3. Relaciones filogenéticas. Taxonomía filogenética

Transcripción

1 1. Origen de la Vida Se cree que La Tierra tiene una edad de 4600 millones de años, la primera evidencia de vida microbiana se observa en rocas de 3860 millones de años. La Tierra primitiva era anóxica y mucho más caliente que en la actualidad. Los primeros compuestos bioquímicos se formaron por síntesis abiótica y esto estableció las bases para el origen de la vida. Las primeras formas de vida pueden haber sido ARNs autoreplicativos. El establecimiento del ADN como genoma de la célula pudo ser consecuencia de la presión evolutiva hacia la mayor eficacia y fidelidad en la replicación de la información genética (las ADN polimerasa son más precisas que las ARN polimerasas). Los primeros organismos celulares probablemente emplearon una estrategia simple para la obtención de energía. El metabolismo primitivo fue anaerobio y posiblemente quimiolitotrófico, explotando abundantes fuentes de FeS y H 2 S presentes. La fotosíntesis oxigénica en cianobacterias condujo a un ambiente óxico y a una gran explosión evolutiva. FeS + H 2 S Fe 2 S + H2 ɅG = -42 kj/ reacción El núcleo eucariótico y el aparato mitótico surgieron probablemente como necesidad para asegurar la partición ordenada del ADN en organismos con genomas grandes. Las mitocondrias y los cloroplastos, principales orgánulos productores de energía en eucariotas, surgieron por asociación simbiótica de procariotas del Dominio Bacteria en el interior de células eucariotas, un proceso llamado endosimbiosis. 2. Relaciones evolutivas entre los microorganismos. El término filogenia se refiere a las inferencias de las relaciones evolutivas entre los organismos. La primera imagen real de la filogenia microbiana se logró mediante la comparación de secuencias del ARN ribosómico. Dichas secuencias se denominan cronómetros evolutivos.

2 Elección del cronómetro adecuado Para determinar las relaciones evolutivas entre los organismos es esencial elegir moléculas adecuadas para estudios de secuenciación. Los requisitos del cronómetro molecular son los siguientes: Estar universalmente distribuidos Ser funcionalmente homólogos Deben poder alinear apropiadamente Deben cambiar con velocidad proporcional a la distancia evolutiva Se han evaluado diferentes moléculas con el fin de establecer un cronómetro que cumpla con estos requisitos. Entre ellos se estudiaron: citocromos, proteínas de Fe y S, Ferredoxinas, ARN ribosómicos, ATPasas, RecA (proteína requerida para recombinación genética). Todas estas moléculas eran probablemente esenciales incluso en las células más primitivas y la variación en la secuencia de los genes que las codifican, nos permiten profundizar en los registros evolutivos. Sin embargo, los genes que codifican para el ARN ribosómico fueron los que tuvieron mayor éxito y se usan actualmente tanto para identificar microorganismos como así también para establecer sus relaciones filogenéticas. Los ARN ribosómicos son moléculas excelente para discernir las relaciones evolutivas entre los organismos. Esto se debe a la probable antigüedad de la maquinaria sintetizadora de proteínas, por ser funcionalmente constantes, universalmente distribuidos, su secuencia esta moderadamente bien conservada. De este modo la similitud en la secuencia indica el parentesco evolutivo entre los organismos. Hay tres moléculas de ARN ribosómico que en procariotas tienen tamaños 5S, 16S y 23S. Los ARN grandes 16S (1500 nuleótidos) y 23S (2900 nucleótidos) contienen regiones de secuencias altamente conservadas y al mismo tiempo regiones hipervariables. Las regiones conservadas son de utilidad para realizar los alineamientos, mientras que la regiones hipervariables sirven para discriminar microorganismos filogenéticamente cercanos. Debido a que el ARNr 16S (procariotas) y su homólogo 18S (eucariotas) es más fácil de manejar experimentalmente, se ha utilizado preferentemente para desarrollar la filogenia. Características de los Dominios de la Vida Los principales dominios (Bacteria, Archaea, Eucarya) se definen por la comparación de las secuencias del ARN ribosómico. Sin embargo, cada dominio, comparte características fenotípicas. Algunas características son exclusivas de un dominio mientras que otras son compartidas por dos o tres dominios.

3 3. Relaciones filogenéticas. Taxonomía filogenética Taxonomía es la ciencia de la clasificación y está constituida por dos subdisciplinas principales: identificación y nomenclatura. Como vimos anteriormente conocer la secuencia del ARNr 16S o 18S sirve para inferir las relaciones evolutivas de los microorganismos pero a su vez permite también identificarlos, ya que cada taxón tiene una única secuencia ARNr 16S /18S. El procedimiento para la identificación es el siguiente: 1- Obtención del cultivo puro 2- Extracción de ADN genómico 3- PCR ADNr 16S / 18S 4- Secuenciación 5- Comparación con bases de datos Supongamos que tenemos la siguiente secuencia de ADNr 16S AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGGATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGG ACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAAC TACGCGAAAGCGTAGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCGCAAGACCTTGCACTA TTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGG TTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAG CACTTTTGGCAGGAAAGAAACGTCATGGGTTAATACCCCGTGAAACTGACGGTACCTGCAGAATAAGCAC CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAA AGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAAC TACCGGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAG GAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCTTCGGGCCTTGGT AGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGA CATGTCTGGAATCCTGAAGAGATTTAGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACG AAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGC CCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCC AATCCCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA GTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGTAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACTGGG GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT Ingresamos a la base de datos Ribosomal Database Project o NCBI

