Regulación de la respuesta inflamatoria inducida por componentes bacterianos mediante la acción del Extracto Dializable de Leucocitos

Transcripción

1 CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA Regulación de la respuesta inflamatoria inducida por componentes bacterianos mediante la acción del Extracto Dializable de Leucocitos TRABAJO DE TESIS EN OPCIÓN AL GRADO CIENTÍFICO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Autor: Lic. Miriam Ojeda Ojeda Tutores: Dr. Manuel de Jesús Araña Rosaínz Dra. Celia Berta Fernández Ortega Asesor: Dr. Wim A. Buurman Ciudad de La Habana 2004

2 SÍNTESIS La inflamación es una respuesta protectora localizada, frente a la invasión microbiana o al daño tisular causado por los microorganismos patógenos o por agentes no infecciosos de naturaleza química o mecánica. El lipopolisacárido (LPS) o endotoxina de las bacterias Gram-negativas, así como el peptidoglicano (PGN) y el ácido lipoteicoico (LTA) de las bacterias Gram-positivas, constituyen los elementos patogénicos principales de estos organismos. Sin embargo, no sólo los componentes de la pared celular de las bacterias constituyen elementos nocivos, sino también su ADN. La interacción de estos patrones moleculares de los patógenos microbianos con las células inmunocompetentes mediante receptores específicos, activa eventos intracelulares que resultan en la producción de citocinas proinflamatorias y otras moléculas efectoras como parte de la respuesta inflamatoria. La investigación recogida en el documento de Tesis tiene como propósito demostrar que la respuesta inflamatoria iniciada por elementos estructurales de las bacterias se modula por el Extracto Dializable de Leucocitos (EDL), efecto que pudiera estar relacionado con la regulación de las vías de señalización mediadas por el factor transcripcional NF-κB y la molécula AMPc. En este trabajo se demuestra, por primera vez, que la producción in vitro de las citocinas proinflamatorias TNFα, IL-6 e IL-8, inducida por gérmenes tanto Gram-negativos como Gram-positivos, ses modula diferencialmente por el EDL. Además, la respuesta inflamatoria mediada por la secreción de TNFα frente a las secuencias inmunogénicas CpG del ADN de las bacterias, se suprime por el EDL. Sin antecedentes, se evidencia que la producción de IL-8 se induce por el EDL en células implicadas en la respuesta inmune e inflamatoria. La modulación de la expresión de las citocinas TNFα, IL-6 e IL-8 en presencia de EDL en experimentos ex vivo, con células mononucleares, monocitos y células endoteliales, indica que el efecto modulador de la respuesta inflamatoria inicial por el EDL no se restringe a los leucocitos. Por otra parte, la actividad de unión del factor transcripcional NF-κB a secuencias específicas de ADN es regulada negativamente por el EDL, lo cual indica que el EDL interviene en la regulación temprana de la expresión de los genes TNFα, IL-6 e IL-8, inducida por los patógenos microbianos. Además, el aumento de los niveles de AMPc por el EDL podría estar asociado con el efecto modulador del EDL sobre los mediadores de la inflamación TNFα, IL-6 e IL-8. Los datos presentados sugieren que la regulación diferenciada de la respuesta inflamatoria inducida por componentes estructurales de las bacterias en presencia del EDL, posiblemente no ocurre sólo a través de la regulación de vías de señalización mediadas por el NF-κB y el AMPc, sino que podría estar asociada además a la regulación positiva por el EDL de la expresión de los receptores TLR4 y TLR2 en la superficie celular. Estos resultados permitirán definir estrategias encaminadas a regular mecanismos de señalización involucrados en la transcripción de genes proinflamatorios, mediante el empleo de la preparación del EDL en el tratamiento de diversas patologías con un marcado componente inflamatorio.

