Aseguramiento de la calidad y validación de metodologías para el análisis microbiológico NORMA ISO Bqca. Alicia I. Cuesta

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1 Aseguramiento de la calidad y validación de metodologías para el análisis microbiológico NORMA ISO Bqca. Alicia I. Cuesta 1

2 Normas Sistema de calidad ETA Alimentos sanos Métodos analíticos SEGURIDAD e INOCUIDAD ALIMENTARIA Manejo sanitario Bqca. Alicia Irene Cuesta 2

3 Normas CALIDAD HIGIENICA Y SENSORIAL Alimentos sanos Sistema de calidad Métodos analíticos VIDA UTIL Manejo sanitario Bqca. Alicia Irene Cuesta 3

4 Generalidades de la Norma ISO Los resultados de los métodos analíticos: Basados en principios de aseguramiento de la calidad. Validados Acreditados según la Norma ISO Son internacionalmente reconocidos Considerados de referencia para la evaluación de conformidad de los productos de intercambio en el comercio internacional. Bqca. Alicia Irene Cuesta 4

5 NORMA ISO 17025: 2005 General requirements for competence of calibration and testing laboratory. Es la norma vigente para acreditar laboratorios. Esta norma tiene todos los requisitos que deben cumplir los laboratorios de ensayos si desean demostrar que poseen: Un sistema de calidad. Son técnicamente competentes Capaces de generar resultados técnicamente válidos. Hay un reconocimiento mutuo con otros laboratorios del mundo. Bqca. Alicia Irene Cuesta 5

6 La ley está por encima de las normas La Norma ISO no contempla el cumplimiento de : requisitos regulatorios y de seguridad relacionados con el funcionamiento del laboratorio. La Norma dice : QUÉ hay que hacer? (Requisito) El laboratorio dice el CÓMO? (cómo se implementa el requisito) Bqca. Alicia Irene Cuesta 6

7 ACREDITACIÓN (Norma ISO ) Determinar la competencia técnica del personal y la validez técnica de las operaciones. Tiene que demostrar competencia Los resultados de ensayo de un laboratorio que tiene competencia técnica serán CONFIABLES Y EXACTOS Bqca. Alicia Irene Cuesta 7

8 Particularidades de ensayos microbiológicos A diferencia de las ciencias químicas y físicas, en microbiología se trabaja con microorganismos que se multiplican por división binaria y crecen exponencialmente. Los ensayos microbiológicos incluyen ensayos de esterilidad, detección, aislamiento, recuento e identificación de microorganismos y sus metabolitos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 8

9 Pilares sobre los que se apoya la COMPETENCIA TECNICA COMPETENCIA TECNICA PERSONAL Equipamiento Ambiente MÉTODO Bqca. Alicia Irene Cuesta 9

10 Laboratorio da resultados confiables y exactos? Situación del laboratorio con respecto a: Caso 1 Caso 2 Caso 3 Personal capacitado, desarrolla bien su tarea. capacitado, desarrolla bien su tarea. Personal no está adecuadamente capacitado Instalaciones y condiciones ambientales Equipos Adecuados y suficientes Riesgo de contaminación cruzada Adecuados y suficientes Validación de la metodología no está validada Validada Validada Bqca. Alicia Irene Cuesta 10

11 Los objetivos de un sistema de calidad son: PREVENCIÓN: Evitar que se produzcan errores e ineficiencias. DETECCIÓN: Identificar los elementos causantes de los errores. CORRECCIÓN Y MEJORA: Eliminar las causas de los errores y mejorar los procesos. DEMOSTRAR: Evidenciar objetivamente que se ha cumplido con los requisitos Bqca. Alicia Irene Cuesta 11

12 ENSAYO MICROBIOLÓGICO Las operaciones que se realizan dentro del laboratorio de microbiología pueden dividirse en aquellas que son críticas para la calidad de resultados del ensayo y aquellas que tienen un menor impacto. Las operaciones críticas deben ser: controladas, monitoreadas y documentadas. Bqca. Alicia Irene Cuesta 12

13 Aseguramiento de calidad Norma ISO PERSONAL Las personas son el motor de los sistemas de calidad y por lo tanto este es un punto crítico y que la norma ISO/IEC lo trata extensamente. Tiene que haber motivación interna para planificar, implementar y mantener el sistema de calidad!! Bqca. Alicia Irene Cuesta 13

14 Requisitos Personal (Norma ISO 17025): El personal debe contar con conocimientos, experiencia y competencia de acuerdo a las tareas y responsabilidades que tenga asignadas. COMPETENCIA DEL PERSONAL: La competencia involucra conocimientos, habilidades, comprensión y actitudes. La evaluación debe ser continua. El laboratorio debe tener documentado el personal autorizado para cada ensayo. PERSONAL AUTORIZADO: personal que posee el reconocimiento formal de su capacidad para realizar en forma correcta una determinada tarea que se le ha sido asignada. Todo el personal técnico que trabaja en el laboratorio de microbiología debe recibir un adecuado entrenamiento de modo de asegurar que ejecuta en forma idónea las operaciones relacionadas con el ensayo. La capacitación es un requisito muy importante del sistema de calidad. CAPACITACIÓN DEL PERSONAL: Definición: proceso continuo y sistemático destinado a la formación, entrenamiento, actualización o perfeccionamiento específico del personal. La dirección debe definir y mantener actualizados los perfiles de puestos del personal directivo, técnico y de apoyo clave afectado a los ensayos. PERFIL DEL PUESTO DE TRABAJO: Definición: Son los requisitos mínimos de formación académica y experiencia que debe tener el personal para acceder al puesto de trabajo. Bqca. Alicia Irene Cuesta 14