4 Ahora supongamos que tenemos la siguiente secuencia: AGCCCACCTGGTGGATGGCTCGGCTCGGGGCGCCGAGGAAGGGCGTGGCAAGCTGCGATAAGCCCGGGGG AGGCGCAGGCAGCCGTGGAACCCGGGATCCCCGAATGGGACTTCCTGCCCCATTTGGGGCGCTCCCGTTA GGGAGCGGGAACGCGGGGAAAAGAAGCATCCGAGTACCCGCAGGAAAAGAAACCAACAGGGATGCCGGGA GTAGGGGCGACCGAAACCGGCACAGGGCAAACCGAATCCCTATCCGTAAGGGTAGGGAGATGTGGAGTTG CAGGGCCCCCAATATAGACCCCCACTGGGAAGCCGAAGTCCCCTGGAATGGGGCGCCATAGAGGGTGAAA GCCCCGTAGGCGTAACCAGTTGGGGGTCTGGGGTGTCCCTGAGTACCGCGCGTTGGATATCGCGCGGGAA GCTGGGAGACATTAGGCTTCCAACCCTAAATACGTCCCGAGACCGATAGCGAACTAGTACCGTGAGGGAA AGCTGAAAAGCACCCCTTGCGGGGGGTGAAAAGAGCCTGAAACCAGGTGGGTACGGAATGGCACGGCCCG AAAGGTAACCACCCCGAAGGAAACTCCCGCGAGGGAGGAGTACGAGGGGTGGCATGCCGGGGTCGTGCCG TCCGTTTCGAAAAACGGGCCGGGGAGTGTACGGGTGTGGCGAGCCTAAGGGGTTCAACCCCGGAGGCGTA GGGAAACCGACATGCCCGCAACCCTTATGGGTGAGGGGCGGGGTCTTAATGGGCCCGGAGTCACACCCGT ACGACCCGAAACCGGGCGATCTAGGCCGGGGTAGGGTGAAGCCCCTCGCCAGAGGGGTGGAGGCCCGCAG GGGTGTTACCGCGCAAAGTGCTCCTCTGACCCCGGTCTAGGGGTGAAAAGCCAATCGAGCCCGGAGATAG CTGGTTCCCCCCGAAATAACTCGCAGGTTAGCCGGGGGTTAGGTAGATGGCGGGGTAGAGCCACGGATAG GGTGTTTAGGGGGCGAGAGCCCTCGGCACCCTGTCAAACTCCGAACCCGTCATCGCCGTAGCCCCCGAGT GAGGGCATACGGGTAAGCCGTATGTCCGAGAGGGGAACAACCCGGACCCGGGTTAAGGCCCCTAAGTGCC GGCTAAGTGTAAATGAGAAGGGAGTCCCTGGCCTAAGACAGCGGGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGCCATCC TTTAAAGAGTGCGTAACAGCTCACCCGTCGAGGTCAGGGGCCCCGAAGATAACGGGGGCTAAGCCGGCCG CCGAGACCCGGGGGGGCTGAAAAGCCATCCGGTAGGGGGGCGTCCCGCGGGGGTAGAAGCTCGGCCGTGA GGTCGGGTGGACCCCGTGGGAACGAGAATCCCGGCAGTAGTAACAGCAAAGTGGGGTGAGAATCCCCACC GCCGAAGGGGCCAGGTTTCCACAGCAACGGTCGTCAGCTGTGGGTTAGCCGGTCCTAACCCCCGGGGTAA TTCCCTGGGGGGGAAAGGGAAGCGGGTTAATATTCCCGCGCCACCGGGGTACGTGCGGCAACGCAAGGCC AGCTCCTGACGCTTCGGGGTAGGCCGACCACCCCCGTCGGGGTGGCCAAGCGCATAAGCCCGGGGAGTGC CGTAATGGCGAGAACCGGGCAAAAGCGTGATGGGCCCTCCGTTAGGAGGGTTCGGCTGAGCCCTGGAGCC CGTGAAAAGGGAGCTGGCAAGGATCCCCGGTGACCGTACCCAGAACCGACACAGGTGCCCCTAGGCGAGT ATCCTAAGGCGTGTCGGGAGAATCCGGCCCAGGGAAGTCGGCAAATTGGCCCCGTAACTTCGGGAGAAGG GGTGCCTGCGGTCTTCTCTAAGTGAGGGGACCGCAGGTCGCAGTGGCCAGGGGGGTCCGACTGTTTAATA AAAACACAGGTCTTGGCTAGCCCGTAAGGGTGTGTACCAAGGCCGACGCCTGCCCAGTGCCGGTACGTGA AACCCGGGTACAACCGGGCGAAGCGCCGGTAAACGGCGGGGGTAACTATAACCCTCTTAAGGTAGCGAAA TTCCTTGTCGGGTAAGTTCCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGACCCCCACTGTCCCGGGCCGGAACCC GGTGAACCTACCATTCCGGTGCAAAGGCCGGAGACCCCCAGTGGGAAGCGAAGACCCCGTGGAGCTTTAC TGCAGCCTGTCGTTGGGGCATGGCCGTGGGTGCACAGCGTAGGTGGGAGCCGTCGAAGCCACCCCTCCGG GGGTGGTGGAGGCGCCCATGGGACACCACCCACCCATGGCCATGTCCCTAACCCCGTAAAGGGGGACACC GGCAGGTGGGCAGTTTGGCTGGGGCGGCACCCCCCTGAAAAGGCATCAGGGGGGCCCAAAGGTCGGCTCA GGCGGGTCAGAACTCCGCCGTGGAGTGCAAGGGCAAAAGCCGGCCTGACTTGGTCGGTAAAAGAGGCCGA CCAAGAGGCGAAAGCCGGGCCTAGCGAACCCCTGTGCCTCACCGATGGGGGCCAGGGATAACAGAAAAGC TACCCCGGGGATAACAGAGTTGTCGCGGGCAAGAGCCCATATCGACCCCGCGGCTTGCTACATCGATGTC GGTTCTTCCCATCCTGGGCCTGCAGCAGGGCCCAAGGGTGGGGCTGTTCGCCCATTAAAGGGGATCGTGA GCTGGGTTTAAACCGTCGTGAGACAGGTTGGTTGCTATCTGCTGGGGGTGTTGGCCGCCTGAGGGGAAGG

