PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA. BOLETIN INFORMATIVO Nro. 5 OCTUBRE

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1 PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán BOLETIN INFORMATIVO Nro. 5 OCTUBRE COMENTARIOS ENCUESTA 44 Cepa Nº1: Proteus mirabilis Esta cepa correspondía a un aislamiento de P. mirabilis aislado de orina de un paciente de sexo femenino con infección urinaria baja no complicada. P. mirabilis es uno de los agentes más frecuentes de infecciones urinarias de la comunidad aunque también se lo puede asociar a infecciones intrahospitalarias. Este microorganismo es, dentro la familia Enterobacteriaceae, uno de los más sensibles a los antibióticos ß- lactámicos, probablemente por la gran permeabilidad de su membrana externa y por una expresión prácticamente indetectable de su ß-lactamasa cromosómica. Por ello, las cepas salvajes de P. mirabilis presentan sensibilidad incluso a ampicilina. La resistencia a los antibióticos ß-lactámicos es casi siempre debida a la adquisición de distintas enzimas plasmídicas. Para esta cepa, el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) recibió la respuesta de 377 laboratorios. El 97,4 % (n=367) de los laboratorios informaron correctamente género y especie. Tabla 1.a PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 1

2 Tabla 1.a. Cepa 1: Concordancia en la Identificación bioquímica. Concordancia Nº Porcentaje (%) Género y especie correctos ,3 Género correcto 0 0 Género correcto y especie incorrecta 9 2,4 Género incorrecto 1 0,3 Nueve laboratorios (2,4%) contestaron género correcto y especie incorrecta, estos informaron P. penneri (4), P. vulgaris (4) y P. mulieris (1). Sólo un laboratorio informó género incorrecto (Staphylococcus epidermidis) probablemente debido a una contaminación accidental, por lo que este dato fue retirado del análisis global de pruebas de sensibilidad. Con respecto a la sensibilidad, la Cepa 1 posee un mecanismo de resistencia enzimático a β-lactámicos ya que es portadora de una β-lactamasas tipo AmpC de naturaleza plasmídica, perteneciente a la familia CIT/CMY. Las β-lactamasas tipo AmpC plasmídicas (BLAP) son enzimas de clase C de Ambler y grupo 1 de Karen Bush y tienen su origen en las β-lactamasas AmpC cromosómicas propias de Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Morganella morganii y Hafnia Alvei. En el caso de las enzimas de la familia CIT/CMY el origen es C. freundii. Las BLAP, al igual que sus progenitores cromosómicos, confieren un patrón característico de resistencia a los antibióticos β-lactámicos que incluye: resistencia a amino, carboxi y ureidopenicilinas; cefalosporinas de primera y segunda generación y, en la mayoría de los casos, resistencia a cefamicinas (cefoxitina). La actividad in vitro sobre las cefalosporinas de tercera generación (C3G) y el aztreonam es variable. A diferencia de las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) más frecuentes en nuestro país (CTX-M y PER), las BLAP tienen muy débil actividad sobre cefalosporinas de cuarta generación (C4G). Los inhibidores clásicos de enzimas de clase A como ác. clavulánico, sulbactam y tazobactam tienen escaso poder inhibitorio sobre las BLAP, aunque algunas pueden ser levemente inhibidas por sulbactam y tazobactam. Los inhibidores por excelencia de estas enzimas son los compuestos derivados del ácido borónico y oxacilina o cloxacilina (Beesley y cols. Biochem J.17:316; 1982; Yagi y cols. JCM, 43:2551; 2005). PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 2

3 El P. mirabilis enviado presenta resistencia neta a los antibóticos ß-lactámicos solicitados en la encuesta (ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefalotina) y sensibilidad a ciprofloxacina, trimetoprima/sulfametoxazol y gentamicina. Los rangos de halos de inhibición obtenidos en el LNR se muestran en la Tabla 1.b. Tabla 1.b. Cepa 1: Rangos de referencia y resultados de interpretación de las zonas de inhibición del LNR. Antimicrobiano Rango de referencia (mm) Interpretación Ampicilina 6-6 Resistente Ampicilina/sulbactam 6-9 Resistente Cefalotina 6-6 Resistente Ciprofloxacina Sensible Trimetoprima/sulfametoxazol Sensible Gentamicina Sensible Con el envío de esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios participantes de sospechar y detectar mecanismos de resistencia a C3G partiendo de los datos de un antibiograma mínimo como es el que puede utilizarse en aislamientos de bacilo gram negativos en muestras de infección urinaria no complicada de la comunidad. A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretación fue 98.8%. Solo se detectaron 1,2% de errores en la interpretación (27/2242), de los cuales el 55,6% fueron errores menores (15/27), 25,9% muy graves (7/27) y 18,5% graves (5/27). Todos los errores menores y muy graves estuvieron asociados a los datos de sensibilidad de ampicilina/sulbactam. En el resto de los antimicrobianos no se observaron dificultades de interpretación, excepto 5 errores graves en los antibióticos no ß-lactámicos (Tabla 1.c). Una explicación posible para los errores graves podría ser que en las lecturas de los halos de inhibición se haya tenido en cuenta el swarming (invasión superficial de los halos de inhibición), típico del género Proteus (debemos recordar que éste no debe ser tenido en cuenta en la determinación del diámetro de inhibición). PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 3