15 CAPACITACIÓN DEL PERSONAL Entrenamiento: Actividad de enseñar las habilidades que una persona necesita para desarrollar su labor en un determinado puesto de trabajo. Tiene carácter eminentemente práctico. Se relaciona directamente con la tecnología, útiles, equipos, etc. que se usan en el puesto de trabajo. Formación: Actividades de incorporación de conocimientos generales y específicos necesarios para que el personal pueda desarrollar su labor en un determinado puesto de trabajo. Se hace referencia a la formación académica del personal. Bqca. Alicia Irene Cuesta 15

16 Norma ISO17025:2005 punto La dirección del laboratorio debe formular las metas con respecto a la educación, la capacitación y las habilidades del personal del laboratorio. El laboratorio debe tener una política y procedimientos para identificar las necesidades de capacitación del personal y para proporcionarla. El programa de capacitación debe ser pertinente a las tareas presentes y futuras del laboratorio. Se debe evaluar la eficacia de las acciones de capacitación implementadas. Bqca. Alicia Irene Cuesta 16

17 Capacitación del personal LABORATORIO MICROBIOLOGIA Todo el personal técnico debe recibir un adecuado entrenamiento que incluyen: Técnicas básicas de microbiología para la manipulación de cultivos y muestras en condiciones de esterilidad Adecuado criterio para el manejo de material potencialmente infeccioso. Conocimiento de normas de bioseguridad, etc. Bqca. Alicia Irene Cuesta 17

18 Requisitos Norma ISO 17025: PERSONAL COMPETENCIA TECNICA Calificación básica CAPACITACION: Identificación de las necesidades de capacitación. Planificación de la capacitación. Realización de la capacitación Documentación. Descripción de actividades y responsabilidades del personal CONDUCCIÓN TÉCNICO DE APOYO Relación de dependencia LABORATORIO Bqca. Alicia Irene Cuesta 18

19 Aseguramiento de calidad Norma ISO INSTALACIONES Y CONDICIONES AMBIENTALES Requisitos: Las instalaciones del laboratorio de ensayo (incluye fuente de energía, luz y condiciones ambientales) deben ser capaces de facilitar la realización correcta de los ensayos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 19

20 Instalaciones (cont) Debe haber una efectiva separación entre áreas vecinas en las que se realizan actividades incompatibles. Se deben tomar medidas para prevenir la contaminación cruzada. La ubicación, el diseño y la distribución de las diferentes áreas que integran el laboratorio deben minimizar el riesgo de contaminación de las muestras y los cultivos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 20

21 MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIÓN CRUZADA. En la práctica esto se puede lograr: Separando las actividades en tiempo y espacio. Mediante la construcción del laboratorio según un diseño sin camino de regreso se puede obtener una reducción significativa del riesgo de contaminación cruzada. Llevando a cabo los procedimientos de una manera secuencial, usando las precauciones apropiadas para asegurar la integridad de la muestra y del ensayo. Por ejemplo uso de recipientes herméticamente cerrados. Bqca. Alicia Irene Cuesta 21

22 SEPARACIÓN DE ÁREAS DEL LABORATORIO: No es aceptable que el laboratorio de microbiología ocupe una sola sala polivalente. Requisito: El área analítica debe estar separada de la de preparación de medios de cultivo y lavado de material. Bqca. Alicia Irene Cuesta 22

23 Separación de áreas del Laboratorio: Es conveniente separar las siguientes áreas: zona de recepción y almacenamiento de muestras. Preparación, muestreo y pesada de muestras.( importante si se analizan productos en polvo) Examen de muestras incluyendo su incubación. Manipulación de patógenos. Mantenimiento de microorganismos de referencia. Verificación de la esterilidad. Preparación de los medios y equipos incluyendo su esterilización Descontaminación. El área de Lavado de material ( después de la descontaminación) pueden compartirse con otras partes del laboratorio (precaución contaminación con trazas de sustancias que afecten crecimiento microbiano). Bqca. Alicia Irene Cuesta 23

24 El diseño del laboratorio dependerá de los ensayos que se llevarán a cabo (depende del alcance de las metodologías) Ejemplo si además de realizar ensayos por métodos tradicionales se llevan a cabo ensayos empleando técnicas de biología molecular se necesitarán áreas adicionales. El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para reducir al mínimo el riesgo de contaminación siempre que dicho riesgo sea importante para el tipo de ensayos realizados. Bqca. Alicia Irene Cuesta 24

25 Medidas para de disminuir el riesgo de contaminación y facilitar la limpieza y desinfección de las diferentes áreas. Medidas relativas a los materiales : Facilitar la limpieza: Las paredes, techos suelos y superficies de trabajo del laboratorio deben ser lisas. Las superficies de madera de las instalaciones y accesorios deben estar protegidas y selladas. Evitar maderas rugosas y sin revestir. Bqca. Alicia Irene Cuesta 25

26 Medidas relativas al diseño: Espacio disponible: Las áreas del laboratorio deben ser suficientemente espaciosas. El espacio necesario estará de acuerdo con el volumen de muestras analizadas y la organización interna del laboratorio. Facilitar la limpieza: Las uniones entresuelo, paredes y techos deben ser cóncavas. Contar con canillas, adecuadamente ubicadas, para el lavado de manos del personal. Ventilación: Las áreas de trabajo deben estar apropiadamente ventiladas y a una temperatura adecuada. Puede hacerse por ventilación natural o forzada, o mediante el uso de acondicionadores de aire. En este último caso, los filtros deben revisarse, mantenerse y reemplazarse periódicamente, acorde al tipo de trabajo que se realiza. Otros: Evitar uso de cortinas y/o persiana internas En caso de uso incluirlas en el plan de limpieza Bqca. Alicia Irene Cuesta 26