5 TGGCTCTAGTACGAGAGGAACGAGCCGCCGGCGCCTCTGGTCTACCGGTTGTCCGACAGGGCATTGCCGG GCAGCTACGCGCTAAGGGATAAGGGCTGAAGGCATCTAAGCCCGAAACCCTCCCCGAAAATAGGCGGCCA GTCCCTTCGGGGACGAGGGCTCTCCTATAAGAGGAGGTTGATAGGCCGGGGGTGTAAGCGCCGAGGGCTT TGCCCGAGG Ingresamos a Ribosomal Database Project ( ) Esta base de datos reporta la secuencia, como un microorganismo del Dominio Archaea no clasificado. Entonces recurrimos a la base de datos NCBI Supongamos que tenemos esta tercera secuencia TAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGGGTTCCCC GTCCGAGTTGTAATCTGGAGAAGCGTTTTCCGTGTCGGACCGTGTACAAGTCCCTTGGAATGGGGCGTCA TAGAGGGTGAGAATCCCGTCCATGACACGGACTACCGATGCTTTGTGATACGCTCTCAAAGAGTCGAGTT GTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGC GAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGA AAGGGAAACGCTTGAAGTCAGTCGCGTCCGTCGAGACTCAGCCTTGCCTTTGGGCCTGGTGTACTTCTCG GTGGACGGGTCAACATCGATTTTGAATGGCAGATAAAGGTCTGGGGAATGTGGCACCTCCGGGTGTGTTA TAGCCCCTCTCCGTATATGCTGTTTGGGATCGAGGACCGCAGCACGCCCTTGTGGCCGGGGTTTTACCCA CGTACCGTGCTTAGGATGTTGGCATAATGGCTTTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTA ACATGCCTGCGAGTGTTAGGGTGCAAAACCCTTGCGCGTAATGAAAGTGAAAGTTGGGACCTCTGTCGAG GAGGGCACCGACGCCCGGCCCTGAACTCTTGTGACGGTGCTGCGGTAGAGCATGTATGTTGGGACCCGAA AGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGCGATTCTGAC GTGCAAATCGATCGTCAAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCTG C Ingresamos a NCBI