3 LISTA DE CONTENIDO ABREVIATURAS I. INTRODUCCIÓN... 1 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA... 5 II.1 La regulación de la respuesta inmune frente a la infección... 5 II.2 La arquitectura de la pared celular de las bacterias... 6 II.2.1 La estructura del lipopolisacárido II.2.2 La estructura del ácido lipoteicoico II.2.3 La estructura del peptidoglicano... 8 II.3 El reconocimiento de componentes bacterianos por el hospedero II.4 La familia de los receptores tipo Toll II.5 Otras moléculas involucradas en el reconocimiento de componentes estructurales de las bacterias 11 II.6 La señalización intracelular mediada por los receptores tipo Toll.. 12 II.7 El factor transcripcional NF-κB.. 14 II.8 La cascada de señalización mediada por el monofosfato de adenosina 3,5 cíclico II.9 La intervención terapéutica en la señalización intracelular II.9.1 El factor transcripcional NF-κB como blanco terapéutico II.10 El extracto dializable de leucocitos II.10.1 Actividades biológicas del extracto dializable de leucocitos II.10.2 Aplicaciones clínicas del extracto dializable de leucocitos III. MATERIALES Y MÉTODOS III.1 Obtención y determinación de la actividad biológica del extracto dializable de leucocitos III.2 Líneas celulares y cultivos primarios III.3 Ensayo de producción de citocinas en sangre total humana (producción ex vivo) III.4 Aislamiento y ensayo de activación de células mononucleares de sangre periférica humana III.5 Aislamiento y ensayo de activación de monocitos de sangre periférica humana III.6 Ensayo para la cuantificación de TNFα humano III.7 Ensayo para la cuantificación de IL-6 humana III.8 Ensayo para la cuantificación de IL-8 humana III.9 Bioensayo para la determinación de la actividad de TNFα en las células L III.10 Ensayo de activación de la cascada del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) III.11 Obtención de extractos nucleares III.12 Ensayo de retardación de la migración en gel para el factor transcripcional NF-κB III.13 Aislamiento de ARN total III.14 Transcripción inversa y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 30 III.15 Evaluación de la expresión de receptores tipo Toll en la superficie celular III.16 Ensayo inmunoenzimático para la cuantificación del monofosfato de adenosina 3,5 cíclico III.17 Análisis estadístico IV. RESULTADOS IV.1 Evaluación de la liberación de TNFα estimulada por LPS en experimentos ex vivo en presencia del EDL IV.2 Determinación de la producción de las citocinas IL-6 e IL-8 inducida por el LPS en experimentos ex vivo en presencia del EDL... 36

4 IV.3 Evaluación de la liberación de citocinas proinflamatorias en células mononucleares humanas estimuladas con el LPS y tratadas con el EDL IV.4 Determinación de la producción de TNFα, IL-6 e IL-8 inducida por el LPS en monocitos aislados de sangre periférica humana expuestos al EDL IV.5 Evaluación de la producción de citocinas proinflamatorias por la sangre total expuesta a componentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas en presencia del EDL IV.6 Determinación de la producción de citocinas proinflamatorias en células mononucleares humanas estimuladas por componentes de la pared celular de las bacterias Grampositivas y expuestas al tratamiento con el EDL IV.7 Evaluación de la producción de TNFα, IL-6 e IL-8 inducida por componentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas en cultivos de monocitos aislados expuestos al EDL IV.8 Determinación de la presencia del LPS en la preparación de PGN IV.9 Evaluación de la liberación de citocinas proinflamatorias en células endoteliales activadas y tratadas con el EDL IV.10 Evaluación de la acción del EDL sobre la actividad citotóxica del TNFα IV.11 Determinación de la producción de TNFα en sangre total activada por fragmentos de ADN de bacterias con repeticiones de secuencias CpG, en presencia del EDL IV.12 Evaluación de la expresión de los receptores TLR2 y TLR4 en sangre total activada y expuesta al EDL IV.13 Evaluación de la actividad de unión del NF-κB a secuencias específicas de ADN en células MT-4 tratadas con el EDL IV.14 Estudio de la transcripción de los genes p65nf-κb e IκBα en las células MT-4 cultivadas en presencia del EDL IV.15 Evaluación de la actividad de unión del NF-κB a secuencias específicas de ADN en sangre total activada con el LPS y tratada con el EDL IV.16 Evaluación de la inducción de los niveles de monofosfato de adenosina 3,5 cíclico en cultivos de monocitos aislados expuestos al EDL V. DISCUSIÓN V.1 La estimulación de la producción de TNFα por patrones moleculares de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas se inhibe por el EDL V.2 La producción de IL-6 e IL-8 estimulada por patrones moleculares de bacterias Gramnegativas y Gram-positivas se incrementa por el EDL V.3 Estimulación de la expresión de los receptores TLR2 y TLR4 en los monocitos por la acción del EDL.. 64 V.4 La actividad de unión del NF-κB a secuencias de ADN se inhibe por la acción del EDL V.5 El incremento de los niveles de AMP cíclico se asocia con la regulación de la respuesta inflamatoria por la acción del EDL 68 V.6 El EDL puede regular vías de señalización de la respuesta inflamatoria a diferentes niveles.. 70 VI. CONCLUSIONES VII. RECOMENDACIONES VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS AUTOBIBLIOGRAFÍA... 94