27 Otras medidas : Ausencia de documentos obsoletos, objetos o mobiliario innecesario en el área del laboratorio. Minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la realización del ensayo. Contar para el lavado de manos del personal con canillas no manuales, el jabón desinfectante debe estar dispuesto en dispensadores y toallas descartables para el secado. Los armario estanterías, equipos deben estar colocados de forma de evitar acumulación de polvo. Ejemplo armarios hasta el techo. Bqca. Alicia Irene Cuesta 27

28 Se debe controlar el acceso y el uso de las áreas que afecta la calidad de los ensayos. El acceso al laboratorio debe estar restringido sólo al personal técnico o a personas autorizadas. CONDICIONES AMBIENTALES REQUISITO: El laboratorio debe asegurarse que las condiciones ambientales, bajo las cuales se realizan los ensayos microbiológicos, no invaliden los resultados de ensayo ni comprometan la calidad requerida de los resultados. Bqca. Alicia Irene Cuesta 28

29 Ejemplos de condiciones ambientales no deseables Condiciones Ambientales Deficiente esterilidad biológica Suministro eléctrico interrumpido o deficiente Niveles de ruido o vibración excesivos. Mayor polvo en suspensión en el aire Efecto posible sobre el ensayo Contaminación de las muestras y cultivos -Variación de las condiciones de ensayo. -Pérdida de viabilidad cepas de referencia por descongelación. -Conservación inadecuada de la muestra, reactivos y medios de cultivo. Interfiere en la pesada de la muestra, polvos deshidratados para preparación de medios de cultivos o reactivos Contaminación de las muestras y cultivos Lugar a monitorear Sala de siembra y de preparación de muestras Funcionamiento de estufas, congeladores y heladeras Sala de preparación de muestras Sala de siembra y de preparación de muestras Bqca. Alicia Irene Cuesta 29

30 Requisito El laboratorio debe establecer: Un programa documentado de limpieza y desinfección que tenga en cuenta los resultados de vigilancia de las condiciones ambientales y la posibilidad de contaminación cruzada. Objetivo: Organizar las tareas de limpieza y desinfección del laboratorio de microbiología. Establecer la frecuencia de realización de las mismas Se detallan las superficies a limpiar y/o desinfectar, el nivel de limpieza requerido (trapeo húmedo, trapeo mojado, etc.), los desinfectantes a preparar y su modo de uso. El personal que realiza la limpieza. Bqca. Alicia Irene Cuesta 30

31 PLAN DE HIGIENE. Son los procedimientos operativos empleados durante la realización del trabajo en el laboratorio. Tiene como principal objetivo evitar la contaminación en todas las etapas del ensayo lo que implicaría obtener resultados erróneos, la infección del personal, etc. Bqca. Alicia Irene Cuesta 31

32 PLAN DE HIGIENE. El laboratorio debe trabajar tomando las siguientes precauciones : Relativo al trabajo propiamente dicho. Por ejemplo: Asegurarse que el área de trabajo esté limpia y que no haya corrientes de aire. Limpiar la superficie de trabajo con un desinfectante adecuado, antes y después del trabajo. Durante la siembra y manipuleo estéril de muestras no hablar y evitar toser. Abrir los tubos de ensayo y botellas cerca de la llama. Trabajar tan rápido como sea posible, evitando movimientos innecesarios. la manipulación del material patógeno o tóxico requiere trabajar en áreas cerradas o bajo campanas de flujo laminar, especialmente cuando se abren las cajas de Petri. Evitar la formación de aerosoles. Se pueden formar al abrir las cajas de Petri, los tubos, las botellas o los frascos, al usar mezcladores, jeringas, centrífugas, etc. y cuando se esterilizan ansas húmedas. Relativo al área de trabajo: Utilizar vestimenta de uso exclusivo en el laboratorio, guardapolvo de color claro, limpio y en buenas condiciones, no debe ser usado fuera del área de trabajo del laboratorio. Dejar en zona de oficinas o externa al laboratorio los abrigos. portafolios, etc. Y en el área del laboratorio no comer, beber, fumar. Relativo a la Higiene del personal técnico: Antes y al finalizar la labor en el laboratorio, el personal técnico debe lavarse las manos con un producto adecuado (jabón desinfectante). El personal debe tener uñas cortas y limpias, el pelo debe estar recogido, no tener anillos ni pulseras. Uso de barbijo si es necesario. El personal que presente infecciones serias en manos o cara no debe realizar exámenes microbiológicos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 32

33 MONITOREO AMBIENTAL: La calidad microbiológica del aire y las superficies del laboratorio en microbiología Es un indicador de la efectividad de las tareas realizadas según el: Plan de limpieza, desinfección y mantenimiento Plan de higiene. Procedimiento: MONITOREO AMBIENTAL Establece : Metodología para la toma de muestra. Lugares de toma de muestra. Límites de tolerancia o criterios de aceptación o rechazo. Frecuencia de monitoreo. Acciones correctivas a tomar en caso de desvíos de los límites establecidos. Esto se aplica tanto a control ambiental del área analítica del laboratorio como para la campana de flujo laminar. Bqca. Alicia Irene Cuesta 33