6 El 99% de los microorganismos que habitan el suelo no se pueden cultivar en laboratorio. Entonces se realiza la extracción de ADN metagenómico (genomas de toda la comunidad de microorganismos), se amplifica por PCR el gen ADNr 16S /18S y luego se pueden llevar la secuenciación a gran escala (también conocida como secuenciación masiva o pirosecuenciación) o construcción de bibliotecas genómicas. Secuenciación masiva A partir del desarrollo de la tecnología de secuenciación de ADN y particularmente con la llegada de las tecnologías de secuenciación masiva de alto rendimiento, se hizo posible comenzar a estudiar a los microorganismos independientemente de su cultivo en laboratorios (Metagenómica). Desde entonces el descubrimiento de nuevas especies microbianas ha aumentado de forma exponencial siendo ahora posible estudiar a nivel genómico y metagenómico las comunidades de microorganismos de prácticamente cualquier tipo de ambiente. Sin embargo, pese al gran avance que el uso de este tipo de tecnologías ha generado en el campo de la microbiología a nivel mundial, en nuestro país estos nuevos enfoques no han sido implementados y son muy pocos los recursos humanos formados en el uso de estas herramientas. Desde el año 2010 existe la posibilidad de realizar este tipo de estudios en Argentina gracias al establecimiento de la primera plataforma de secuenciación masiva de alto rendimiento en el Instituto de Agrobiotecnología Rosario (INDEAR) que cuenta con un equipo de pirosecuenciación 454 FLX. El uso de esta tecnología y la ayuda para el análisis de los datos se encuentra disponible para toda la comunidad científica del país en forma de servicios a terceros. (Rascovan et al., 2012) Construcción de bibliotecas genómicas La amplificación de los ADNr 16S se realiza por medio de la reacción en cadena de la polimerasa PCR, por sus siglas en inglés (Polymerase chain reaction), empleando oligonucleótidos o primers específicos. Esto se realiza para amplificar los ADNr 16S de bacterias u otros grupos como arqueobacterias. En el caso de organismos eucariontes, se emplean las secuencias ADNr 18S. Los 16S posteriormente se pueden clonar (insertar) en vectores (por ej: plásmidos). Dichos vectores son transferidos por transformación a bacterias huésped como Escherichia coli, para crear bibliotecas o bancos de clones, conteniendo las secuencias ADNr 16S de diversos microorganismos de forma separada. Esto permite el análisis individual de cada una de las secuencias clonadas utilizando diversos métodos, tales como secuenciación (Hernandez León et al., 2010) Analizando muchas secuencias, se puede construir un árbol filogenético de los microorganismos en estudio. La distancia en el árbol reflejará la distancia evolutiva.

7 Árbol construido usando secuencias ARNr 16S de microorganismos celulolíticos de suelo de bosque de la región chaco. Fuente: Talia et al., 2012.

8 4. Taxonomía clásica A diferencia de la filogenia, donde se analizan las secuencias del ADNr 16S /18S, en la taxonomía clásica se basa en características fenotípicas incluyendo aspectos de su metabolismo energético, enzimas, características ecológicas, etc. 4.1 Taxonomía clásica en bacterias En la taxonomía bacteriana clásica, se determinan varios caracteres y los resultados se usan para agrupar las bacterias en categorías. Varios aspectos de la morfología, nutrición, fisiología y hábitat son características de valor taxonómico ampliamente utilizadas. Los métodos más utilizados para la identificación bacteriana se pueden clasificar en métodos basados en: criterios morfológicos, tinción diferencial, pruebas bioquímicas, tipificación con fagos, pruebas serológicas. En la mayoría de los casos la identificación no se realiza con base a un solo método, sino a la combinación de más de uno. Métodos basados en criterios morfológicos Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos años a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatómicos tan diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su clasificación, pero con respecto a las bacterias, éstas lucen bajo el microscopio tan similares que se dificulta su clasificación. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos esporulados. Métodos basados en coloraciones diferenciales Coloración de Gram Es una coloración doble y diferencial, de gran importancia por su valor taxonómico en bacterias, que ha permitido establecer dos grupos microbianos: Gram positivos, que son los que retienen el primer colorante (violeta de genciana o cristal violeta) luego de ser tratados con el decolorante (alcohol o acetona) y Gram negativos, son los que no retienen el primer colorante después de la acción del decolorante. Esta coloración además brinda información acerca de la pureza del cultivo y permite observar morfología, agrupamientos celulares, etc. Se demostró que existen diferencias fundamentales en la composición química de la pared celular de las bacterias Gram negativas y positivas. Estas diferencias químicas están relacionadas con la estructura de la pared celular. Las Gram negativas tienen una pared constituida por el peptidoglicano en pequeña proporción y la membrana LPS constituida por fosfolípidos, polisacáridos y proteínas, mientras que en la Gram positivas el peptidoglicano se encuentra en mayor proporción acompañado de ácidos teicoicos. En las Gram negativas, por su alto contenido de lípidos en pared, el alcohol (diferenciador de la coloración de Gram) produce solubilización de la capa lipídica, la porosidad aumenta y así el complejo yodo-cristal violeta es desalojado y se decolora. Con el segundo colorante o contra colorante (safranina o fucsina) se colorea nuevamente y así las Gram negativas toman una tonalidad rosada. En las Gram positivas, la acción del alcohol provoca la deshidratación de la pared, los poros disminuyen de tamaño y el complejo yodo-cristal violeta es fijado ya que el peptidoglicano actúa como barrera. Así, éstas quedan teñidas con el colorante cristal violeta o violeta de genciana (primer colorante).