5 ABREVIATURAS AC ADN AMPc ANOVA ARN AP-1 CBP CRE CREB DO EDL ELISA FT HUVEC IFM Adenilato ciclasa Ácido deoxirribonucleico Monofosfato de adenosina 3,5 cíclico Análisis de varianza Ácido ribonucleico Proteína activadora-1 Proteína de unión a CRE (CREB-binding protein) Elemento de respuesta a AMPc (camp-response elements) Proteína de unión a la secuencia CRE (CRE-binding protein) Densidad óptica Extracto dializable de leucocitos Ensayo inmunoenzimático (enzyme-linked immunosorbent assay) Factor de transferencia Células endoteliales del cordón umbilical humano (human umbilical vein endothelial cells) Intensidad de fluorescencia media IκB Proteína inhibidora de NF-κB IKK Quinasas inhibidoras de IκB (IκB kinase) IL Interleucina kda Kilodalton LAL Lisado de amebocitos de Limulus (Limulus amebocyte lysate) LTA Ácido lipoteicoico (lipoteichoic acid) LPS Lipopolisacárido (lipopolysaccharide) MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase) MyD88 Marcador de diferenciación de células mieloides 88 (myeloid differentiation marker 88) NF-IL6 Factor nuclear para la expresión de IL-6 (nuclear factor IL-6) NF-κB Factor nuclear κb (nuclear factor κb) PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos (pathogen-associated molecular pattern) ODNs-CpG Oligodeoxinucleótidos con motivos de secuencias CpG PCR Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) PDE Fosfodiesterasas PGN Peptidoglicano PKA Proteína quinasa A (protein kinase A) rpm Revoluciones por minuto PRRs Receptores de reconocimiento de patrones (pattern-recognition receptors) RT-PCR Transcripción inversa por reacción en cadena de la polimerasa TLR Receptor tipo toll (toll-like receptor) TNFα Factor de necrosis tumoral α (tumor necrosis factor α) U Unidad

6 Introducción I. INTRODUCCIÓN La inflamación es una respuesta protectora localizada, frente a la invasión microbiana o al daño tisular causado por los microorganismos patógenos o por agentes no infecciosos de naturaleza química o mecánica. El control de la magnitud de la respuesta inflamatoria es crucial para el restablecimiento de la homeostasis en el organismo: la inmunosupresión conlleva a una respuesta insuficiente que a la vez puede favorecer el desarrollo de procesos infecciosos, mientras que una respuesta exagerada a insultos como la infección microbiana, puede convertirse en el principal mediador del daño y de la disfunción de diferentes tejidos y órganos, y conducir al shock séptico y a la muerte (Bone, 1996a). La infección por gérmenes Gram-negativos y Gram-positivos induce la activación de los monocitos, los macrófagos y otras células que participan en la respuesta inmune innata. El lipopolisacárido (LPS) o endotoxina de las bacterias Gram-negativas, así como el peptidoglicano (PGN) y el ácido lipoteicoico (LTA) de las bacterias Gram-positivas, constituyen elementos patogénicos de estos organismos (Bone, 1994; Moreillon y Majcherczyk, 2003). La interacción de estas moléculas con las células inmunocompetentes, a través de su unión al receptor CD14 y a los receptores tipo Toll (TLR), induce la producción de citocinas proinflamatorias y otras moléculas efectoras (Schnare et al.,2001). Además de los componentes de la pared celular de las bacterias, la molécula de ácido deoxirribonucleico (ADN) también constituye un elemento inmunogénico por la presencia de repeticiones de secuencias citocina-guanina (CpG) no metiladas (Häcker et al., 2000), y se conoce que la respuesta inmune inducida por el ADN bacteriano es similar al patrón de respuesta inducido por el LPS y el PGN (Häcker et al., 2000). La activación de la respuesta inmune asociada al proceso inflamatorio implica una coordinación eficiente entre diversos componentes humorales y celulares, indispensables para el control eficaz de la propagación del insulto infeccioso (Cohen, 2002). En respuesta a los microorganismos patógenos, los monocitos y macrófagos activados secretan el factor de necrosis tumoral α (TNFα). Esta citocina amplifica la respuesta inflamatoria mediante la activación de otras células que a su vez secretan moléculas con diversas funciones para controlar la infección. Entre ellas se encuentran la interleucina-6 (IL-6) y la IL-8, otros mediadores como los eucosanoides y las especies reactivas del oxígeno. El TNFα también incrementa la expresión de las moléculas de adhesión, que promueven la inflamación y el daño tisular si la respuesta inflamatoria no es controlada adecuadamente (Bone, 1996a). Por otra parte, la liberación de citocinas proinflamatorias ocasiona trastornos de la coagulación, que en caso de una respuesta excesiva o no balanceada provocan un estado procoagulante, con inadecuada perfusión tisular y fallo orgánico (Cohen, 2002). El reconocimiento de los patógenos por los monocitos y macrófagos activa diferentes vías de señalización intracelular. El ADN bacteriano y las bacterias íntegras desencadenan efectos biológicos y eventos intracelulares similares a los eventos de activación celular y transducción de señales inducidos solamente por el PGN, el LTA y el LPS. Luego de su unión a CD14, el LPS induce la translocación hacia el núcleo del factor transcripcional NF-κB (Yamamoto et al., 1997), involucrado en la síntesis de diversas 1