4 Tabla 1.c. Cepa 1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los labs. del PCC-NAC y el LNR. Nº S I R Respuestas Nº % Nº % Nº % Ampicilina Ampicilina/Sulbactam , ,1 Cefalotina Ciprofloxacina , ,3 Trimetoprima/Sulfametoxazol , ,5 Gentamicina , ,5 S: sensible, I: intermedio, R: resistente Resultado correcto Errores menores Errores graves Errores muy graves Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos establecidos por el LNR con una concordancia global de 89,2%. Hubo más de un 98% de concordancia para ampicilina y cefalotina, mientras que el 22,5% de los participantes obtuvieron valores de halos de inhibición por fuera del rango esperado para ampicilina/sulbactam. La concordancia para los antimicrobianos no ß-lactámicos fue entre 83,8 y 89,4 % (Tabla 1.d). Tabla 1.d. Cepa 1: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y el rango calculado por el LNR. Nº Dentro del rango Fuera del rango Respuestas Nº % Nº % Ampicilina ,4 2 0,6 Ampicilina/Sulbactam , ,5 Cefalotina ,6 5 1,4 Ciprofloxacina , ,2 Trimetoprima/Sulfametoxazol , ,6 Gentamicina , ,1 Como ya se mencionó, el aislamiento en estudio presentaba una BLAP. Un total de 349 laboratorios respondieron sobre el mecanismo de resistencia utilizando el campo sugerido ad hoc (Tabla 1.e). El 76,5% de los laboratorios respondió correctamente AmpC PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 4

5 plasmídico. 45 laboratorios (12,9%) indicaron como mecanismo sugerido BLEE o BLEE+impermeabilidad posiblemente porque algunos participantes detectaron una leve inhibición (efecto huevo ) entre amoxicilina/ác. clavulánico y las C3G. Si bien el inhibidor característico de la BLAP son los derivados del ácido borónico, estas enzimas puede ser levemente inhibibles por ác. clavulánico, sulbactam y tazobactam, por lo que puede observarse dicho efecto. El aislamiento presentaba otros indicios que descartaban la presencia de BLEE como único mecanismo, como ser: halos de sensibilidad para cefepime similares a las cepas salvajes (30mm) y falta de agrandamiento 5mm para las combinaciones cefotaxima/cefotaxima+ac. clavulánico y ceftacidima/ceftacidima+ac. clavulánico. Tabla 1.e. Cepa 1: Mecanismo de resistencia sugerido. Mecanismo de referencia inferido Nº Respuestas % AMPC PLASMIDICO ,5 BLEE HIPERPRODUCCION/DERREPRESION DE AMPC 18 5,2 AMPC+ IMPERMEABILIDAD 5 1,4 BLEE+ IMPERMEABILIDAD 3 0,9 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras) 2 0,6 AMPC PLASMIDICO + SENSIBILIDAD DISMIN. A FQ 1 0,3 BETALACTAMASA (Haemophilus spp./ Enterococcus spp. / Moraxella spp.) 1 0,3 NO APLICA 10 2,9 Los laboratorios que informaron como mecanismo inferido hiperproducción/derrepresión de AmpC no tuvieron en cuenta que P. mirabilis no posee naturalmente una AmpC cromosómica por lo que el término hiperproducción/derrepresión no sería aplicable a esta especie. El aislamiento no poseía señales de impermeabilidad ni sensibilidad disminuida a las fluorquinolonas (ác. nalidíxico: 24mm, ciprofloxacina: 36mm). La cepa no presenta ningún mecanismo que afecte la actividad de los carbapenemes. Es importante recordar que el género Proteus presenta sensibilidad disminuida de manera natural a imipenem (los otros carbapenemes como meropenem o ertapenem no se ven afectados). Sin embargo esta sensibilidad disminuida difícilmente confiera valores de resistencia. Nota: se recuerda a los participantes que la sospecha de carbapenemasa en este genero requiere de halos disminuidos a dos carbapenemes simultaneamente, a saber imipenen <=22 + meropenem <=27 mm. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 5

