Prospección, aislamiento y caracterización de bacterias celulolíticas de suelo de bosque nativo de Misiones, Argentina.

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1 Premio CPIA Bioenergía 12 de Mayo de 2015 Prospección, aislamiento y caracterización de bacterias celulolíticas de suelo de bosque nativo de Misiones, Argentina. Tesista: Gonzalo Julián Sabarís Di Lorenzo Director: Dra. Eleonora Campos Lugar de trabajo: Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA

2 Qué son los biocombustibles? Los Biocombustibles son aquellos obtenidos a partir de biomasa vegetal: Bioetanol, Biodiesel y Biogas. Bioetanol de primera generación Obtenido de cultivos agrícolas destinados a la alimentación humana. Bioetanol de segunda generación Obtenido de materia prima vegetal no comestible: biomasa lignocelulósica

3 Estructura de la biomasa lignocelulósica Celulosa Polímero lineal de monómeros de glucosa Hemicelulosa Heteropolímero corto y altamente ramificado de diferentes azúcares (de 5 y 6 carbonos) Lignina Polímero complejo tridimensional de compuestos aromáticos Adaptado de Berkeley Lab, U.S. Department of Energy s Office of Science (

4 Conversión de biomasa a bioetanol 1) Pretratamiento Biomasa lignocelulósica Lignina Celulosa Hemicelulosa 2) Hidrólisis enzimática 3) Fermentación

5 Hipótesis de trabajo y Objetivo general La hipótesis de trabajo es que a través de la prospección de la biodiversidad bacteriana en ambientes con alta actividad celulolítica, como lo son los suelos de bosques, se pueden aislar bacterias con utilidad para la deconstrucción de la biomasa lignocelulósica en componentes fermentables. El objetivo general es identificar y aislar bacterias que degradan celulosa y hemicelulosa con el fin de identificar genes que codifiquen para enzimas que permitan mejorar la eficiencia de la utilización de biomasa lignocelulósica como sustrato para la producción de bioetanol.

6 Identificación de bacterias celulolíticas cultivables y no cultivables Se seleccionaron 3 muestras de suelos forestales: Bosque nativo (BN) Bosque plantado con Pinus taeda (PT) Bosque plantado con Eucalyptus grandis (EG) Estimación de la concentración de microorganismos celulolíticos por ensayo del número más probable

7 Identificación de bacterias celulolíticas cultivables y no cultivables Extracción de ADN total del suelo PCR de ARNr 16s Secuenciación de ADN Identificación por homología con bases de datos Géneros potencialmente celulolíticos Acidobacterium sp. Bradyrizhobium sp. Rhizobium sp. Gemmatimonas sp. Methylobacterium sp. Planctomyces sp. Actividad caracterizada NO SI SI NO SI NO Cultivables NO SI SI NO NO SI

8 Aislamiento de bacterias con actividad celulolítica. MM-CMC MM-CMC-Rojo Congo MM-CMC-Trypan Blue MM-Avicel MM-Xilano Actividad endoglucanasa Actividad exoglucanasa Actividad xilanasa

9 Aislamiento puro con actividad celulolítica Identificación de aislamientos primarios Consorcios bacterianos Consorcio B6 Aislamiento B6a MM-CMC- Trypan Blue

10 Identificación del aislamiento B6a Árbol filogenético de máxima parsimonia basado en las secuencias del ARNr 16S de la familia Cellulomonadaceae

11 Evaluación de la actividad celulolítica MM-CMC-Trypan Blue MM-Xilano MM-Avicel Aislamiento B6a Consorcio B6 Actividades: endoglucanasa xilanasa exoglucanasa Actividad en sobrenadante de cultivo: cantidad de azúcares liberados por degradación de CMC Glu

12 Identificación de genes de enzimas celulolíticas Secuencias de enzimas glucosil hidrolasas (GH) con actividades de interés para Cellulomonas flavigena depositadas en bases de datos. Enzimas GH Secuencias del genoma Secuencias caracterizadas Totales Celulasas Hemicelulasas y pectinasas GH Totales

13 Conclusiones El suelo de bosque nativo de la selva misionera (BN) presentó alta concentración de microorganismos celulolíticos en comparación con las demás muestras analizadas de bosque plantados con Pino (PT) y Eucaliptus (EG). El análisis del ADN total del suelo de BN permitió la identificación bacterias celulolíticas cultivables y no cultivables. Obtuvimos una colección de 49 aislamientos primarios (consorcios bacterianos) con actividad celulolítica. Se obtuvo un aislamiento puro (B6a) que se identificó como perteneciente al género Cellulomonas sp. B6a presenta alta actividad endoglucanasa y sería el responsable mayoritario de dicha actividad en el consorcio B6.

14 Laboratorio de Bioenergía Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA. Dra. Eleonora Campos (Investigadora Responsable) Microb. Silvina Ghio (Becaria Doctoral INTA) Lic. Florencia Piccinni (Becaria Doctoral ANCyT) Dra. Paola Talia (Investigadora Responsable) Lic. Emiliano Ben Guerrero (Becario Doctoral INTA) Muchas gracias!

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