34 El programa de muestreo para monitoreo ambiental puede incluir (dependiendo del ensayo que realiza el laboratorio): Determinación cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente (recuento total o recuento de determinados tipos de microorganismos como por ejemplo hongos) Determinación cualitativa de algunos patógenos y/o indicadores dependiendo de los ensayos que realiza el laboratorio (Ejemplo: Enterobacterias, Coliformes, Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Listeria spp, Staphylococcus aureus). Bqca. Alicia Irene Cuesta 34

35 MÉTODOS PARA CONTROL CALIDAD DEL AIRE: Método pasivo, por sedimentación. Se realiza el recuento de microorganismos viables que se posan sobre una superficie de medio de cultivo (técnica cualitativa). No existe relación entre la cantidad de colonias encontradas en por placa y el volumen de aire. Método activo, por impacto. Se realiza el recuento de microorganismos viables retenidos sobre una superficie de medio de cultivo forzando un determinado volumen de aire. Métodos para control calidad del aire: MÉTODO PASIVO Y ACTIVO Los resultados de ambos métodos no son comparables (el principio de muestreo y las unidades en las cuales se expresan son diferentes). SE RECOMIENDA INTERPRETAR TENDENCIAS Y NO OBSERVACIONES AISLADAS.(tomar siempre la muestra en un mismo lugar) Bqca. Alicia Irene Cuesta 35

36 Métodos para control calidad del aire: Normas IRAM :2002 EXPOSICIÓN DE PLACAS: Toma de muestra: durante un tiempo estipulado, se exponen placas de Petri (o sea se abren las placas) con medio de cultivo no selectivo, en el área de trabajo y durante el proceso de siembra. Áreas a monitorear o zonas de toma de la muestra: sala de siembra y sala de preparación de muestras. Medio de cultivo usado. Ejemplo PCA. Tiempo y temperatura de incubación: Luego de la exposición al aire, las placas se cierran e incuban durante Ejemplo 72 horas a 30 º C. Frecuencia de realización de los controles. Ejemplo mensual. Criterio de conformidad: número máximo de colonias por tiempo de exposición de las placas. Ejemplo durante 15 minutos se permite hasta 15 colonias. Los resultados se expresan como unidades de colonias (ufc) por placa Bqca. Alicia Irene Cuesta 36

37 Métodos para Control calidad de superficies: Método Recolección Tipo de superficie Siembra Hisopado Hisopo estéril Delimitada Siembra directa Esponjatrapeado Esponja embebida en medio específico Irregular Superficies 100cm 2 Siembra de volumen conocido Caja de contacto o Petrifilm Contacto, presión y tiempo estándar Plana Incubación directa Normas de consulta: Métodos para Control calidad de superficies: ISO 18593:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal methods for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs Bqca. Alicia Irene Cuesta 37

38 Instalaciones y condiciones ambientales Equipamiento necesario Limpieza y orden Reglas de acceso y utilización de las áreas Plan de higiene Separación de áreas donde se realizan actividades incompatibles LABORATORIO Monitoreo ambiental Bqca. Alicia Irene Cuesta 38

39 Aseguramiento de calidad Norma ISO MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS REQUISITO: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea apropiada para los ensayos realizados. Este es un punto crítico! Cómo se asegura su calidad? Bqca. Alicia Irene Cuesta 39

40 Qué necesita un microorganismo para crecer? MEDIOS DE CULTIVO: Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproducción y la identificación de los microorganismos. Contienen sustancias nutritivas ph adecuado Deben estar estériles. Incubación: Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar. La atmósfera empleada.(aerobio, microaerofílico, anaerobio) Tiempo. Temperatura. Bqca. Alicia Irene Cuesta 40

41 Clasificación de medios de cultivo: 1.Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos. 2.Según su finalidad en microbiología: No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos. Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de microorganismo. Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser sangre, suero, albúmina, etc... Para microorganismos exigentes. Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 41

42 Los medios de cultivo se preparan: 1. En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes. 2. A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o 3. Pueden adquirirse medios listos para su uso. La calidad de un medio de cultivo depende de la calidad de los ingredientes básicos, la correcta formulación, calidad del procedimiento de preparación, ausencia de inhibidores, envasado y almacenamiento. Normas de consulta: ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding stuff-general rules for microbiological examinations y ISO/TS :2000 Bqca. Alicia Irene Cuesta 42

43 Requisitos de los medio de cultivo provistos por el fabricante : Los lotes de medios deben estar debidamente identificados. (TRAZABILIDAD) Cada lote recibido debe ir acompañado de evidencias del cumplimiento de las especificaciones de calidad. El fabricante debe proveer información acerca de las especificaciones de calidad del medio de cultivo, debe incluir lo siguiente: Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier suplemento. Fecha de vencimiento del medio. Condiciones de almacenamiento. Control de esterilidad. Control del crecimiento de los microorganismos de interés (target) y de los microorganismos no deseados (no target) y criterios de aceptabilidad. Controles físicos y criterios de aceptabilidad aplicados. Bqca. Alicia Irene Cuesta 43

44 Manejo de los medios de cultivo: 1.El laboratorio debe registrar la fecha : de recepción de apertura del envase. de caducidad 2. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Envases: deben estar herméticamente cerrados. (especialmente medios deshidratados) No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color. Bqca. Alicia Irene Cuesta 44

45 CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a controles periódicos que aseguren su calidad. Controles periódicos: Requisitos del agua destilada: -Conductividad. - ph - Contaminación microbiana - Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes. -Se debe llevar un registro actualizado de los mismos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 45

46 Procedimiento para preparación de medios de cultivo, diluyentes y reactivos Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. En dicho procedimiento debe haber una descripción del equipamiento necesario. El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificación y otros datos en los medios de cultivo y reactivos.(trazabilidad) Debe haber un registro de preparación de medios de cultivo y reactivos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 46