6 Detección de BLAP P. mirabilis no presenta resistencia natural a ningún antibiótico β-lactámico activo sobre bacilos Gram negativos, por lo que la resistencia neta (6mm) observada a cefalotina debería haber sido un llamado de atención a la hora de analizar los posibles mecanismos de resistencia involucrados. Halos de cefalotina de 6mm son una alerta para la presencia de ß-lactamasas tipo BLEE o BLAP en las enterobacterias carentes de AmpC inducible (E. coli, Klebsiella spp, P. mirabilis, Shigella spp, Salmonella sp y C. koseri), por lo que amerita completar el antibiograma para caracterizar el mecanismo implicado de resistencia a los ß-lactámicos. Al completar el antibiograma se pudo observar la resistencia a cefoxitina y sensibilidad reducida a C3G. Se observaron halos de resistencia a cefotaxima (22mm) y sensibilidad a ceftacidima (21mm), con halos de inhibición muy cercanos al punto de corte. Se obtuvieron los valores de CIM para C3G por método automatizado (Vitek) y por dilución en agar. El valor de CIM para cefotaxima fue 8 μg/ml para ambos métodos siendo interpretado como resistente, mientras que la CIM de ceftacidima fue de 16 μg/ml y 8μg/ml respectivamente siendo resistente e intermedio según el método ensayado. El aislamiento NO presentó agrandamiento 5mm para las combinaciones cefotaxima/cefotaxima+ac. clavulánico ni ceftacidima/ceftacidima+ac. clavulánico, característicos de las BLEE y se observó sensibilidad a cefalosporinas de cuarta generación (cefepime: 30mm, 1μg/ml). De esta manera, se confirma la ausencia de BLEE en esta cepa. Todos estos indicios nos conducen a sospechar de la presencia de una β-lactamasa tipo AmpC plasmídica. Debido a que P. mirabilis no posee una β-lactamasa tipo AmpC en su cromosoma, la detección de esta enzima implica la adquisición de un elemento móvil (plásmido). Para la confirmación fenotípica se debe realizar la búsqueda de sinergia (efecto huevo ) entre cefoxitina y/o las C3G y el ácido 3-amino-fenil-borónico (APB) (300 μg/disco) (como se ve en el ejemplo de la Foto 1 disco 33= APB). El APB se desempeña como inhibidor de las β-lactamasas tipo AmpC, independientemente de su codificación cromosómica o plasmídica, y aunque también actúa como inhibidor de carbapenemasas de clase A (KPC, SME, IMI/NMC, etc), esta característica no dificulta la detección de BLAP en aislamientos que no presenten compromiso en la sensibilidad a los carbapenemes. Otro inhibidor de las β-lactamasas tipo AmpC es la cloxacilina, que inhibe específicamente a estas enzimas pero no a las carbapenemasas de clase A. El desempeño de este inhibidor fue recientemente evaluado en el LNR al desafiar la capacidad de detección de BLAP de dos métodos comerciales (AmpC Confirm ID Pack y ESBL+AmpC Screen Pack, ROSCO Diagnostica) que comparan los halos de inhibición obtenidos con discos de C3G solas y su combinación con cloxacilina. Ambos métodos tuvieron un muy PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 6

7 buen desempeño en la detección de las BLAP. Las fallas de detección correspondieron a mecanismos de baja prevalencia y a cepas multirresistentes con más de un mecanismo adquirido de resistencia a C3G (BLEE más BLAP) (Ver Posters adjuntos: Rapoport y col. SADEBAC 2012). Otra prueba simple para corroborar la naturaleza enzimática de la resistencia a cefoxitina son los métodos microbiológicos (Masuda, Hodge, y modificaciones de éstos). En presencia de BLAP, estos métodos presentan un resultado positivo, como el caso de la cepa en estudio. Las BLAP no son el único mecanismo que afecta cefoxitina: la resistencia puede ser de naturaleza no enzimática debida a impermeabilidad de la membrana externa. Para el aislamiento en estudio, la sinergia con APB y el método de Hodge dieron positivos por lo que se confirma la naturaleza enzimática de la resistencia a cefoxitina, que posteriormente fue caracterizada por PCR, dando un resultado positivo para el gen cit/cmy CAZ APB CTX Foto 1. Sinergia entre discos de 3-amino fenil borónico (APB) vs. cefotaxima (CTX) y ceftacidima (CAZ). Informe de BLAP En el aislamiento en estudio se confirmó la presencia de BLAP y la ausencia de BLEE, por lo que las C3G deberían ser informadas según los halos de inhibición obtenidos (Tabla 2A M100-S22). Sin embargo se observa un error minor para la interpretación de ceftacidima frente al método de referencia (dilución en agar) ya que por disco debería interpretarse como sensible, mientras que por CIM se informaría intermedio. A la fecha no existe consenso sobre el reporte de las C3G en cepas productoras de AmpC plasmídico. Del mismo modo, es escasa la bibliografía internacional sobre la utilidad clínica de C3G en infecciones provocadas por enterobacterias con BLAP. Sin embargo los nuevos puntos de corte de CLSI para C3G (vigentes en el documento del CLSI desde el año 2010 y mantenidos en ediciones posteriores: CAZ: R 17mm, S 21mm, R 16μg/ml, S 4μg/ml y CTX: R 22mm, S 26mm, R 4μg/ml, S 1μg/ml) mejoraron significativamente la detección PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 7