9 Al realizar la reacción de Gram se deben tener en cuenta lo siguiente: Estado fisiológico del cultivo: deben ser células provenientes de un cultivo joven, de 24 hs. o menos porque ciertas bacterias pierden su condición de Gram positivas al ir envejeciendo ya que no retienen al complejo yodocristal violeta., y por ello se denominan Gram variables. Desarrollo del cultivo en medio sólido: se debe trabajar con microorganismos desarrollados en medio agarizado, ya que si se encuentran en medio líquido se puede arrastrar sustancias del mismo medio. Métodos basados en pruebas bioquímicas Las pruebas bioquímicas evalúan las propiedades metabólicas de un microorganismo aislado, las cuales son únicas para cada especie. La combinación de pruebas bioquímicas puede utilizarse para determinar el patrón bioquímico del microorganismo aislado. Esto hace posible la identificación del mismo utilizando un esquema de identificación. Existen tres métodos de identificación: a) método convencional; b) sistemas multiprueba y c) métodos automatizados. Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. El método convencional diferencia entre: 1) pruebas que se utilizan en la identificación preliminar y con lectura inmediata como la catalasa y oxidasa 2) pruebas rápidas, con lecturas en menos de 6 hs (ej. β-galactosidasa, aminopeptidasas, ureasa y el indol). 3) pruebas lentas, con lecturas de 18 a 48 hs. Que incluirían la oxido-fermentación, reducción de nitratos, rojo de metilo, Voges-Proskauer, fermentación de azúcares, coagulasa, fenilanina-desaminasa, DNas, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas, lipasa, lecitinasa, utilización de citratos, utilización de malonato. 4) pruebas basadas en caracteres de resistencia a ciertas sustancias como optoquina, bacitracina etc. Los sistemas multiprueba, permiten una mayor rapidez en la identificación de algunas bacterias. Estos sistemas pueden ser manuales o automatizados. Se trata de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que permiten realizar simultáneamente entre 10 y 50 pruebas bioquímicas. Los resultados de las pruebas se expresan de forma numérica. Cada especie está definida por un código numérico, resultado de la codificación de las reacciones a las pruebas que se hubieran utilizado. Estos son algunos de los sistemas disponibles en el mercado: API (biomérieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical ID systems MicroID (Remel), Biochemical ID systems. Los sistemas automatizados son galerías multipruebas, como las usadas en el sistema anterior, pero cuya inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo automatizado. Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculación y lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática, incorporándose los datos obtenidos en una pc, el cual proporciona con un alto índice de fiabilidad la identificación del microorganismo. Algunos de los paneles comerciales disponibles en el mercado son MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc. Métodos basados en fagos La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana sensible es sumamente específica, ya que el proceso de interacción se encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana. A una placa con medio de cultivo sólido inoculado con un cultivo puro de una determinada bacteria, se le añade una alícuota de un fago específico; éste puede ocasionar la lisis de las bacterias, hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas placas, que indican que hubo infección y lisis celular. El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.

10 Métodos basados en ensayos serológicos Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o en muestras biológicas. Cada uno de los métodos tiene su fundamento particular, pero en líneas generales, todos se basan en la reacción de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solución que contiene los anticuerpos se denomina antisuero. Ejemplo: Procedimiento para identificación de una especie bacteria cultivable mediante taxonomía clásica. Aislamiento de una bacteria del intestino de un homeotermo Obtención de cultivo puro Tinción Gram Gram negativo Forma bacilar Facultativo Fermenta lactosa con producción de ácidos y gas Pruebas bioquímicas Positivas: indol, rojo de metilo y mucato Negativas: citrato, Voges-Proskauer y H 2 S Escherichia coli 4.2 Taxonomía clásica en protozoos Los protozoos son microorganismos eucarióticos, unicelulares que carecen de pared celular. En general no poseen color y son móviles. Los protozoos se distinguen fácilmente de los procariotas porque son inconfundiblemente mas grandes; de las algas porque carecen de clorofila; de los hongos y levaduras por su movilidad y ausencia de pared celular y de los hongos mucosos por su incapacidad de generar cuerpos fructíferos. Los protozoos se encuentran en diversos hábitats: agua dulce y marina, rumen de herbívoros, parásitos de animales y hombre, suelo, aire, superficie de árboles. La mayoría se alimenta por fagocitosis. Existen cuatro grupos principales de protozoos que se diferencian básicamente por su movilidad y presencia o ausencia de esporozoos. Flagelados Los miembros representantes de este grupo son móviles por acción de los flagelos. Aunque la mayoría de los flagelados son de vida libre, un buen número de ellos son parásitos animales, incluido el hombre. El ejemplo más importante es Trypanosoma, este protozoo mide 20 µm de longitud y es responsable de la enfermedad del sueño.

