Valor predictivo de la Timilidato Sintetasa (TS) determinada por qpcr en pacientes con cáncer avanzado tratados con Pemetrexed
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- Pilar Molina Camacho
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1 Valor predictivo de la Timilidato Sintetasa (TS) determinada por qpcr en pacientes con cáncer avanzado tratados con Pemetrexed C. Chamizo, S. Zazo, N. Pérez-González, CL Aúz, Lina Daud, J. Madoz, M. Domine,, J. García-Foncillas, F. Manzarbeitia, F. Rojo Cristina Chamizo García Departamento de Anatomía Patológica Fundación Jiménez Díaz
2 Cáncer y proliferación celular Cáncer = proliferación celular descontrolada. Acivación de la maquinaria metabólica de la célula. ESTRATEGIA TERPEÚTICA Inhibición de enzimas metabólicas Síntesis de ácidos nucleícos DNA/RNA Enzimas implicadas en síntesis de ácidos nucleícos (Ej.: Timilidato Sintasa)
3 Timilidato Sintasa (TS). Función Timilidato sintasa (TS) es un enzima que cataliza la metilación de desoxiuridilato (dump) produciéndose una molécula de desoxitimilidato (dtmp). Esta reacción es fundamental para la formación de desoxi timidina trifosfato (dttp) dttp precursor de DNA Molécula necesaria para la correcta síntesis y reparación del DNA.
4 Timilidato Sintasa (TS) y Ácidos nucleícos Ácido Fólico Metabolito que participa en la síntesis de ácidos nucleícos Enzimas que intervienen en la síntesis de de nucleótidos DNA DNA/RNA
5 Timilidato Sintasa (TS). Estructura transcripción En humanos, el gen (TYMS) que codifica esta enzima está localizado en el brazo corto del cromosoma 18. El mrna tiene una longitud de bp distribuidos en 7 exones. traducción TS es un enzima homodiméríca de 313 aa. cada monómero.
6 Timilidato Sintasa (TS) y Pemetrexed Pemetrexed inhibe Ppal. diana DNA DNA/RNA
7 Regulación de la expresión de Timilidato Sintasa La regulación de la expresión de TS depende de: Los requerimientos celulares puntuales estatus proliferativo. Genotipo individuo identificación de polimorfismos. La determinación de los niveles de TS podrían indicar éxito/fracaso terapeútico.
8 OBJETIVO Evaluar los niveles de expresión de TS en células tumorales, como factor predictivo de respuesta al tratamiento con pemetrexed. En pacientes para los que está indicado este tratamiento: cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC) mesotelioma.
9 Muestras MUESTRAS Se seleccionan 54 casos consecutivos. Tipo Histológico N % SCLC 3 5 Mesotelioma NSCLC TOTAL 54 NSCLC N % Adenocarcinoma Célula grande Escamoso 3 5 TOTAL 40 El rendimiento de la extracción del RNA fue del 75% (40/54) el RNA de parafinas presenta inconvenientes para estudios moleculares está muy fragmentado y tiene muchas modificaciones químicas. El estudio completo se realizó en el 60% de las muestras seleccionadas (32/54). RNA 50 µm de tejido tumoral FFPE (obtenidas por broncoscopia) Extracción de RNAtotal RT cdna
10 qpcr Primers específicos (TS y ATP5E) cdna Sondas hidrolizables (UPL, Roche) (Light-Cycler480 II, Roche) CUANTIFICACIÓN RELATIVA (RQ) La expresión de TS se calculó conforme al algoritmo matemático descrito por Pfaffl, siendo ATP5E el gen de referencia y el tejido no tumoral la muestra calibradora (control). ATP5E = gen ref. TS = gen target Control = calibradora Muestra = problema
11 Diseño de primers TS (diana) EXÓN 2 [ ] EXÓN 3 [ ] Intrón 2 = 2428 p.b. Amplicón cdna = 95 p.b Sonda UPL #25# Situada en exón2 Posición [ ] #25# FW01 Situado en Exón2 #25# RV03 Situado en Exón3
12 Diseño de primers ATP5E (Ref. = housekeeping gen) EXÓN1[1-148] EXÓN 2 [ ] Intrón p.b. Amplicón cdna = 101 p.b Sonda #49# Situada en exón1 Posición [ ] #49# FW02 Situado en Exón1 #49# RV02,01 Situado en Exón2
13 gdna gdna gdna gdna gdna gdna Optimización de la qpcr de TS ATP5E 100 p.b cdna FFPE RNA FFPE RNA FFPE cdna FFPE RNA FFPE Gen housekeeping cuantificaciónrelativa (RQ) ATP5E ATP5E ATP5E TS cdna FFPE cdna FFPE cdna FFPE cdna FFPE 100 RNA p.b FFPE Gen diana del estudio TS TS TS RNA FFPE RNA FFPE RNA FFPE mrna level of TS/ATP5E Calib. caso1 caso2 caso3 caso4 caso5 caso6 MSA SKBR3 BT474 MCF7 MB468 MB453 MB231 TS/ATP5E MSA 1 TS/ATP5E SAMPLE SKBR3 1,618 (RQ) calibrador BT ,397 caso MCF ,4653 caso MB ,77 caso MB ,465 0,5976 caso MB ,77 2,534 caso 5 0,59 caso6 2,53
14 Categorización de la expresión de TS en las muestras analizadas Los niveles de expresión de TS fueron clasificados en dos categorias: Sobrexpresión de TS valores 1.15 Baja expresión de TS valores < 1.15 Los datos obtenidos tras esta categorización Estudio completo Alta expresión de TS Baja expresión de TS N N % N %
15 Niveles de expresión de TS como factor predictivo Alta expresión de TS Baja expresión de TS p=0.071 N N % N % p Edad (mediana, rango) 59 (32-78) 54 (32-78) 66 (60-78) 1 Sexo Hombre Mujer Hábito tabáquico Fumador Exfumador No fumador Tipo histológico Adenocarcinoma Célula grande Escamoso Mesotelioma EGOG Progresión No Sí Línea de tratamiento 1ª línea ª línea ª línea Respuesta No Sí no evaluable p=0.007 p=0.016
16 Supervivencia Acumulada Supervivencia Acumulada Niveles de expresión de TS como factor predictivo p=0.595 p=0.002 SUPERVIVENCIA GLOBAL (OS) TIEMPO DE PROGRESIÓN (TTP)
17 CONCLUSIONES La sobreexpresión de TS en cáncer de pulmón y mesotelioma avanzado se asocia a un menor beneficio al tratamiento con pemetrexed en combinación con quimioterapia. La determinación de los niveles de expresión de TS puede usarse como biomarcador predictivo de respuesta en estos pacientes. La RT-qPCR diseñada es una buena herramienta para evaluar la expresión de TS a partir de muestras embebidas en parafina (FFPE).
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