47 LAVADO DE MATERIAL: Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto lavado del material reciclable. El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta tarea. Pasos: Descontaminación material de vidrio. Enjuague y se lavado con agua caliente y detergente apropiado ( extran neutro diluido al 2%) Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un nº de veces con agua destilada. Eliminar el detergente El material se seca en estufa y se acondiciona para ser esterilizado. Bqca. Alicia Irene Cuesta 47

48 Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes: Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios de cultivo y diluyentes? PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo. La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba se corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo. Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o distribuir los medios o diluyentes. Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se esteriliza por filtración. Bqca. Alicia Irene Cuesta 48

49 Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo: Posibles problemas Anormalidad Falla en la solidificación del medio sólido Formación de precipitado Posible causa Sobrecalientamiento del medio durante la preparación Peso incorrecto del agar Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes Sobrecalientamiento del medio durante la preparación ph medido incorrectamente Pobre calidad del agua. Pobre calidad del medio deshidratado. ph incorrecto Pobre calidad del agua. Pobre calidad del medio deshidratado. ph medido incorrectamente. Contaminación externa con químicos. Sobrecalientamiento del medio durante la preparación Bqca. Alicia Irene Cuesta 49

50 Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo: Posibles problemas Anormalidad Color anormal Selectividad pobre Medio inhibitorio/ Productividad baja Sobrecalientamiento del medio durante la preparación ph incorrecto Contaminación externa. Sobrecalientamiento del medio durante la preparación ph incorrecto. Formulación inadecuada. Pobre calidad del medio deshidratado. Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio demasiado caliente o en alta proporción. Pobre calidad del agua. Posible causa Pobre calidad del agua o del medio deshidratado. Formulación inadecuada Ej. ingredientes y suplementos mal pesados. Sobrecalientamiento del medio durante la preparación Pobre calidad del medio deshidratado Bqca. Alicia Irene Cuesta 50

51 EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: El objetivo es definir la: metodología para evaluar la PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de cultivo sólido, semisólido o líquidos ya preparados y esterilizados, utilizados en el laboratorio de microbiología. Cultivo de trabajo (según Instructivo de cultivos de referencia) Se prepara un cultivo en fase estacionaria de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas en el laboratorio en un caldo no selectivo (por ejemplo caldo cerebro corazón) Bqca. Alicia Irene Cuesta 51

52 PRODUCTIVIDAD: Definición: rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en el medio de cultivo. Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de referencia target para evaluar la productividad (ver anexo B de la norma ISO/TS :2000) EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como por ejemplo el PCA se evalúa el adecuado desarrollo de las cepas target o blanco. En este caso se usan E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633 Bqca. Alicia Irene Cuesta 52

53 SELECTIVIDAD: Definición: la supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de cultivo. Según el medio se usa una cepa apropiada de referencia no-target para evaluar la selectividad (ver anexo B de la norma ISO/TS :2000) En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril sulfato (LST) se evalúa el desarrollo de las cepas target y no target. En este caso las cepas target que se usan son E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC Evalúa reacciones características: gas y turbidez. Bqca. Alicia Irene Cuesta 53

54 En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar: El crecimiento de las cepas target Hay que prestar atención también a la apariencia, tamaño y morfología de las colonias (especificidad) El crecimiento de las cepas no-target debe estar en parte o completamente inhibido. Bqca. Alicia Irene Cuesta 54

55 PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO según Norma ISO/TS :2000 SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MÉTODOS: a)pruebas cuantitativas b) Pruebas semi-cuantitativas c) Pruebas cualitativas Bqca. Alicia Irene Cuesta 55

56 MEDIO DE REFERENCIA El uso de un medio de referencia específico es obligatorio en los métodos de cuantitativos (ver anexo B de la norma ISO/TS :2000) Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas, el uso de un medio específico de referencia o un medio de cultivo que da una la reacción positiva" ayuda al ínterpretar los resultados. El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad (por ejemplo ser un medio listo para el uso de calidad asegurada por el proveedor) Bqca. Alicia Irene Cuesta 56

57 PRODUCTIVIDAD: Pruebas cuantitativas: la proporción de Productividad PR es definido como sigue: PR = Ns /No donde Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar (obtenido de uno o más placas) No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser 100 ufc. Bqca. Alicia Irene Cuesta 57

58 PRODUCTIVIDAD: Pruebas cuantitativas CRITERIO DE CONFORMIDAD: Anexo B de la norma ISO/TS :2000. Allí figuran: Los microorganismos Tiempo y temperatura de incubación Criterios Medio de referencia que debe usarse según el medio a evaluar. PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que el medio de cultivo sea conforme. En general para que los medios no selectivos como el PCA sea conforme, el PR debe ser a 0,7. Bqca. Alicia Irene Cuesta 58

59 PRODUCTIVIDAD: Ejemplo Pruebas cuantitativas Se desea evaluar la productividad del PCA. El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA) 1) Ns ( dil -6):140 ufc No ( dil -6): :170 ufc PR = Ns /No PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme 2) Ns ( dil -6):100 ufc No ( dil -6): 230 ufc PR = Ns /No PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado no es conforme en cuanto a su productividad. Bqca. Alicia Irene Cuesta 59

60 PRODUCTIVIDAD: Pruebas semi-cuantitativas. Se inocula en forma de estrías diluciones del cultivo con ansa calibrada de acuerdo a la figura o modelo. Las placas inoculadas se incuban a temperatura y tiempo que depende del medio de cultivo evaluado y se observa el crecimiento. Se evalúa la productividad del medio teniendo en cuenta el valor de cada estría con crecimiento. Bqca. Alicia Irene Cuesta 60