7 Introducción moléculas vinculadas a la respuesta del organismo a situaciones de estrés, infecciones y daño tisular u orgánico (Ghosh et al., 1998). También se conoce que la estimulación a través de CD14 de las células del sistema inmune por Staphylococcus aureus, gérmen Gram-positivo, induce la activación del NF-κB (Yoshimura et al., 1999). Estos elementos, en su conjunto, sugieren que los patrones moleculares de las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, luego de interactuar con los receptores CD14-TLR4 y CD14-TLR2, respectivamente, y con el TLR9 en el caso del ADN bacteriano, pueden inducir vías similares de señalización intracelular (Schnare et al., 2001). El factor transcripcional NF-κB es crucial para la expresión inducida de genes esenciales en la respuesta inmune e inflamatoria desencadenada por los patrones moleculares asociados a bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (Bonizzi y Karin, 2004). Este factor transcripcional activa la producción de TNFα, IL-1, IL-6, e IL-8, entre otros mediadores inflamatorios (Ghosh y Karin, 2002). El NF-κB, generalmente, se encuentra inactivo en el citoplasma unido a la proteína inhibitoria IκB. Luego de recibir el estímulo apropiado, el NF-κB es translocado hacia el núcleo donde se une a elementos de respuesta en la región del promotor de los genes específicos (Ghosh et al., 1998). Diferentes estudios han demostrado también el carácter esencial de moléculas coactivadoras y proteínas quinasas dependientes de AMPc en la activación del NF-κB y en la regulación de la producción de citocinas proinflamatorias en respuesta a la presencia de los patrones moleculares asociados a los patógenos (Gerritsen et al., 1997; Zhong et al., 1998; Ye, 2000). Los fenómenos de regulación de la activación de receptores en la superficie celular y de la señalización intracelular, son objeto de interés para identificar y desarrollar nuevos agentes anti-inflamatorios. Esta estrategia persigue obtener moléculas que controlen la producción de mediadores de la inflamación y restablezcan la homeostasis. En este sentido resulta de interés la evaluación del Extracto Dializable de Leucocitos (EDL) como agente modulador de eventos de activación celular necesarios para el desarrollo de la respuesta inflamatoria. El EDL es una mezcla de moléculas de bajo peso molecular, utilizada como agente terapéutico en el tratamiento de diversas patologías causadas por virus, bacterias, hongos y parásitos, así como de inmunodeficiencias, neoplasias, alergias y desórdenes autoinmunes (Valdés-Sánchez et al., 1991; Fernández et al., 1993; Kirkpatrick, 2000). Se conoce además, la utilización del EDL en el tratamiento del asma bronquial, de la artritis reumatoide juvenil y de la sepsis, enfermedades en las que la respuesta inflamatoria juega un papel fisiopatológico predominante (Jaji et al., 1991; Rovensky et al., 1991). La eficacia terapéutica del EDL en enfermedades bacterianas, como las infecciones respiratorias recurrentes, y en enfermedades inflamatorias, sugiere un efecto modulador de la respuesta inflamatoria por la actividad del EDL. Los mecanismos moleculares responsables de la acción inmunomoduladora del EDL no se conocen en detalle (Kirkpatrick, 2000). Sin embargo, en la literatura científica está documentada la modulación de la producción de TNFα en monocitos mediante la acción del EDL (Matsumoto et al., 1991), y la 2