8 de BLAPs con respecto a los puntos de corte previos (M100-S19, 2009). Teniendo en cuenta estos conceptos, a la hora de guiar el tratamiento antimicrobiano, sería prudente evitar el uso de las C3G en infecciones severas basado en las siguientes certezas: las resistencias enzimáticas como las BLAP elevan poblacionalmente las CIMs de los sustratos afectados y a su vez, estos valores son plausibles de ser afectados por inóculos bacterianos de alta densidad. Uno de los puntos críticos en este tipo de aislamientos de infecciones severas es descartar la presencia de BLEE para poder informar correctamente la sensibilidad de las C4G. Ante la confirmación de ausencia de BLEE, el cefepime debe ser informado como sensible, en el caso que presentara sensibilidad in vitro. Conclusiones finales. La búsqueda de este tipo de enzimas es especialmente significativa en aquellos géneros y especies que carecen naturalmente de β-lactamasas tipo AmpC cromosómicas, como es el caso de P. mirabilis, Klebsiella spp., y Salmonella y en aquellas que la producen en forma basal o en pequeñas cantidades, como Escherichia coli y Shigella spp. Se recomienda la utilización de discos de APB cuando se sospecha la presencia de este mecanismo en estos géneros bacterianos. Por el contrario, en aquellas especies productoras de AmpC cromosómico (Enterobacter spp. C. freundii, M. morganii, P. aeruginosa, Serratia spp., Providencia spp.) no tendría sentido probar el disco de APB para tal fin. En Argentina, la emergencia documentada de BLAP se remite a la descripción de una enzima tipo FOX-1 en un aislamiento de K. pneumoniae en el año 1994 (Gonzalez Leiza M. y col. AAC 1994; 38:2150). Más recientemente, se describe un brote de Shigella flexneri productora de CMY-2 del Hospital Materno Infantil de Mar del Plata (Rapoport M. y col. IJAA 2008; 31:385). Desde el año 2006, han sido confirmados en el INEI-ANLIS Malbrán un número creciente de casos de BLAP en P. mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella y Shigella. Estos datos de emergencia nacional establecen la necesidad de estar alertas ante la aparición de perfiles de resistencia compatibles con el mecanismo aquí descripto. Este reconocimiento permitirá alertar al cuerpo médico no sólo para la seguridad en la elección del tratamiento del paciente, sino para el diseño de medidas de control a fin de evitar la diseminación vertical u horizontal de este mecanismo, ya que cepas con estas características probaron su habilidad para ocasionar brotes de distinta magnitud. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 8

9 Cepa Nº 2: Aerococcus urinae Se trataba de un Aerococcus urinae aislado de orina, cuyo desafío era la identificación bioquímica. De los 377 laboratorios que contestaron la encuesta, 265 realizaron la identificación bacteriana; 26 laboratorios (6,9%) no reportaron dato y 86 la informaron como no viable (22,8%). El 84,9% de los laboratorios (225/265) informó correctamente género y especie, el 3,8 % (10/265) informó género correcto y omitió especie y el 1,5% (4/265) informó género incorrecto (Tabla 2.a). En la Tabla 2.b se detallan los errores en la identificación bacteriana. Tabla 2.a. Cepa 2: Concordancia en la Identificación bioquímica. Concordancia Porcentaje Nº (%) Género y especie correctos ,9 Género correcto 10 3,8 Género correcto y especie incorrecta 4 1,5 Género incorrecto 26 9,8 Tabla 2.b. Cepa 2: Errores en la Identificación Género y especie Nº laboratorios Aerococcus viridans 4 Streptococcus viridans 8 Streptococcus viridans, alfa hemolíticos 1 Streptococcus mitis 2 Streptococcus sp. 2 Streptococcus acidominimus 1 Streptococcus agalactiae 1 Staphylococcus saprophyticus 1 Staphylococcus aureus 1 Staphylococcus coagulase negative 1 Staphylococcus epidermidis 1 Enterococcus sp. 1 Globicatella sp. 1 Leuconostoc sp. 1 Neisseria gonorrhoeae 1 Oligella urethralis 1 Proteus mirabilis 1 Aeromonas ureae 1 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 9

10 Comentarios Cepa 2 (Dr. Carlos Vay) La familia Aerococcaceae (definida principalmente sobre la base del análisis filogenético de las secuencias del ARNr 16S) incluye dos grupos parafiléticos: Uno de ellos contiene únicamente al género Aerococcus, el otro a los géneros Abiotrophia, Dolosicoccus, Eremococcus, Facklamia, Globicatella e Ignavigranum. El género Aerococcus, y la especie Aerococcus viridans fueron propuestos en 1953 para contener a aquellos cocos gran-positivos catalasa negativos que se diferenciaban de los estreptococos por su modo de agrupamiento. Mucho más tardíamente, otras especies fueron incorporándose a ese género: Aerococcus christensenii, Aerococcus sanguinicola, Aerococcus suis, Aerococcus urinae, Aerococcus urinaeequi y Aerococcus urinaehominis. Todos ellos son cocos gran-positivos, inmóviles, que forman grupos, tétradas o pares en medio líquido (la especie A. christensenii forma a menudo cadenas cortas), aerobios y anaerobios, pero preferentemente, microaerófilos (Aerococcus viridans crece en el primer centímetro superior del caldo tioglicolato), catalasa negativos en su mayoría, sensibles a vancomicina, capaces de crecer en caldo hipersalado (ClNa 6,5%). Acidifican la glucosa (con excepción de Aerococcus suis, especie de importancia en veterinaria) y no poseen ningún antígeno de grupo de Lancefield. Las reacciones de acidificación de hidratos de carbono en caldo púrpura de bromocresol suelen demorar algunos días. Con excepción de algunos aislados de A. viridans, hidrolizan el hipurato. Es muy importante destacar que para abordar la identificación de los cocos gram-positivos catalasa negativos se requiere indefectiblemente, de la observación de la morfología que adoptan en medio líquido (caldo tioglicolato), pues de lo contrario sería imposible identificar correctamente a los diferentes integrantes de este grupo. La Tabla 2.c muestra la utilidad de tres características fenotípicas para diferenciar a los cocos gran-positivos catalasa negativos que forman pares, tétradas o grupos. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 10

