consideramos que presentaron un p-anca atípico a aquellos sueros, ANA negativos, en los cuales se observó un patrón perinuclear en etanol pero que fueron negativos en formalina. Para la determinación de ANA se utilizaron improntas comerciales de células Hep-2, los sueros fueron diluidos 1/40 o 1/20 en PBS para adultos y niños respectivamente. RESULTADOS Los pacientes estudiados fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo al diagnóstico clínico (Tabla I). El diagnóstico de vasculitis se efectuó según los criterios del Colegio Americano de Reumatología (11). En la tabla II se observan los resultados obtenidos por las tres metodologías en los grupos de pacientes con patologías asociadas a ANCA. Tabla 1. Grupos de pacientes estudiados según la patología. Vasculitis n= 10 Granulomatosis de Wegener 3 Poliangeítis Microscópica 2 Síndrome de Churg-Strauss 1 Otras vasculitis 4 Colagenopatías n= 7 Lupus 3 Artritis Reumatoidea 2 Artralgia 1 Dermatomiositis 1 Enfermedades gastrointestinales Asociadas a ANCA n= 12 Enfermedad Inflamatoria Intestinal 5 Colangitis Esclerosante Primaria 1 Hepatitis Autoinmune 6 Otras patologías no asociadas a ANCA n= 20 Tabla 2. Resultados obtenidos por las tres metodologías en los pacientes con patologías asociadas a ANCA. GW: granulomatosis de Wegener PAM: poliangeítis microscópica SCS: síndrome de Churg-Strauss EGIAA : enfermedad gastrointestinal asociada a ANCA EII: enfermedad inflamatoria intestinal HAI: hepatitis autoinmune La concordancia fue del 100% (10/10) entre las tres técnicas empleadas para la detección de ANCA en pacientes con vasculitis. También se observó asociación entre GW y c-anca/pr3, al igual que PAM y SCS con p-anca/mpo. En una paciente de 2 años de edad con vasculitis necrotizante post picadura de araña con sobreinfección por pseudomona, se detectaron Acs c-anca/pr3. En el resto de los pacientes la concordancia sólo se observó en muestras con resultados negativos (gráfico I). En los pacientes con colagenopatías observamos una concordancia del 57% (4/7) entre las tres metodologías. En dos pacientes se detectaron Acs anti-pr3 borderline por IB y en otro Acs anti-mpo positivo débil por ELISA; en los tres pacientes la IFI fue negativa. Gráfico 1. Concordancia entre las tres técnicas utilizadas en los pacientes estudiados. % Concordancia entre ELISA, IFI e IB Vasculitis* Colagenopatías** EGAA** OPNAA** * concordancia de las tres técnicas en resultados positivos y negativos ** concordancia de las tres técnicas sólo en resultados negativos EGIAA: enfermedades gastrointestinales asociadas a ANCA OPNAA: otras patologías no asociadas a ANCA

5 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº Trabajo: págs Pág 49 En las muestras de pacientes con enfermedades gastrointestinales asociadas a ANCA (EGIAA) la concordancia entre las tres técnicas fue del 50% (6/12). Cuatro pacientes presentaron Acs anti-pr3 positivos por las técnicas de ELISA e IB sin patrón c-anca por IFI (3 con patrón p-anca atípico y 1 con p-anca ). También se observó discordancia en 2 pacientes con hepatitis autoinmune, uno presentó p-anca atípico y otro Acs anti-mpo por IB, ambos con las otras dos pruebas negativas. En el grupo correspondiente a otras patologías no asociadas a ANCA (OPNAA) se observó una concordancia del 90% (18/20). Un paciente con anemia hemolítica autoinmune tuvo Acs anti-pr3 positivo débil por ELISA y un paciente con insuficiencia renal crónica presentó Acs anti-mpo positivo por IB; todos los pacientes tuvieron IFI negativa. En la tabla 3 se detallan las frecuencias de ANCA positivos en los distintos grupos de pacientes estudiados. En el grupo de pacientes con EGIAA se observó la mayor disparidad en los resultados y es el único grupo en el que se detectó el patrón p-anca atípico. Tabla 3. Frecuencia de ANCA positivos y su distribución en los grupos estudiados. DISCUSIÓN Vasculitis (n= 10) EGIAA (n= 12) frecuencia de ANCA positivos fue del 28% y en la mayoría de los casos estuvo asociada a procesos patológicos tales como colagenopatías, hepatitis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal y colangitis esclerosante, coincidiendo con lo publicado por otros autores (6-9,15). Por otro lado la solicitud de ANCA se ha generalizado a otras patologías distintas a las vasculitis de pequeños vasos por lo que es fundamental establecer un algoritmo diagnóstico que nos permita optimizar el informe de un resultado positivo, ya que la interpretación de éste depende fuertemente de la probabilidad pre test de que el paciente tenga la patología sospechada. En nuestro trabajo encontramos una exactitud diagnóstica del 100% de c-anca/pr3 y de panca/mpo para identificar pacientes con vasculitis, lo que concuerda con los metaanálisis realizados por Choi y col. y Rao y col. (16,17). En las colagenopatías encontramos anti-pr3 y anti-mpo en distintos pacientes con resultados negativos por IFI; en estas patologías han sido descriptos los ANCA aunque no se ha podido demostrar la relación