11 Amebas Dentro de este grupo se encuentran organismos como la Amoeba, que en fase vegetativa se encuentran siempre desnudos; y los foraminífidos, amebas que secretan una especie de concha durante el crecimiento vegetativo. Se conocen amebas que son parásitos cuyo hábitat es la cavidad bucal y el tracto intestinal. En estos hábitats se mueven por movimientos ameboides. Entamoeba histolytica es un buen ejemplo de amebas parásitas que producen un estado diarreico denominado disentería amebiana. Ciliados Los ciliados son aquellos protozoos que, al menos en alguna fase de su vida, poseen cilios. Son únicos en los protozoos que poseen dos clases de núcleos: el micronúcleo que está implicado en la herencia y en la reproducción sexual y el macronúcleo que está involucrado en la formación de diversos ARNm de crecimiento y otras funciones celulares. La mayor parte de los ciliados obtienen su alimento ingiriendo partículas a través de una especie de boca hasta una zona ciliada que es como un esófago. Al llegar al citoplasma, la partícula es englobada por una vacuola digestiva en la que se vierten las enzimas digestivas. Además de cilios, los ciliados poseen tricosistos que son filamentos largos, de naturaleza contráctil anclados debajo de la capa más externa de la célula. Estas estructuras permiten a los protozoos asirse literalmente a sustratos sólidos y también sirven para dar señales de peligro cuando están siendo atacados por otros predatores. Aunque ciliados son parásitos, no es la forma habitual en el grupo. Esporozoos Es un gran grupo de protozoos que son parásitos obligados. Se caracterizan por ser inmóviles en estado adulto y porque los alimentos los toman disueltos en fase acuosa a través de la envoltura celular como ocurre en los procariotas y hongos. Aunque el nombre esporozoos, implica la formación de esporas, estos organismos no las forman, en su lugar originan formaciones semejantes llamadas esporozoitos, que están implicados en transmisión a un nuevo hospedador. Tanto animales vertebrados como invertebrados pueden ser hospedadores de los esporozoos. Los miembros más importantes de esporozoos son los coccidios, normalmente parásitos de pájaros y los plasmodios (parásitos de la malaria) que infectan pájaros y mamíferos incluido el hombre. 4.3 Taxonomía clásica en hongos Al contrario de los protozoos, los hongos poseen pared celular y esporas de diversos tipos. Se reconocen tres grupos: mohos u hongos filamentosos, levaduras y las setas. Los hábitats de los hongos son bastante diversos. Algunos son acuáticos, principalmente agua dulce, aunque existen también algunos en medios marinos. La mayoría de ellos son de medios terrestres, crecen sobre el suelo o la materia orgánica en descomposición y contribuyen notablemente a la mineralización del carbono orgánico del suelo. Un gran número de hongos parasitan plantas terrestres. De hecho los hongos causan pérdidas económicas muy notables en la producción frutihortícola. Las paredes fúngicas se parecen a la de las plantas, pero solo desde el punto de vista de su arquitectura y no desde la composición química. Aunque la celulosa está presente en ciertos hongos, muchos de ellos poseen paredes no celulósicas. La quitina es un constituyente común de las paredes celulares fúngicas. Se dispone en microfibrillas como la celulosa y en algunas especies existen otros polímeros como los mananos, galactanos o quitosán. En su 80 90%, las paredes celulares fúngicas están compuestas por polisacáridos, mientras que los lípidos, polifosfatos e iones inorgánicos forman una matriz cementante. El conocimiento de la pared y la morfología de las esporas y cuerpos fructíferos son muy importantes y se ha usado en la clasificación de hongos.

12 Hongos filamentosos: mohos Los mohos son hongos filamentosos. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se ven frecuentemente en el pan viejo, queso y frutas. Cada filamento crece fundamentalmente en el extremo por un mecanismo de extensión celular. Cada filamento se denomina hifa. Las hifas crecen en masa en lo que se denomina micelio, que puede verse fácilmente sin ayuda del microscopio. Las hifas, en la mayoría de los casos, contienen más de un núcleo. Por lo tanto el tipo de hifa es cenocítica, es decir, es un tubo nucleado con citoplasma. A partir del micelio, otras hifas buscan la superficie y forman conidios. Estos son esporas asexuales (su formación no implica la fusión de gametos) y resistentes a la desecación, que sirven como forma de dispersión hacia nuevos hábitats. Cuando se forman los conidios, cambia el color blanco del micelio adquiriendo un color negro, rojizo, azul-verdoso, amarillo o marrón. La presencia de esporas le otorga un aspecto pulverulento a la masa micelial. Algunos mohos pueden formar esporas sexuales. Si se forman dentro de un saco se denominan ascosporas, si se forma en los extremos de estructuras en forma de porras se denominan basidiosporas. Los mohos del género Rhizopus forman zigosporas. Las esporas sexuales de los hongos son generalmente resistentes a la desecación, congelación y algunos compuestos químicos. No son tan resistentes como las endosporas de las bacterias. Tanto una espora asexual como sexual puede germinar para generar nuevo micelio. Hongos macroscópicos: las setas Las setas son basidiomicetos filamentosos que forman cuerpos fructíferos, que constituyen la parte comestible que llamamos setas. Durante la mayor parte de su existencia, las setas viven como simple micelio viviendo en el suelo, en los residuos de hojas o troncos. Sin embargo, cuando las condiciones del medio son favorables, generalmente los períodos húmedos y fríos, se desarrollan las setas. Las esporas sexuales llamadas basidiosporas se forman en la parte inferior del sombrerillo entre innumerables laminillas. Hongos unicelulares: las levaduras Las levaduras son hongos unicelulares, la mayoría perteneciente a los Ascomicetos. Normalmente son ovales, esféricas o casi cilíndricas y la división es casi asimétrica o por gemación. En este proceso la nueva célula se forma como un pequeño bulto en la célula madre que crece hasta separarse de ella. Aunque la mayoría de las levaduras se reproducen como células aisaladas, bajo ciertas condiciones pueden filamentar. Las células de levaduras son mucho más grandes que las bacterias y pueden distinguirse de ellas no solo por su tamaño sino por poseer sistemas membranosos intracitoplasmáticos y núcleo. Las levaduras prosperan típicamente en hábitat con azúcares, tales como frutos, flores, cortezas de árboles. La levadura más conocida es Saccharomyces cerevisiae, que produce fermentación alcohólica. Hongos mucosos Los hongos mucosos son microorganismos eucarióticos que poseen similitudes fenotípicas con hongos y protozoos. Como los primeros, pueden producir esporas, y como los protozoos pueden moverse por superficies con un movimiento flexible a modo de amebas. Los hongos mucosos pueden dividirse en dos grupos: los celulares (semejantes a las amebas) y los acelulares, que son masas amorfas de protoplasma llamados plasmodios. 4.4 Taxonomía clásica en algas Las algas constituyen un grupo diverso de organismos eucarióticos que contienen clorofila y llevan a cabo la fotosíntesis oxigénica.