11 Tabla 2.c: Identificación preliminar de cocos gran-positivos catalasa negativos que forman pares, grupos o tétradas, basada en tres características fenotípicas. Reacción fenotípica Microorganismo(s) posible PYR LAP ClNa(6,5%) Aerococcus sanguinicola, Dolosigranulum pigrum, Facklamia languida. + + Gemella haemolysans, Rothia mucilaginosa. + + Aerococcus viridans, Helcococcus kunzii. + + Aerococcus urinae, Aerococcus christensenii a, Pediococcus, Tetragenococcus b + Aerococcus urinaehominis Adaptado de Ruoff K. Manual of Clinical Microbiology, 10ª Edición, a A. christensenii puede presentar cortas cadenas. b Tetragenococcus halophilus (Enterococcus solitarius) se diferencia de Aerococcus urinae por las reacciones positivas de bilis-esculina y de arginina dehidrolasa(adh) y la incapacidad de hidrolizar hipurato. En el Manual de Microbiología de la ASM, 10ª Edición, 2001; Ruoff informa que el género Tetragenococcus es PYR -, sin embargo Facklam et al. describen a Tetragenococcus halophilus como PYR +; en este caso la reacción positiva de la prueba ADH y de Voges-Proskauer y la ausencia de hidrólisis del hipurato lo diferencian de A. sanguinicola. La Figura 2 muestra un esquema dicotómico para abordar la identificación de los cocos gram-positivos catalasa negativos, aerobios, que se agrupan o forman tetradas. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 11

12 Figura 2. PYR a + - LAP Va(30µg) + - R S ClNa 6,5% Hemólisis Pediococcus βgur + - γ α - + βgur Esculina Helcococcus kunzii Aerococcus christensenii Aerococcus sanguinicola Esculina Gemella haemolysans Rothia mucilaginosa c Aerococcus viridans b LAP Dolosigranulum Facklamia languida Aerococcus urinaehominis Aerococcus urinae a Abreviaturas: PYR: Pyrrolidonil aril amidasa; LAP: Leucina aminopeptidasa, βgur: Beta- glucuronidasa, Va (30 µg): disco de vancomicina de 30 µg; resistencia indica ausencia de halo de inhibición. b Helcococcus kunzii es exigente, a menudo lipofílico y crece en anaerobiosis. Aerococcus viridans forma colonias similares a las de los enterococos con un halo marcado de hemólisis alfa. Crece en la superficie del caldo tioglicolato, pues desarrollan pobremente o no lo hacen en anaerobiosis. c Rothia mucilaginosa (Stomatococcus mucilaginosus) forma colonias grandes blanco grisáceas que suelen adherirse al medio de cultivo. Son sensibles a bacitracina (0,04UI). Aerococcus spp. forma parte de la microbiota ambiental: se pueden hallar en el suelo, el polvo, el agua, la vegetación y por ende también en el ambiente hospitalario. De allí que a veces son contaminantes del Laboratorio de Microbiología, por lo que su hallazgo debe ser evaluado en contexto clínico. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 12

13 Aerococcus viridans, la especie más vieja del género, causa enfermedad mortal en las langostas marinas (gafkemia) y es oportunista para el hombre. Endocarditis, artritis séptica, bacteriemia, infección urinaria y espondilodiscitis son las infecciones ocasionadas por esta especie más descriptas. Aerococcus urinae fue descripto por Christensen en Dinamarca en 29 pacientes con sospecha de infecciones urinarias. Se lo denominó ALO, es decir microorganismo similar a los aerococos. En 11 de estos pacientes fue aislado como único microorganismo de la orina en un recuento superior a ufc/ml. El 50 % de los pacientes presentaban trastornos locales o sistémicos (diabetes, neoplasias del sistema urinario o de otros sitios, litiasis urinaria). Los pacientes con septicemia o endocarditis por estos microorganismos eran gerontes con enfermedades subyacentes tales como diabetes, cáncer de próstata e infarto de miocardio. Luego varias comunicaciones han sido publicadas en la que se demuestra definitivamente la capacidad de esta especie de causar infecciones urinarias con o sin bacteriemia y endocarditis. Recientemente, Senneby et al., han presentado un trabajo que muestra las características clínicas y microbiológicas de las bacteriemias por Aerococcus urinae. De 16 paciente con bacteriemia 15 eran hombres de más de 70 años y 12 presentaban condiciones urológicas subyacentes. El foco urinario fue sospechado en la mayor parte de los casos, sin embargo el microorganismo fue raramente aislado de la orina en esta serie. Nueve pacientes presentaron sepsis y uno falleció. Tres pacientes presentaron endocarditis, uno presentó espondilodiscitis como complicación de la misma y otro paciente embolia cerebral. En esta revisión los pacientes fueron tratados con antibióticos beta-lactámicos, aunque también fueron utilizadas quinolonas y clindamicina. Aerococcus urinae suele ser sensible a penicilina, amoxicilina y vancomicina. Las fluorquinolonas muestran moderada o buena actividad y algunas cefalosporinas pobre actividad, con excepción de cefepima. Cattoir et al., estudiaron la sensibilidad de 30 aislamientos de Aerococcus spp. (A. urinae 20, A. sanguinicola 8 y A. viridans 2) y demostraron que todos ellos, fueron sensibles a amoxicilina, vancomicina y teicoplanina y presentaron bajo nivel de resistencia a los aminoglucósidos(gentamicina). En este trabajo las fluorquinolonas, la fosfomicina y el co-trimoxazol (TMS) tuvieron actividad variable. A. urinae fue a menudo resistente a TMS y sensible a fosfomicina, en tanto que, A. sanguinicola fue resistente a fosfomicina y sensible a TMS. Sin embargo, Facklam describe que 10 de 15 aislados de A. sanguinicola mostraron sensibilidad intermedia a TMS y que la totalidad fueron muy sensibles a penicilina (CIM de 0,03 ug/ml ) y cefotaxima (CIM de 0,25 ug/ml). La resistencia a penicilina puede observase en la especie A. viridans con relativa frecuencia. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 13