61 PRODUCTIVIDAD : Pruebas cualitativas Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de crecimiento. Score para medios sólidos: 0 no hubo crecimiento 1 hubo crecimiento débil 2 hubo buen crecimiento. Score para medios líquidos: 0 no hubo turbidez 1 hubo turbidez muy tenue 2 hubo buena turbidez Bqca. Alicia Irene Cuesta 61

62 SELECTIVIDAD: Para llevar a cabo la prueba de la selectividad, el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la referencia se inoculan con un microorganismo y nivel apropiado. Se emplea una suspensión del microorganismo de no-target que contiene 10 4 cfu a 10 6 cfu por ml se inocula en la placa o en el tubo de medio. Bqca. Alicia Irene Cuesta 62

63 Certificado de control de calidad de un medio de cultivo no selectivo Bqca. Alicia Irene Cuesta 63

64 Reactivos EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para los ensayos realizados. Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioquímicas Realizo controles positivo y negativo utilizando microorganismos que sean trazables a colecciones de cultivos nacionales o internacionales reconocidas. Bqca. Alicia Irene Cuesta 64

65 Síntesis En microbiología se le da especial énfasis a la calidad de los medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada para los ensayos realizados. Un punto crítico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO y acreditar el laboratorio es la preparación, esterilización y evaluación de la calidad de los medios de cultivo empleados para realizar el ensayo. Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditación se basan en la Norma ISO/TS :2000 y ISO/TS :2000. Esto implica una revisión de las prácticas cotidianas realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que los medios usados son adecuados a la finalidad prevista. Bqca. Alicia Irene Cuesta 65

66 Aseguramiento de calidad Norma ISO CULTIVOS DE REFERENCIA Cultivos de referencia: REQUISITO Para acreditar o mantener la acreditación de un ensayo, el laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia. El número y la elección del género y especie de las mismas dependerá de los ensayos que se efectúan y las necesidades particulares de estos últimos. El laboratorio debe elaborar e implementar un procedimiento documentado para el uso y manejo de cultivos de referencia. Es NECESARIOS PARA DEMOSTRAR TRAZABILIDAD. Definición de Material de referencia : Material o sustancia que posee valores de una o más propiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibración de aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a estos materiales. ( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1) Bqca. Alicia Irene Cuesta 66

67 Para qué son necesarios los cultivos de referencia? Evaluación de la calidad de los medios de cultivo. Realizar controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos. Realizar controles de calidad de reactivos. Pruebas confirmatorias. Ejemplo prueba de CAMP Validar métodos microbiológicos. Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo de métodos microbiológicos. Bqca. Alicia Irene Cuesta 67

68 Cultivos de referencia: Definición: Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo. Requisitos: Células microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD). Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas con instrucciones para su recuperación. Se debe tratar de un cultivo puro.(pureza). Genéticamente estables.( ESTABILIDAD) ( mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas) Bqca. Alicia Irene Cuesta 68

69 CEPAS DE REFERENCIA: PARA DEMOSTRAR LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE DE UNA COLECCIÓN NACIONAL O INTERNACIONAL DE CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO. Son microorganismos definidos: Por lo menos a nivel de género y especie. catalogados. muy caracterizados. de origen conocido. [ISO :2000] Se comercializan liofilizadas. Los organismos de acreditación deben considerar válida la fuente de dónde provino la cepa. Bqca. Alicia Irene Cuesta 69

70 En la práctica para cumplir con el requisito prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas de el número de repiques a partir de la cepa de referencia debe ser limitado ( en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia ) Si una cepa se adquiere por cualquier vía que no sea la propia colección, NO se puede mencionar utilizando el número que tienen en esa colección, sino solamente como derivada de la cepa de colección. Bqca. Alicia Irene Cuesta 70

71 Cepas de colección de referencia Bqca. Alicia Irene Cuesta 71

72 CEPAS DE REFERENCIA: REGISTRO DE CEPAS DE REFERENCIA: Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo TIPO y Nº de colección. Nº de lote. Fecha de recepción. Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO). Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable. Reconstitución de las cepas de referencia: Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de microbiología se registran en planilla según procedimiento. Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 º C hasta su uso. Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran utilizando el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las instrucciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas. En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un control de calidad de pureza y viabilidad y se registra. Bqca. Alicia Irene Cuesta 72

73 Control de calidad de pureza y viabilidad: Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN REPIQUE. Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos. Frecuencia de realización de este control: para las cepas de reserva almacenadas el laboratorio la establecerá en cada caso. Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas: Fecha del control. Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección. Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo). Pruebas a realizar (depende del microorganismo): Coloración de Gram, Características de las colonias en medios selectivos, Pruebas bioquímicas y serológicas, etc. En caso de no presentar las características establecidas se ejecuta la Acciones correctivas establecida en el procedimiento. Bqca. Alicia Irene Cuesta 73

74 Cepas de reserva: Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia. [ISO :2000]. Las cepas de reserva son una serie de alícuotas de cultivos idénticos obtenidas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia. CREF REPIQUE UNICO Cres Cres Cres Cres Cres Cres Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio. Bqca. Alicia Irene Cuesta 74

75 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA obtenidas a partir de cepas de referencia : A)LIOFILIZACIÓN. B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS. Uso de agentes Crioprotectores Cepas de reserva: Cepas de reserva: Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio) Debe haber un lugar destinado a almacenar las cepas de reserva. Debe estar claramente señalado que se trata de cepas potencialmente peligrosas y su manipulación restringida a personal autorizado. Bqca. Alicia Irene Cuesta 75