8 Introducción disminución de la concentración de la proteína C reactiva en pacientes sépticos tratados con el EDL. Este último efecto pudiera resultar del control de la secreción de TNFα (Lokaj et al., 1987). Otra de las actividades biológicas descritas para el EDL, que sugiere un efecto modulador de la respuesta inmune e inflamatoria, es su capacidad de aumentar los niveles de AMPc en los linfocitos (Herlin et al., 1981). Teniendo en cuenta el conocimiento actual acerca de los mecanismos moleculares que regulan la respuesta inflamatoria y las interrogantes que existen sobre los mecanismos de acción del EDL, se formuló la hipótesis que sustenta este trabajo: Es posible modular la respuesta inflamatoria iniciada por patrones moleculares de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas mediante el EDL, a través de la regulación de elementos de señalización de encrucijada como el NFκB y el AMPc. Para la comprobación de esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos: 1. Comprobar si la producción de citocinas proinflamatorias por células implicadas en la respuesta inmune e inflamatoria, expuestas a componentes de la pared celular de las bacterias Gramnegativas y Gram-positivas así como al ADN bacteriano, se regula por la acción del EDL. 2. Determinar si el reconocimiento por receptores de los patrones moleculares de las bacterias Gramnegativas y Gram-positivas se modula mediante el EDL. 3. Determinar si la activación del factor transcripcional NFκB se modifica por la acción del EDL. 4. Determinar si el efecto modulador del EDL sobre las citocinas proinflamatorias se asocia al incremento de los niveles intracelulares de AMP cíclico. Para cumplimentar estos objetivos se trazaron las siguientes tareas: 1. Medición de la producción de TNFα, IL-6 e IL-8 estimulada por los componentes estructurales de la pared celular de bacterias Gram-negativas (LPS) y Gram-positivas (PGN y LTA) en cultivos de leucocitos de sangre periférica humana, en presencia del EDL. 2. Medición de la expresión de IL-6 e IL-8 en células endoteliales activadas por el LPS y TNFα, en presencia del EDL. 3. Medición de la producción de TNFα estimulada por el ADN bacteriano en experimentos ex vivo, en presencia del EDL. 4. Evaluación de la expresión de los receptores TLR4 y TLR2 en sangre total estimulada con el LPS y tratada con el EDL. 5. Evaluación de la actividad de unión a ADN y de la expresión del factor transcripcional NF-κB en la línea celular MT-4 y en sangre total tratadas con el EDL. 6. Determinación de los niveles intracelulares de AMPc en cultivos de monocitos humanos activados por el LPS en presencia del EDL. 3