13 No deben confundirse con cianobacterias, que también producen oxígeno en la fotosíntesis pero son bacterias. Aunque la mayoría de las algas son de tamaño microscópico, algunas son macroscópicas e incluso pueden llegar a medir 30m de longitud como ocurre con las laminarias. Las algas son unicelulares o coloniales, mientras que si las células están agregadas extremo con extremo se dice que son filamentosas. Entre las formas filamentosas aparecen filamentos sin ramificaciones y con intrincada ramificación. Contienen clorofila y por ello la mayoría son verdes. Sin embargo algunas aparecen color marrón o rojizo de xantofilas que enmascaran el color verde. Las algas contienen uno más cloropastos que encierran los pigmentos fotosintéticos. La Tabla 14.3 muestra las diferencias entre los principales grupos de algas. 5 Taxonomía molecular La taxonomía molecular, emplea los análisis moleculares de diversas biomoléculas celulares. Entre los principales métodos moleculares se encuentran: Hibridación ADN: ADN; secuenciación ARNr 16S/18S (ver relaciones filogenéticas); el ribotipado, y el análisis de lípidos de membrana. Hibridación ADN: ADN Supongamos que tenemos aislado el ADN genómico de dos microorganismos. El paso siguiente es desnaturalizar las moléculas de ADN, es decir, provocar la apertura de la doble hélice. Luego se mezclan el ADN de los dos microorganismos, uno de ellos marcado con isótopo radiactivo. Posteriormente se permite el reanillamiento de las moléculas de ADN. Según el porcentaje de hibridación se podrá establecer la similitud entre los microorganismos, es decir, se podrá determinar si son de la misma cepa, especie, género, etc.

14 Ribotipado El ribotipado es la técnica de identificación bacteriana que emplea alguno de los métodos previamente descritos para la caracterización filogenética basadas en ARN ribosómicos. Sin embargo, a diferencia de los métodos de comparación de secuencias, el ribotipado no implica secuenciación. En su lugar estima un patrón de bandas que

15 se generan cuando el ADN de un microorganismos en sometido a digestión con enzimas de restricción. Las diferencias en la secuencias se traduce en presencia/ausencia de sitios de corte de la enzima, cada especie tendrá un único perfil. Esta técnica de denomina comúnmente huella molecular (molecular fingerprinting) En la práctica, el ribotipado comienza con el ADN que codifica para el ARNr 16S. Luego de cortan con una o varias enzimas, se somete a electroforesis. Una vez obtenido el perfil se compara con la base de datos. Figura. Fingerprinting molecular de diferentes bacterias de suelo (Foto Silberman) Análisis de ácidos grasos: FAME Otro método popular de identificación bacteriana consiste en la caracterización de los tipos y proporciones de ácidos grasos presentes en los lípidos de la membrana citoplasmática y membrana externa de la pared celular (Gram negativas). Dado que la composición de ácidos grasos en procariotas es tan variable, tales como las diferencias en la longitud en las cadenas de ácidos grasos, la presencia o ausencia de grupos insaturados, anillos o cadenas ramificadas y de grupos hidroxilos, el perfil de ácidos grasos de una bacteria particular puede ser a menudo útil en el diagnóstico. En la práctica, los ácidos grasos extraídos de hidrolizados celulares de un cultivo en condiciones estándar, se modifican químicamente para formar sus correspondientes metil ésteres. Estos derivados volátiles se identifican posteriormente por cromatografía de gases. El cromatograma con los tipos y cantidades de ácidos grasos de una bacteria se comparan con la base de datos que contiene los perfiles de ácidos grasos de miles de bacterias de referencia cultivadas en la mismas condiciones, y se selecciona el que más se parezca. Esta técnica es denominada FAME (fatty acid methyl ester) es ampliamente utilizada en laboratorios de inspección de agua y alimentos, donde la identificación de patógenos y otras bacterias deben realizarse rutinariamente. Esta técnica requiere una estandarización rígida, puesto que los perfiles de ácidos grasos de una determinada bacteria pueden variar con la temperatura, fase de crecimiento, y en menor medida con la composición del medio.