76 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA A) LIOFILIZACIÓN. Definición: es un proceso de desecación desde el estado congelado. Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica ( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V. Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol. PRODUCTO: se puede conservar en refrigeración o a temperatura ambiente por años. B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS: Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica ( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V. Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol. Glicerol al 10% Caldo BHI con glicerol 20%. Bqca. Alicia Irene Cuesta 76

77 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS: Proceso de congelación: Equipamiento o insumos para lograr la congelación (Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido). Temperaturas de congelación: Deseable a -70 o -80 º C o menores temperaturas. A temperaturas más altas como -20 º C no es lo ideal pero tal vez sea la única forma posible. Es preferible a -40º C. Envases: Uso criovial o tubo estéril. PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura congelación por años. Inconveniente: problemas y pérdida de las cepas la falta de suministro de energía, falta de insumos o avería del equipamiento. Bqca. Alicia Irene Cuesta 77

78 LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA!! Es muy importante un buen método de conservación de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana auténtica!! Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos básicos de Microbiología. Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo. Las instrucciones del fabricante de los sistemas de preservación de cepas disponibles comercialmente deben ser rigurosamente respetados y observados. En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no deben volver a congelarse. El criovial vencido se elimina del cepario y se registra. Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a usar Bqca. Alicia Irene Cuesta 78

79 FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelación (para su almacenamiento), está determinada por los siguientes factores: a)tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten mejor que las Gram negativas. b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser expuesto a bajas temperaturas. Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas: 1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de sobrevivir. Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos resistentes al shock térmico. Ideal es fin etapa logarítmica principio fase estacionaria tiene mayor probabilidad de recuperación. ( en bacterias en general es 24 horas de incubación a 37º C) 2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un papel importante Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio sólido Bqca. Alicia Irene Cuesta 79

80 Ejemplo: Supervivencia de los microorganismos almacenados a 20º C en Mast Cryobank Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR Microorganismo Supervivencia en meses Enterobacter aerogenes 48 Pseudomona aeruginosa 18 Salmonella typhimurium 48 Staphylococcus aureus 48 Listeria monocytogenes 48 Listeria ivanovii 48 Rhodococcus equi 48 Bacillus cereus 24 Clostridium perfringes 48 Bqca. Alicia Irene Cuesta 80

81 Cepas de trabajo: Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo precisen. Obtención de cepas de trabajo: Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado utilizando un ansa estéril e incubando en condiciones adecuadas. Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas. Bqca. Alicia Irene Cuesta 81

82 CEPA DE REFERENCIA Reconstitución Cultivada una sola vez Obtención de CEPAS DE RESERVA Conservación por distintos métodos ( liofilización y congelación) (especificar tiempo y condiciones de almacenamiento) Descongelación/reconstitución CEPAS DE TRABAJO (especificar tiempo y condiciones de almacenamiento) * * * Esquema de cultivos de referencia: *Controles de pureza y pruebas bioquímicas de la cepa. Referencia: Guía ENAC-04 Utilización en el control de calidad, validación, etc de los ensayos Bqca. Alicia Irene Cuesta 82

83 PASOS a seguir para el manejo de los cultivos de referencia: PROVEEDOR DE CEPA LABORATORIO LABORATORIO LABORATORIO Adquisición de cepa de referencia (C Ref): -Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida. Subcultivo de C Ref: -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO). Preparación de la cepa de reserva (Cres) -Control de pureza y viabilidad periódicos (REGISTRO). -Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva Incorporada al cepario. CONDICIONES CONTROLADAS DE ALMACENAMIENTO DE LA CEPA DE RESERVA Subcultivo la cepa de reserva (C t): -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO). USO PARA CONTROLES DE CALIDAD Bqca. Alicia Irene Cuesta 83

84 Aseguramiento de calidad Norma ISO EQUIPOS REQUISITOS: EQUIPOS El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos necesarios para la correcta ejecución del ensayo. Los equipos y su soporte lógico usados en la realización del ensayo y muestreo deben permitir lograr la EXACTITUD REQUERIDA y cumplir con las especificaciones establecidas para los ensayos. Hay equipos cuya exactitud es clave en el impacto sobre la incertidumbre de los resultados, por lo que es imprescindible que cumplan siempre con las especificaciones más relevantes del método. Bqca. Alicia Irene Cuesta 84

85 Equipos habituales de un laboratorio microbiológico : Material de uso general: Material de vidrio o plástico (Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.), instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc. Equipos volumétricos como pipetas, distribuidores automáticos, sembradores en espiral, etc. Instrumentos de medida: termómetros, cronómetros, balanzas, medidor de ph, contadores de colonias, etc. Estufas, autoclaves, baños termostáticos, heladeras, congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de filtración, etc. Bqca. Alicia Irene Cuesta 85

86 Calibración. Definición: Conjunto de operaciones que PERMITEN ESTABLECER, en condiciones especificadas, LA RELACIÓN EXISTENTE ENTRE : los valores indicados por el instrumento de medida o un sistema de medida o un material de referencia y los correspondientes valores conocidos del mensurando.(valores de una magnitud obtenidos mediante un patrón de referencia) Bqca. Alicia Irene Cuesta 86

87 Calibración: Formas de establecer esta relación es mediante: Tablas de corrección Rectas o curvas de calibración otras CALIBRACION Elimina el error CORRECCION Incertidumbre Bqca. Alicia Irene Cuesta 87