9 Introducción La presente investigación muestra varios aspectos de novedad científica. Los resultados obtenidos constituyen las primeras evidencias de la regulación diferencial de la expresión de mediadores proinflamatorios inducidos por elementos estructurales de las bacterias Gram-negativas y Grampositivas, en presencia del EDL. Además, se describe la modulación por el EDL, de la respuesta inflamatoria frente al ADN de bacterias. Por otra parte, se identificaron blancos celulares de la actividad reguladora del EDL sobre la producción de citocinas inducida por constituyentes bacterianos, mediante el aislamiento de poblaciones celulares relevantes para la respuesta inmune e inflamatoria. Sin antecedentes en la literatura científica, se describe la inducción de la producción de IL-8 por el EDL. También se documenta la modificación de la expresión de los receptores TLR4 y TLR2 en la superficie celular de monocitos activados y tratados con la preparación del EDL. De igual manera, se demuestra por vez primera en sangre total, la inhibición por el EDL de la actividad de unión del factor transcripcional NF-κB a su secuencia específica de ADN. Se describe, además, que la modulación de la respuesta inflamatoria frente a elementos estructurales de las bacterias, se asocia al incremento de los niveles de AMPc por el tratamiento con el EDL. Estos resultados, en su conjunto, son de gran importancia para las investigaciones sobre la caracterización y definición de los mecanismos moleculares que median la actividad anti-inflamatoria e inmunomoduladora del EDL. Distintas estrategias para el desarrollo de agentes anti-inflamatorios están encaminadas a bloquear mecanismos de señalización, activadores de la transcripción de genes proinflamatorios. La importancia práctica de este trabajo está dada por la demostración de la capacidad de un producto natural de origen humano como es el EDL, de modular diferencialmente la expresión de mediadores de la inflamación, en respuesta a elementos estructurales de las bacterias, a través de la regulación de importantes factores celulares como son el NF-κB y el AMPc. Estos resultados pueden tener un gran impacto social y económico, pues permiten optimizar la terapéutica establecida para el EDL. Permiten, además, instaurar las bases para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos que utilicen la preparación del EDL en enfermedades como las infecciones severas, el shock séptico, la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn y la aterosclerosis. En estas enfermedades es necesario el control de la activación persistente del NF-κB y de la producción de mediadores de la inflamación que contribuyen a la severidad de la fisiopatología. Los resultados que conforman este trabajo de investigación están recogidos en 3 publicaciones y en un manuscrito en fase de revisión, en revistas internacionales arbitradas de reconocido prestigio, y han sido sometidos a la discusión científica en 6 eventos nacionales e internacionales. Varios de los resultados presentados en este documento de tesis han sido premiados como Logro Anual de Investigación del CIGB en 1995 y como Logro Anual de Investigación de la Academia de Ciencias de Cuba en los años 1997 y

10 Revisión Bibliográfica II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA II.1 La regulación de la respuesta inmune frente a la infección Las bacterias Gram-negativas poseen como uno de sus elementos patogénicos principales el lipopolisacárido (LPS) o endotoxina, presente en su pared celular; mientras que en las bacterias Grampositivas los componentes de la pared celular que activan la respuesta inmune son el peptidoglicano (PGN) y el ácido lipoteicoico (LTA) (Opal y Cohen, 1999; Sriskandan y Cohen, 1999). Por otra parte, no sólo los componentes de la pared celular de las bacterias constituyen sus elementos patogénicos, sino también su ADN. Se conoce que la respuesta inmune inducida por el ADN bacteriano es similar al patrón de respuesta inducido por el LPS y el PGN (Häcker et al., 2000). El LPS, el PGN, el LTA y el ADN bacteriano, además de iniciar la producción de diversos mediadores de la inflamación, pueden inducir vasodilatación y extravasación de células fagocíticas, así como la activación de los leucocitos, las células endoteliales y los linfocitos (Parillo, 1993; Horn 1998). Además, los componentes de la pared celular de las bacterias pueden interactuar directamente con moléculas del sistema de la coagulación y conducir a trastornos de la coagulación y fenómenos de hipoperfusión e hipoxia tisular (Karima et al., 1999; van Amersfoort et al., 2003). En el sitio de la infección, además de los monocitos y los macrófagos, los mastocitos y los neutrófilos desencadenan la rápida liberación de mediadores proinflamatorios: citocinas, quimiocinas, especies reactivas del oxígeno, eucosanoides, leucotrienos, el factor regulador de la activación de plaquetas (PAF), los factores de la coagulación, la fibrinolisis y el complemento (Bone, 1991; Wagner y Roth, 1999; Hack et al., 1997; Müller, 2002). Estos mediadores crean una coordinada red de interacciones dirigidas a eliminar la fuente del daño (van der Poll, 2001). En este proceso se activan un grupo de células fagocíticas: monocitos, macrófagos y células polimorfonucleares, las cuales estimulan la agregación intravascular y la expresión de moléculas de adhesión por el endotelio vascular, con la consiguiente producción de interleucina-1 (IL-1), IL-6, IL-8, IL-12 y agentes vasoactivos (Meer et al., 1999; Christie y Henderson, 2002). Estas células fagocíticas activadas expresan los receptores CD14, CD11/CD18, receptores para Fc y del complemento, por lo que son capaces de reconocer y fagocitar los patógenos microbianos. Los monocitos y macrófagos fagocíticos pueden producir una gran variedad de agentes microbicidas como la lisozima, la proteína incrementadora de la permeabilidad bactericida (BPI), otras enzimas y radicales libres de oxígeno (Hiemstra et al., 1993; Ried et al., 1996; Elsbach y Weiss, 1998). Los mediadores de la inflamación secretados por las diferentes poblaciones celulares también reclutan y activan a las células B y T. Los linfocitos T secretan IL-12, Interferón γ (IFNγ), el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) mediadores involucrados en la proliferación y activación de las células mononucleares (van Amersfoort et al., 2003). Se conoce que una respuesta inflamatoria exagerada puede convertirse en el principal mediador del daño y de la disfunción de diferentes tejidos y órganos (Bone, 1996a). Para evitar los efectos nocivos de 5