clínico-patológica ni una asociación clara entre patrones de IFI e identificación del antígeno correspondiente (14). Con respecto a las EGIAA se han publicado hallazgos de p- ANCA y p-anca atípico con distintas especificidades antigénicas (15,18). En nuestra casuística encontramos pacientes con patrones p-anca y p-anca atípico asociados a Acs anti- PR3 en coincidencia con lo hallado por Doré (19). Esto denota las dificultades en interpretar un resultado positivo en este grupo de pacientes, aunque ha sido documentado algún valor pronóstico y de clasificación de enfermedad a los p-anca atípicos en la enfermedad inflamatoria intestinal, hepatitis autoinmune y en la colangitis esclerosante (15,18). Existen contradicciones en la bibliografía para definir un p-anca atípico (15), en nuestra experiencia los resultados obtenidos en neutrófilos fijados con formalina no fueron reproducibles. De acuerdo a nuestros datos podemos definir un p-anca atípico, como p-anca positivo en etanol sin Acs anti-mpo por ELISA o IB, con ANA negativos. La presencia de ANA hace aún más complicada la definición de un p-anca atípico; algunos autores hacen mención a la intensidad de la fluorescencia observada en las células Hep-2 y la comparan a la de los neutrófilos (9). En las OPNAA se observó un 10% de ANCA positivos con las técnicas utilizadas. Esto demuestra la baja frecuencia de éstos autoanticuerpos en pacientes con patologías no relacionadas a procesos vasculíticos o gastrointestinales, lo cual también se observa en la población saludable (20). Cabe mencionar la importancia de la correcta identificación de un patrón c-anca, tal como se describe en el consenso, ya que otras proteínas pueden dar patrones similares (3,4). Debemos resaltar la gran especificidad para vasculitis de la asociación c-anca/pr3 y p-anca/mpo, la cual no fue vista en otras patologías. Aunque la casuística de este trabajo es baja, nuestros resultados demuestran que cualquiera de las tres técnicas em- Colagenopatías (n= 7) OPNAA (n= 20) ANCA (+) 80% (8) 50% (6) 43% (3) 10% (2) c-anca/pr3 50% (4/8) p-anca/mpo 50% (4/8) c-anca p-anca p-anca atípico 0 66% (4/6) 0 0 anti-pr3 0 33% (2/6) 66% (2/3) 50% (1/2) anti-mpo 0 17% (1/6) 33% (1/3) 50% (1/2) p-anca atípico/pr3 0 50% (3/6) 0 0 p-anca/pr3 0 17% (1/6) 0 0 EGIAA: enfermedades gastrointestinales asociadas a ANCA OPNAA: otras patologías no asociadas a ANCA Las tres metodologías empleadas en este trabajo (IFI, ELISA e IB) identificaron correctamente a los pacientes con vasculitis. En los dos laboratorios que participaron en este estudio la prevalencia de ANCA positivo asociado a vasculitis fue del 3,8% y 2,2%. En la bibliografía se detallan prevalencias entre el 10% y el 17% las que fueron establecidas en centros especializados, a diferencia de los nuestros que son generalistas (12,13,14). Estas prevalencias deben ser tenidas en cuenta ya que impactan directamente en la interpretación de un resultado positivo. Con los datos obtenidos en el presente trabajo la mayor frecuencia de ANCA positivos correspondió a pacientes con vasculitis (80%). En el resto de los pacientes estudiados la

6 Evaluación de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ELISA directo e Inmunoblot (IB) en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilo (ANCA) en distintos estados patológicos pleadas es útil para la pesquisa de pacientes con sospecha de vasculitis, en cambio para pacientes con sospecha de EGIAA la IFI sería de elección como primera técnica. Dependiendo de cuál sea la técnica seleccionada para realizar la pesquisa de ANCA, sugerimos tener en cuenta los siguientes criterios: un c-anca positivo no sería necesario confirmarlo, ya que sólo estuvo asociado a PR3. En cambio un p-anca debe ser confirmado por ELISA o IB y si es negativo para MPO se consideraría un p-anca atípico; de acuerdo a nuestros resultados no sería necesaria la confirmación con neutrófilos fijados con formalina. Un resultado positivo por ELISA o IB debe ser confirmado por IFI. CONCLUSIONES La concordancia entre IFI, ELISA e IB fue perfecta en los pacientes con vasculitis, observándose disparidad de resultados en las otras patologías estudiadas. El esquema a seguir para la detección de ANCA dependerá de la sospecha clínica. La falta de correlación entre determinados patrones fluorescentes y su antígeno correspondiente, situación que se observa con frecuencia en ciertas patologías, requiere profundizar la investigación para comprender los procesos fisiopatológicos y determinar la utilidad de los ANCA como herramienta diagnóstica en estos casos. BIBLIOGRAFÍA 1.- Wiik Allan. Autoantibodies in vasculitis. Arthritis Res Ther 2003;5: Hagen EC, Daha MR, Hermans J and et. Diagnostic value of standarized assays for anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in idiopatic vasculitis. EC/BCR proyect for ANCA Assay Standarization. Kidney Int 1998;53: Wong RC, Silvestrini RA, Savige JA, Fulcher DA, Benson EM. 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