88 Ejemplo: Calibración de un termómetro Qué hago? 1.Mido n veces a una Temperatura y completo la TABLA 1. 2.Esto lo realizo para diferentes temperaturas (Ti) según los requerimientos. 3. Calculo la corrección e incertidumbre para cada punto. TABLA 1 Termómetro a calibrar (Tx) Termómetro patrón (Tp) Termómetro a calibrar (ºC) Termómetro patrón (ºC) Tx Tp Baño de agua El baño se pone a Ti Bqca. Alicia Irene Cuesta 88

89 Certificado de calibración de un termómetro Ejemplo de resultados Indicación del termómetro (º C) Corrección (º C) Incertidumbre (º C) Bqca. Alicia Irene Cuesta 89

90 Certificado de calibración de un termómetro Debe figurar: Descripción e identificación del instrumento que se calibró. Fecha de calibración. Fecha de emisión del certificado de calibración nombre del cliente Metodología empleada para calibrar. Rango de calibración. Resultados: corrección e incertidumbre para cada temperatura. Bqca. Alicia Irene Cuesta 90

91 Incertidumbre de la medición. Definición: Parámetro asociado al resultado de la medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente asignados al mensurando. INDICA LA CALIDAD DE UNA MEDICIÓN. Tolerancia. Definición: Indica el rango de variabilidad aceptable para un dado valor. Es un concepto asociado con la especificación. Relación de exactitud (RE) RE = Especificación Incertidumbre ISO recomienda RE>3:1, preferiblemente hasta 10:1 Bqca. Alicia Irene Cuesta 91

92 VERIFICACIÓN. Definición: Confirmación por examen y provisión de evidencia de que los requerimientos especificados han sido satisfechos. Ejemplo: Verificar diariamente una balanza con una pesa calibrada. Verificación del instrumento de medición VERIFICACIÓN TOMO DECISION Asignar a la tarea de medición Reparar/ ajustar Usarlo para otro equipo Declararlo fuera de uso Bqca. Alicia Irene Cuesta 92

93 REQUISITOS: EQUIPOS (cont) Antes de poner en servicio un equipo se lo debe calibrar o verificar con el fin de asegurar que responde a las exigencias especificadas del laboratorio y está conforme a las especificaciones normalizadas pertinentes. El equipo debe ser verificado o calibrado antes de su uso. El laboratorio debe documentar e implementar Programas para calibración y/o verificación limpieza, mantenimiento y esterilidad de los equipos cuando sea necesario. (Los que tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos). REQUISITOS PROVEEDORES DE CALIBRACION DE EQUIPOS: La calibración de los equipos debe ser llevada a cabo por laboratorios de calibración que demuestren su competencia y su capacidad de medición y trazabilidad (Laboratorio acreditado o aceptado por el organismo de acreditación). Bqca. Alicia Irene Cuesta 93

94 Tipo de Equipamiento Requisitos Frecuencia sugerida Termómetro de referencia Recalibrado y plenamente trazable Cada 5 años Termocupla de referencia Recalibrado y plenamente trazable Anualmente. Termómetro de trabajo Frente a un termómetro de referencia en punto de congelación y/o rangos de Anualmente. temperatura de trabajo Termocupla de trabajo Frente a un termómetro de referencia en punto de congelación y/o rangos de Anualmente. temperatura de trabajo Balanza Calibración plenamente trazable Anualmente. Pesas de calibración Pesas de control Microscopios Calibración plenamente trazable Frente a pesa calibrada o verificar en la balanza inmediatamente después de la calibración trazable Calibración trazable al micrómetro (cuando sea apropiado) Bianualmente/ Anualmente. Anualmente. Inicialmente Directrices para calibración de equipos en el laboratorio de microbiología. G-ENAC-04. Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos Centrifuga Calibración trazable o verificación con un tacómetro independiente Anualmente. Cronómetro Frente a la hora oficial Anualmente. Bqca. Alicia Irene Cuesta 94

95 REQUISITOS: EQUIPOS (cont) Es de primordial importancia que el laboratorio cuente con un programa formal, documentado e implementado de mantenimiento de equipos. El mantenimiento de los equipos esenciales debe realizarse a intervalos especificados. (por el departamento de mantenimiento, por el proveedor, fabricante, etc). En el documento ISO 7218: 1996 (E), se facilitan directrices sobre el mantenimiento de los equipos. PARA CADA EQUIPO UTILIZADO EN LOS ENSAYOS EL LABORATORIO DEBE TENER: Identificación inequívoca y registro del equipo (con su soporte lógico o software). Los resultados de las calibraciones y verificaciones. Las instrucciones actualizadas de uso y mantenimiento del equipo disponibles (incluido el manual suministrado por el fabricante) para el uso del personal del laboratorio. Bqca. Alicia Irene Cuesta 95

96 Autoclave Los controles biológicos: Evalúan la efectividad de la totalidad del proceso de esterilización. Contienen esporas de género Bacillus. En todos los casos los resultados obtenidos de controles químicos y biológicos se deben registrar. Bqca. Alicia Irene Cuesta 96

97 Verificación de la temperatura de trabajo: Se realiza un monitoreo continuo de las temperaturas de las estufas, heladeras, congeladores usados para la realización del ensayo. La temperatura del baño termostático se registra antes de su uso. Registro de control de temperatura: -Equipo. -Nº de inventario. -Instrumento: Corrección e incertidumbre del termómetro. -Rango de aceptación. -Tolerancia. Bqca. Alicia Irene Cuesta 97

98 Aseguramiento de calidad Norma ISO MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS El laboratorio debe tener procedimientos para : El transporte La recepción La protección, el almacenamiento. La manipulación La conservación o la disposición final de las muestras a ensayar. Bqca. Alicia Irene Cuesta 98