16 6 Nomenclatura y Manual de Bergey Siguiendo el sistema binomial de nomenclatura usado en biología, los microorganismos reciben un nombre para el género y un nombre para la especie. En general los nombres del latín o griego latinizado que describen alguna propiedad típica de la especie y se escriben con letras itálicas o cursivas. Colecciones de cultivos tipo y publicación de nuevos taxones Cuando se aísla un microorganismo nuevo y se cree que es único, debe tomarse la decisión de si es suficientemente diferente de otras especies como para ser descrito como nuevo, o quizá incluso lo suficientemente diferente de todos los géneros para merecer ser definido como un nuevo género. Para realizar la propuesta taxonómica formal, como la creación de un nuevo género o especie, se publica una descripción del aislado y el nombre propuesto y se deposita un cultivo viable del organismo en dos colecciones de cultivo, tales como la alemana y la americana: American Type Culture Collection (ATCC, Colección Americana de cultivos tipo, Manasas, Virginia, USA) y Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkuturen (DSMZ, Colección Alemana de Microorganismos; Braunschweig, Alemania). La cepa depositada sirve como cepa tipo de la nueva especie y como estándar para comparar otras cepas que se crea que puedan ser la misma. Las colecciones de cultivo conservan el cultivo depositado, generalmente congelándolo a temperaturas bajas (de - 80ºC a -196ºC) o liofilizándolo. Esta técnica difiere de las utilizadas en botánica o zoología. Estas disciplinas utilizan especímenes preservados (muertos, bien como material herbario seco o animales fijados químicamente) como el modelo al que comparar las nuevas especies que se proponen. Los microbiólogos confían en una cepa tipo viva que pueda ser distribuida entre la comunidad científica, cultivada y estudiada; esta práctica permite comparaciones más detalladas y reproducibles, especialmente a nivel molecular. Si la descripción de un nuevo organismo se publica en una revista diferente al Internacional Journal of Systematic Evolutionary Microbiology (IJSEM), publicación oficial de los registros de taxonomía y clasificación de procariotas y levaduras, debe enviarse a esta revista una separata del trabajo publicado y el nombre validado, antes de que sea formalmente aceptado como un nuevo taxón microbiológico. En cada número, el IJSEM publica una lista de nombres aprobados para su inclusión en el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática, un importante tratado de la Taxonomía de procariotas.

17 El Manual de Bergey y Los procariotas Aunque no existe una fuente oficialmente reconocida en el campo de la taxonomía microbiana, el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática es un compendio de información estándar y molecular de todas las especies reconocidas de procariotas en el momento de su publicación y contiene un buen número de tablas, figuras y otra información sistemática útil a los efectos de la identificación. La segunda edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática, publicado en cinco volúmenes que aparecerán a lo largo de varios años a partir del 2001, ha incorporado muchos de los conceptos surgidos de los estudios de secuenciación de ARN ribosómico y los mezcla con abundante información de taxonomía clásica. La segunda referencia importante es un tratado de muchos volúmenes llamado The Prokaryotes. Este tratado con más de 4100 páginas en su segunda edición (1992), es ahora accesible en su edición online ( que se revisará periódicamente para reflejar en ella el rápido ritmo que se genera nueva información sobre la taxonomía y filogenia procariótica. Colectivamente, el Manual de Bergey y The Prokaryotes ofrecen a los microbiólogos los fundamentos de la taxonomía y filogenia microbiana tal como la conocemos hoy, y son las primeras fuentes que los taxónomos consultan cuando caracterizan un nuevo aislamiento de un procariota. 7 Taxonomía numérica La taxonomía numérica es empleada desde 1957 para efectuar agrupamientos entre vegetales animales y se expandió rápidamente al estudio de las bacterias y se caracteriza por: las agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos Se basa en la determinación de un gran número de caracteres (morfológicos, ecológicos, metabólicos, moleculares, secuencias, etc.) todos ellos con el mismo peso relativo La similitud es función de la proporción de caracteres comunes Ejemplo: Se desea comparar, mediante taxonomía numérica, dos cepas bacterianas por caracteres fenotípicos (determinación de un gran número de ellos) Se determina el coeficiente de semejanza= (a + d)/ (a+b+c+d) a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en la cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en la cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas También se pueden realizar dendogramas o clúster agrupando los microorganismos según el grado de similitud o disimilitud

18 Bibliografía Hernández-León, R., Velázquez-Sepúlveda, I., Orozco-Mosqueda, MC., Kirk, J.L., L.A. Beaudette, M. Hart Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods; 58: Rascovan, N., Carbonetto,M., Reinert, M., Revale, S., Alvarez, R., Mentaberry, A., Vazquez, M Uso de tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento para el estudio de comunidades microbianas del suelo. Congreso latinoamericano de la ciencia del suelo, Argentina, Frioni, L Microbiología Básica, Ambiental y Agrícola. Facultad de Agronomía. Universidad de la República, Uruguay. 464p. Madigan, M. T., Martinko, J.M., Parker, J Brock Biología de los microorganismos. 10ª Edición. PEARSON EDUCACIÓN, S.A. Madrid. 1096p. Talia, P., Sede, S., Campos, E., Rorig, M., Principi, D., Tosto, D., Hopp, E., Grasso, D., Cataldi, A Biodiversity characterization of cellulolytic bacteria present on native Chaco soil by comparison of ribosomal RNA genes. Research in Microbiology 163: