Métodos moleculares para estudiar filogenia y ecología del fitoplancton

Transcripción

1 Métodos moleculares para estudiar filogenia y ecología del fitoplancton

2 Métodos para identificar y estudiar diversidad y filogenia Convencionales (FENOTIPO: morfología, estructuras celulares) Moleculares (GENOTIPO: marcadores genéticos, secuencias de determinados genes, patrones de secuencias repetitivas) Combinación de ambos (POLIFASICO)

3 Métodos convencionales Microscopía Citometría de flujo Análisis de pigmentos:. Chl a. ficocianinas Fotosíntesis:. producción de O 2. captación de C 14

4 Limitaciones de los métodos convencionales: - microscopía: se centra en organismos más numerosos, grandes, requiere tiempo. - No se llega a una relevamiento completo de la diversidad. Métodos moleculares: Extracción de ácidos nucleicos, PCR, clonado, secuenciación. - sesgos debidos a los primers para el PCR y amplificación preferencial de ciertos organismos.

5 Métodos moleculares Se basan en el empleo de ácidos nucleicos (ADN, ARN). Extracción de ADN o ARN, PCR, clonación, secuenciación. Sesgos debidos a los primers para el PCR y amplificación preferencial de ciertos organismos.

6 Estudios en fitoplancton Eucariotas: estudios que emplean métodos tradicionales >>>> estudios con métodos moleculares. Procariotas: estudios moleculares >>>> estudios moleculares sobre fitoplancton eucariota.

7 ambiente Riqueza Diversidad 6. filogenia Toma de muestra % similitud 1. Extracción de ADN del ambiente y 2. PCR 16S 3. clonado 4. secuenciación 5. Editar, alinear CGGGATGCTTAGGCATCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAAT CTGGCTCCAGGTCGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGAT GTGCCGAGAGGTGAAAGATTTATCGCCTGGAGATGAGCTCGCGTCTGAT TAGCTAGTTGGCGGTGTAAGGGACCACCAAGGCATCGATCAGTAGCTGG TCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACG GAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTT CTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAATAAGCATCGGCTAAC TCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAA TGATTGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAA GAGTTTGGCTTAACCAAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTG CGGTAGGGGCAAAAGGAATTCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATC AGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGTTTT Búsqueda de homologos

8 Extracción de ADN. Lisis de las células (física, química, combinación). Separación de fracciones (centrifugación, detergentes,). Precipitación del ADN (solución-pptado). Limpieza del ADN. Solubilización (ADN en solución) Manual o empleando kits comerciales

9 qué se hace con el ADN? Métodos basados en conocer la secuencia de determinado gen: - para identificar organismos (quién) - para estudiar diversidad de organismos (quiénes y cuántos de cada uno) - para conocer la relación de parentesco entre los organismos. Métodos de fingerprinting: permiten conocer el perfil de una comunidad determinada pero no la identidad de sus componentes

10 Métodos basados en secuenciación BASADOS EN PCR (polymerase chain reaction reacción en cadena de la polimerasa) DE UN GEN DE INTERES (que proporciones información) (identidad y filogenia)

11 qué genes se amplifican en el PCR? ARN ribosómico (subunidad pequeña) Por qué? Componente central de la síntesis proteica Distribuido universalmente y estructura conservada Conservado funcionalmente Tiene regiones en las que los nucleótidos están conservados en todas las células Abundante (>80% del ARN total celular) Tiene regiones que evolucionan lentamente y otras rápidamente Número estadísticamente suficiente de nucleótidos No sufre transferencia horizontal

12 Ribosoma procariota 21 Proteínas Subunidad 30S 16S ARNr Ribosoma Subunidad 50S 5S ARNr 34 Proteínas 23S ARNr Escherichia coli ARNr 16S

13 Ribosoma eucariota 80S 60S 40S

14 Otros genes: METODOS -nifh (nitrogenasa) -rpo (ARN polimerasa) -cpc (operón ficocianina) -ITS (espaciador transcripto interno):permite conocer diversidad intra específica. 16S ITS 23S PCR ITS-L 573 pb trna Ile trna Ala

15 qué se hace con los productos de PCR? Fragmento de ADN con la información que necesito Dependiendo del tipo de muestra original, con ese fragmento amplificado se hacen distintos procedimientos (de acuerdo a lo que se quiere saber) -cultivo o aislado (muestra simple) -muestra ambiental compleja (comunidad)

16 Si partimos de un aislamiento o una floración (monoespecífico):. Secuenciación directa del producto de PCR (secuenciador). Edición de la secuencia (cortar extremos, discriminar bases, software específicos). Comparación de la secuencia con bases de datos (Genbank, RDP, Silva, etc.)

17 Secuenciación del producto de PCR bp GM1 (518) Secuencia parcial M13F (-75) (-90) M13R Secuencia completa

18 Edición de la secuencias > _I10_1-A.ab1 950 NNNNNNNNCTTCNCAGATCTCTGTGTGCCTAGGTATCCACCATGAGCCCT TATTAGCTTGACCACTTACTCTTACTCTTATCTTTCTATATGCAGTTTTC AAGGTTCTGGCTGGTTCATCACCAGCAGTCTAGGTCTTTCCTAGTTGCTG GGGATCACCGGAAATATAATACTTTGAAAGAGACTTGACCAATTCTCGAC CGACCTAGAGTAGACCATTTGATTCTCTATTCGCTTTCCGCTTTCGATTC TTCAATGGGTAGGTCTCCCTAAAAGGAGGTGATCCAGCCACACCTTCCGG TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACCAGTCCTACCTTAGGC ATCCCCCTCCTTTCGGTTGGGGTAATGACTTCGGGCGTGACCAACTCCCA TGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAATCTTTCTAGAAGATCTCCTACAATAT Alineamiento: bases homólogas se alinean entre sí en columnas TCTCAGCTGCCATGGAAAATCGATGTTCTTCTTTTATTCTCTCAAGATTT TCAGGCTGTATATTAAAACTTATATTAAGAACTATGCTAACCACCTCATC AGGAACCGTTGTAGGTGGCGTGGGTTTTCTTGGCAATCGACTCTCATGAA AACTACGAGCTAAATATTCAATATGTTCCTCTTGACCAACTTTATTCTGC ATTTTTTTTGAACGAGGTTTAGAGCAAGCTTCAGGAAACTGAGACAGGAA TTTTATTAAAAATTTAAATTTTGAAGAAAGTTCAGGGTTAATAGCATCCA TTTTTTGCTTTGCAAGTTCCTCAGCATTCTTAACAAAGACGTCTCTTTTG ACATGTTAAAAGTTAAACCTCCTGTGTGAAATGTTATCCGCTCACAATTC CACACATTATACGAGCCGAAGCATAAAGTGTAAAGGCCTGGCGTGGCTAA TGAGTGAGCTAACTCCACATAATTGCTTGCGNCACTGCAATTGGATCCGG

19 BASES DE DATOS DE SECUENCIAS Genbank (NCBI: Ribosomal Database Project (RDP: SILVA (

20 BASES DE DATOS DE SECUENCIAS

21 IDENTIFICACION Y ANALISIS FILOGENETICO Métodos para la reconstrucción de filogenias Matriz de distancias Calcula matrices de distancias por comparación binaria de las secuencias alineadas (UPGMA) Máxima parsimonia Tiene en cuenta modelos evlutivos: preservación es más probable que el cambio Máxima verosimilitud Busca el modelo evolutivo que tiene más probabilidad de haber producido los datos observados

22 Construye árbol filogenético

23 Arbol filogenético universal

24 Métodos basados en secuenciación (diversidad y composición) Si partimos de una muestra compleja:(lago, océano, sedimentos, biofilms) Células de distintas especies 1. Extracción ADN 2. PCR amplification of the 16S rrna gene

25 3. Clonado de los productos de PCR Ligación Vector de clonado con gen de resistencia Vector con insertos E.coli Transformación 16S rrna clones

26 Siembra en placas con medio de cultivo con antibiótico Colonias de clones: cada uno tiene Una copia del gen 16S de una bacteria Secuenciación directa de cada clon

27 Edición de la secuencias Alineamiento: bases homólogas se alinean entre sí en columnas

28 IDENTIDAD DE CADA CLON Y SU RELACION DE PARENTESCO CON OTROS MICROORGANISMOS QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.

29 RESUMEN HASTA AHORA; Métodos basados en conocer la secuencia de ADN de genes: - para identificar organismos -para estudiar diversidad de organismos - para conocer la relación de parentesco entre los organismos Se caracterizan por: extracción y purificación de ADN seguido por PCR y secuenciación. Secuenciación: depende de si partimos de un cultivo o muestra monoespecífica o si partimos de una muestra ambiental compleja..

30 Métodos de fingerprinting Permiten conocer el PERFIL de una comunidad determinada pero no la identidad de sus componentes patrones de las comunidades, Sirve para COMPARAR efecto de distintas condiciones ambientales sobre la estructura de la comunidad. ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA STRR: Short Tandemly Repeated Repetitively sequences REP PCR: Repetitive Enterobacterial sequences DGGE: Denaturant Gradient Gel Electroforesis TRFLP: Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism

31 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) 16S rrna gen Amplificación con primers fluorescentes Digestión con enzimas de Restricción Separación de los fragmentos electroforesis capilar (secuenciador)

32 TRFLP (Moeseneder et al. 2001)

33 Denaturing (Temperature) Gradient Gel Electrophoresis (DGGE and TGGE) 16S rrna gen Amplificación parcial con primers que tienen GC clamp

34 DGGE Se pueden secuenciar las bandas de interés para conocer la identidad de los organismos.

35 Short Tandemly Repeated Repetitively sequences STRR El gen rnpb (RNasa P) de cianobacterias con heterocistos contiene secuencias cortas repetidas en tandem que hacen que el tamaño del gen aumente (hélice P12) Existen varias combinaciones de primers

36 RESUMEN HASTA AHORA Métodos que permiten conocer la secuencia de ADN de genes: - para identificar organismos -para estudiar diversidad de organismos - para conocer la relación de parentesco entre los organismos Se caracterizan por: extracción y purificación de ADN seguido por PCR y secuenciación. Secuenciación: depende de si partimos de un cultivo o muestra monoespecífica o si partimos de una muestra ambiental compleja. Métodos que permiten conocer el perfil de una comunidad (fingerprinting): ARDRA, TRFLP, DGGE, ARISA, STRR) PATRONES O CODIGOS DE BARRA DE LA COMUNIDAD EN DETERMINADA CONDICION AMBIENTAL

37 Métodos para estudiar función (fisiología) de los microorganismos en el ambiente PCR en tiempo real PCR cuantitativo Incubación con isótopos combinado con FISH

38 PCR en tiempo real: para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación del ADN. Un ejemplo de colorante que permite esta detección es el SYBR Green (excitación luz azul: λmax = 488 nm) emite luz verde, λmax = 522 nm). Estudios fisiológicosfuncionales

39 Estudios fisiológicos-funcionales 1. Extracción de ARN del ambiente ambiente Toma de muestra 2. Retro transcripción usando primers específicos para el gen funcional en estudio (metabolismo del C, toxinas, etc.) PCR en tiempo real usando el ADN obtenido de la RT (ADNc)

40 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas Ecología de Cylindrospermopsis raciborskii * Especie tóxica, tropical (Pádisák, 1998) con actual distribución en zonas subtropicales (Uruguay) y templadas (Europa, América del Norte). Hipótesis de expansión reciente a climas más templados: 1. *Colaboración cambio climático con y Sylvia aumento Bonilla, de la Luis temperatura Aubriot y del Carla agua Kruk. permitió Sección que cepas Limnología, de origen tropical Fac. de se Ciencias. dispersaran Proyectos a hábitats TWAS más templados. y FCE-ANII 2. la especie tiene la capacidad de tolerar un amplio rango de condiciones climáticas (plasticidad fisiológica). 3. ecotipos con distintos requerimientos de luz y temperatura se dispersan a áreas más templadas.