14 A. christensenii ha sido aislado de vagina humana y A. urinaehominis de sangre y de orina respectivamente. A. sanguinicola fue aislado principalmente de sangre y de orina. Bibliografía: Cattoir V, Kobal A, Legrand P. Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola, two frecuently misidentified uropathogens. Scand J infect Dis. 42: , Christensen J, Jensen I, Faerk J et al. Bacteremia/septicemia, due to Aerococcus like organism: report of seventeen cases. Clin Infect Dis. 21: , Christensen J, Vibits H, Ursing J, et al. Aerococcus like organism, a newly recognized urinary tract pathogen. J Clin Microbiol.29: , Facklam R, Lovgren M, Shewmaker P, Tyrell G. Phenotipic description and antimicrobial susceptibilities of Aerococcus sanguinicola isolated from human clinical samples. J Clin Microbiol 41: , Ludwig W, Schleifer K, Whitman W.: Family II. Aerococcaceae fam. nov. In: De Vos P, Garrity G, Jones D, Krieg N, Ludwig W, Rainey F, Scheleifer K, Whitman W. (eds): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, second edition, vol. 3, p.533. (The Firmicutes), Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, Ruoff K. En En Versalovic J, Carroll K, Funke G, Jorgensen J, Landry ML, Warnock D. Manual of Clinical Microbiology. 10º Edición. Vol 1. Capítulo 22. ASM Press, Washington DC, Senneby E, Petersson A, Rasmussen M. Clinical and microbiology features of bacteremia with Aerococcus urinae. Clin Microbiol Infect. 18: , PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 14

15 Cepa Nº 3: Pseudomonas aeruginosa La cepa Nº 3 de esta encuesta provenía de hemocultivos de un paciente con bacteriemia. Se enviaron dos aislamientos de Pseudomonas aeruginosa productores de carbapenemasa tipo metalo-beta-lactamasa (MBL), diferentes en cuanto al tipo de enzima involucrada en dicho mecanismo de resistencia a los antibióticos β-lactámicos y a la sensibilidad/resistencia al resto de los antibióticos solicitados: Cepa 3.1. P. aeruginosa MBL tipo IMP Cepa 3.2. P. aeruginosa tipo VIM. La mitad de los participantes del Programa recibió la Cepa 3.1 y la otra mitad, la cepa 3.2. En la Tabla 3 se muestra un cuadro comparativo con las características fenotípicas y genotípicas diferenciales de las dos cepas en cuestión: la Cepa 3.1 era resistente de alto nivel a ceftacidima y ciprofloxacina y sensible a amicacina y la Cepa 3.2 era resistente de alto nivel a amicacina, resistente de bajo nivel a ceftacidima y sensible a ciprofloxacina. Tabla 3: Características fenotípicas/genotípicas de P. aeruginosa 3.1 y 3.2 Cepa 3.1 P. aeruginosa MBL IMP Cepa 3.2 P. aeruginosa MBL VIM Antibiótico Zona de Interpretación Zona de Interpretación inhibición (mm)/ inhibición (mm)/ Imipenem Resistente 6 15 Resistente Meropenem Resistente 6 17 Resistente Ceftazidima 6 Resistente 9 17 Resistente Piperacilina/ Intermedio/Sensible Resistente/Intermedio Tazobactam Ciprofloxacina 6 Resistente Sensible Amicacina Sensible 6 Resistente PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 15

16 Epidemiología de las MBL en Pseudomonas aeruginosa: En las últimas décadas se ha demostrado la emergencia y diseminación de cepas de bacilos gram negativos productores de carbapenemasas tipo MBL en diferentes partes del mundo. Sin embargo, P. aeruginosa, continúa siendo el huésped bacteriano más frecuentemente asociado a MBL a nivel mundial, sólo amenazado en los últimos años por la dispersión de NDM en múltiples especies de Enterobacterias. Los primeros hallazgos de MBL en P. aeruginosa provienen de Japón (Wantabe, 1991) y Verona, Italia (Laurenti, 1999), para enzimas de tipo IMP y VIM respectivamente. Posteriormente otras enzimas han sido reconocidas como parte de la familia de MBLs en aislamientos clínicos de P. aeruginosa como SPM, GIM, AIM y NDM. Estas enzimas poseen capacidad hidrolítica sobre penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes y cefamicinas (cefoxitina). Sólo el monobactam aztreonam (AZT) evade la acción de estas carbapenemasas, siempre que se encuentre como mecanismo único. Las enzimas de la familia MBL pertenecen a la clase molecular 3b de la clasificación de Karen Bush. De manera distintiva, las MBLs requieren de metales divalentes (Zn 2+ ) en su sitio activo, indispensable para su capacidad hidrolítica. Es por ello que en presencia de EDTA u otros quelantes de metales divalentes, como la combinación de EDTA+SMA (ácido etilendiaminotetraacético/mercaptoacetato de sodio), estas enzimas presentan una inhibición característica. P. aeruginosa: Detección de carbapenemasas del tipo MBL (Grupo 3b de Karen Bush.) EDTA/SMA imipenem meropenem ceftacidima aztreonam Pip+tazob. Ceftacidima + ac clavulanico cefepima PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 16

17 Las variantes más comúnmente reportadas son IMP-1, IMP-13 y VIM-2, todas ellas microbiológica y clínicamente similares que han alcanzado proporciones pandémicas debido a la movilización de clones hiper-epidémicos. En Argentina, los primeros hallazgos de MBL se produjeron a finales del año En la Ciudad Autónoma de Buenos Aires se detecta por primera vez la presencia de una nueva variante de VIM (VIM-11) en P. aeruginosa recuperada de un paciente pediátrico (Pasterán, 2005). Desde entonces, se ha vigilado activamente en Argentina la aparición de MBL en P. aeruginosa y también en otros bacilos gram negativos. En la actualidad, se ha podido identificar la dispersión en Argentina de P. aeruginosa productoras de diversas MBLs con un patrón regional característico y único en el país. Independientemente de la zona geográfica y las variantes involucradas, se observa una tendencia sostenida y creciente de casos reportados durante los últimos dos años. Ello motivó el envío de la presente cepa a los laboratorios participantes del Programa. Consecuencias clínicas: Las consecuencias clínicas producto de la emergencia de MBL han sido exploradas en los últimos años. La mortalidad asociada a infecciones severas por P. aeruginosa productoras de MBL asciende al 70-95% (Carmeli, 2010; Zavaschi, 2006). Según estas publicaciones, las únicas variables con capacidad de ser modificadas, en todo intento por reducir la mortalidad asociada, resultan el inicio precoz del tratamiento antimicrobiano y la apropiada selección de antibióticos. Es por ello que la detección precoz de este tipo de resistencia es crítica y debe ser realizada con la mayor precisión diagnóstica por parte de los laboratorios de microbiología clínica. El régimen antimicrobiano ideal para el tratamiento de infecciones producidas por P. aeruginosa con MBL aún no se ha determinado, pero sin lugar a dudas, el uso clínico como monoterapia de sustratos afectados por la enzima como penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes, no debería ser considerado de primera elección. Debido a la multiresistencia asociada a cepas productoras de MBL, colistina resulta el antimicrobiano con mayor actividad in vitro y ha sido utilizado para el tratamiento de estos gérmenes (Sabuda, 2008). Al igual que para enterobacterias productoras de carbapenemasa, la terapia combinada se asocia a mayor éxito clínico (Carmelli 2010). La inclusión de un carbapenem en la combinación no ha sido explorado, tal vez por los altos valores de CIM a carbapenem frecuentemente asociados a P. aeruginosa con carbapenemasa, a diferencia de las Enterobacterias que han adquirido estos mecanismos. Detección fenotípica: en el Boletín Informativo Nº , en los comentarios de la Cepa 3-Encuesta Nº42: P. aeruginosa KPC+ (enviado en noviembre de 2011), se incluyó PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 17