41 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas Cepas aisladas de floraciones en lagos de Uruguay: Tolerancia a bajas temperaturas (14 C) y distintas intensidades de luz. Morfología variable (Vidal & Kruk, 2008). Toxinas: cylindrospermopsina (CYL) bajas concentraciones, saxitoxina (SAX) niveles muy altos. OBJETIVO: Caracterización genotípica y fenotípica de aislamientos uruguayos de Cylindrospermopsis raciborskii.

42 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas ARNr 16S (NJ) Gen ribosomal 16S 16S 27F1 (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 809R (5-GCTTCGGCACGGCTCGGGTCGATA-3) 100% Se confirma la identidad - Cylindrospermopsis raciborskii

43 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas nifh (NJ) Australia/Africa Europa 99% América

44 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas ITS (NJ) Australia África Europa Ambos aislamientos pertenecen a un cluster de cepas Americanas.

45 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas Diversidad intraespecífica - reppcr BOX ERIC 1kb R P R P Incluyendo cepa norteamericana ERIC BOX 14 CC 14 CC R DIFERENCIAS ENTRE AMBOS AISLAMIENTOS DIFERENCIAS CON CEPA NORTEAMERICANA

46 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas Expresión de toxinas en C. raciborskii mediante PCR en tiempo real (PCR-TR) * Cultivos en distintas condiciones ambientales, extracción de ARNm, RT- PCR y cuantificación relativa de expresión de genes involucrados en la biosíntesis de las dos toxinas que posee la especie. Primers Región del gen Secuencia Tm (ºC) Producto (nº pb) Par SXT Gen Sxt1 Par SXT CAA ATT CCC GCA GTC ACT CA CAA CCA GTT CGT GCC TCA AA TGC AGT GGG AGC AGC TTT AG 55, ,9 56,5 71 Saxitoxina (sxt1, O- carbamoiltransferasa) Gen Sxt1 GAT CGC CTG CTG TTG AAG TG 56,5 Par AOA Gen aoaa Par AOA CCG CTT CAT GAG TTG CTA GA GAA CCG CCA AAC TCA AAG AC CTG GAA TGC TGC GCC TAA AC 54, ,4 56,9 72 Cylindrospermopsina (cyra, amidinotransferasa) Gen aoaa TCC ATC GGA CAC TCC CAG AA 56,8 *Tesis de Maestría de Natalia Rigamonti, Tutora: Claudia Piccini.

47 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas PCR en tiempo real de los aislamientos en distintas condiciones de cultivo (N y P). Genes sxt1 y 16S. Primers Sxt1 Sxt1 CCMP (-N,-P) Sxt1 CCMP (-N,+P) Sxt1 Cepa14 (+N,+P) Sxt1 Cepa 14 (-N,+P) Sxt1 Cepa 19 (-N,+P) Primers 16S Sxt1 CCMP (-N,-P) Sxt1 CCMP (-N,+P) Sxt1 Cepa14 (+N,+P) Sxt1 Cepa 14 (-N,+P) Sxt1 Cepa 19 (-N,+P) Ct CCMP (-P) Ct CCMP (+P)

48 Ecología de poblaciones: cianobacterias tóxicas RESULTADOS PRELIMINARES DE EXPRESIÓN Muestra Ct 16S Ct Sxt1 Ct Ct 2 - Ct CCMP (-N-P) CCMP (-N+P) MVCC14 (+N+P) MVCC14 (-N+P) La concentración de P en el medio induce aumento de la expresión de sxt1.

49 RESUMEN Métodos moleculares para estudiar fitoplancton: IDENTIFICAR (A partir de muestras monoespecíficos o complejas) ANALISIS DE DIVERSIDAD FILOGENIAS FINGERPRINTING (patrones de las comunidades, comparar efecto de distintas condiciones ambientales sobre la estructura de la comunidad) FUNCIÓN

50 MUCHAS GRACIAS Claudia Piccini