18 una actualización sobre la Detección fenotípica de carbapenemasas en Pseudomonas aeruginosa. Este Boletín contenía: el ALGORITMO DE BÚSQUEDA DE CARBAPENEMASAS - PAE 2012 con información vigente para el análisis interpretado del antibiograma de P. aeruginosa. Para más detalles sobre la búsqueda y confirmación de carbapenemasas en PAE, por favor remitirse a dicho Boletín. De todas formas, anexamos nuevamente el algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas en P. aeruginosa. Con esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios para detectar carbapenemasas de trascendencia clínica y epidemiológica, como las MBLs. Este punto es de suma importancia, porque la presencia de carbapenemasas involucradas en procesos infecciosos severos, determina alta probabilidad de falla de tratamiento a aquellas drogas incluidas en el espectro de sustratos de estas enzimas. Mas aún, estas carbapenemasas tienen una gran capacidad de diseminación, por lo que su hallazgo, debe acompañarse con los mayores esfuerzos del equipo de salud a fin de contener una posible diseminación del microorganismo o de la carbapenemasa. Pruebas de sensibilidad de Cepa 3.1: P. aeruginosa MBL tipo IMP La identificación bacteriana fue realizada por 187 laboratorios. El 98,9% de los laboratorios (185/187) informó correctamente género y especie y 1,1% (2 laboratorios) informaron género correcto pero reportaron especie incorrecta. (Tabla 3.1.a). Tabla 3.1.a. Cepa 3.1: Concordancia en la Identificación bioquímica. Concordancia Porcentaje Nº (%) Género y especie correctos ,9 Género correcto - - Género correcto y especie incorrecta 2 1,1 Género incorrecto - - El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi--penicilinas y cefalosporinas por la portación de MBL y además a ciprofloxacina (CIM 4µg/ml) y sensibilidad a PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 18

19 piperacilina/tazobactam (CIM 16µg/ml), gentamicina (CIM 4µg/ml), amicacina (CIM 2µg/ml) y colistín (CIM 2µg/ml). Presentaba sensibilidad intermedia a aztreonam (CIM 16µg/ml, halo 19 mm). CIM (µg/ml) CAZ FEP TAZ ATM GEN AKN CIP COL 64 (R) 64 (R) 16(S) 16 (I) 4 (S) 2(S) 4 (R) 2(S) CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam, GEN: gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin La CIM a imipenem y meropenem de este aislamiento por distintas metodologías se presenta en la Tabla 3.1.c. A pesar de algunas diferencias observadas en los valores absolutos de las CIMs a los carbapenemes, todas las metodologías fueron capaces de detectar esta cepa como sospechosa de carbapenemasa con las señales de alarma de cada una de las metodologías propuestas en el algoritmo del LNR. Ver Anexo 3: Algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas. Tabla 3.1.c. Cepa 3.1: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas metodologías CEPA 3.1 A.dilución (μg/ml) Microdilución (μg/ml) Vitek2C (μg/ml) Phoenix (μg/ml) Etest (μg/ml) Sensititre (μg/ml) Rango LNR (mm) MEROPENEM IMIPENEM Sospecha carbapenemasa según Algoritmo SI SI SI SI SI SI SI La presencia de MBL también se confirmó fenotípicamente con el Método de discos combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos (Póster ICAAC 2011, Pasterán y cols. Meropenem: 19 mm Meropenem + APB (600ug/disco): 19 mm Delta: 0 mm Interpretación: Negativo (<=3). Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 19 mm Delta: 0 mm Interpretación: Negativo (<=2) Meropenem + EDTA (750ug/disco): 32 mm Delta: +13 mm Interpretación: Positivo (>= 8) A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretación fue 92,7 %. Se PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 19

20 detectaron 7,2% de errores en la interpretación (n=80), de los cuales 46 fueron errores menores (57,5%), 9 graves (11,3%) y 25 muy graves (31,2%). La mayoría de los errores menores estuvieron asociados a piperacilina/tazobactam (36/46), los graves estuvieron asociados a amicacina (9/9) y los muy graves se distribuyeron principalmente entre imipenem (8 errores), meropenem (8 errores) y ciprofloxacina (7 errores). Se detectó que siete laboratorios cometieron error muy grave en la interpretación de ciprofloxacina y error grave en amicacina, simultáneamente. Esto podría deberse a que si bien se les envió la cepa 3.1, informaron resultados compatibles con el fenotipo de la cepa 3.2. Más del 90% de los laboratorios interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima (92,5, 94,6% y 98,4 respectivamente). (Tabla 3.1.d) Para piperacilina/tazobactam el rango de referencia fue mm correspondiéndose con la categoría de I o S del CLSI. De los 175 laboratorios que reportaron zonas de inhibición para este antibiótico, 148 (84.6%) informaron este antimicrobiano dentro del rango de referencia. 125 laboratorios (69,8%) lo interpretaron como S, 18 (10,1%) I y 36 (20,1%) R. La cepa presentó un valor de CIM de 16 ug/ml cuando se ensayó por los métodos de referencia, correspondiéndose con la categoría sensible del CLSI (la CIM borderline que presenta este antibiótico sería responsable del comportamiento descripto en el método de difusión). Piperacilina/tazobactam podría ser una opción terapeútica (alta dosis) en cepas de P. aeruginosa con MBL que presenten sensibilidad a esta droga (Zavaschi, 2006). Tabla 3.1.d. Cepa 3.1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los labs. del PCC-NAC y el LNR. Nº S I R Respuestas Nº % Nº % Nº % Imipenem ,3 6 3, ,5 Meropenem ,3 2 1, ,6 Ceftacidima ,1 1 0, ,4 Piperacilina/Tazobactam , , ,1 Ciprofloxacina ,8 1 0, ,7 Amicacina ,2-9 4,8 S: sensible, I: intermedio, R: resistente Resultado correcto Errores menores Errores graves Errores muy graves PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 20

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