11 Revisión Bibliográfica los mediadores proinflamatorios, el organismo genera de inmediato una respuesta anti-inflamatoria. En esta reacción compensadora participan las citocinas IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, el IFNγ, los receptores solubles del factor de necrosis tumoral α (TNFα), el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1AR), el factor de crecimiento transformante β (TGFβ), y los factores de activación de las cascadas de la coagulación, la fibrinolisis y el complemento (Bone, 1996b; Tetta et al., 1997). Con el propósito de resolver la inflamación local excesiva y restablecer la homeostasis, estos factores reguladores suprimen la activación de los macrófagos, los neutrófilos y los leucocitos (Volk et al., 1996; Volk et al., 2001). En este proceso de reparación, el TNFα activa los linfocitos para secretar IFNγ, el cual suprime la liberación de quimiocinas por los macrófagos (Biesma et al., 2001). Por otra parte, la producción de TGFβ por los macrófagos promueve la reparación tisular. De esta forma, los mediadores TNFα, IFNγ, TGFβ y prostaglandina E2 (PGE2) ejercen un efecto proinflamatorio o anti-inflamatorio en función del tiempo y del contexto celular durante el proceso inflamatorio (Nathan, 2002). En determinadas condiciones resulta imposible restablecer la homeostasis. El desbalance resultante permite que los mediadores de la inflamación alcancen la circulación sistémica. Si predominan los niveles sistémicos de mediadores anti-inflamatorios, se instaura la supresión inmune o anergia, la cual aumenta la susceptibilidad a las infecciones secundarias (Volk et al., 1996). Por el contrario, si los niveles sistémicos de los mediadores proinflamatorios son elevados, aparecen los signos de sepsis, shock o disfunción orgánica (Bone, 1996a; Mammen, 1998; van Gorp et al., 1999). En particular, los gérmenes Gram-positivos y Gram-negativos son igualmente frecuentes como agentes causales de la sepsis, una condición clínica severa caracterizada por la desestabilización de la homeostasis de varios sistemas y órganos, cuya tasa de mortalidad se ha incrementado enormemente (Bone, 1991; Geerdes et al., 1992; Bates et al., 1995;). II.2 La arquitectura de la pared celular de las bacterias El LPS y el LTA son las estructuras principales de la porción externa de la pared celular de las bacterias y son esenciales para la estabilidad, el crecimiento y la viabilidad celular (Fischer, 1994). Estas moléculas están insertadas normalmente en una gruesa cápsula de polisacáridos por lo que no se encuentran expuestas al medio exterior (Roberts, 1996). Por otro lado, el PGN rodea la membrana citoplasmática de las bacterias y garantiza la forma estructural de estos organismos. El LPS puede asociarse firmemente a otras moléculas como los glicerolfosfolípidos y las proteínas de la capa interna de la membrana de las bacterias (Lugtenberg y van Alphen, 1983). La estructura del LPS no es tóxica cuando se encuentra formando parte de la membrana externa de las bacterias. Sin embargo, durante los eventos de multiplicación celular, muerte celular o la acción de elementos endógenos como proteínas bactericidas, el LPS es liberado de la membrana y su fracción tóxica, denominada lípido A, desencadena la respuesta inflamatoria (Hellman et al., 2000). 6

12 Revisión Bibliográfica II.2.1 La estructura del lipopolisacárido La molécula LPS o endotoxina bacteriana está constutuída por el lípido A, los núcleos interno y externo, y el antígeno O (Figura 1). Estos cuatro componentes fundamentales forman un dominio hidrofóbico compuesto por la porción lipídica llamada lípido A; y un segundo dominio hidrofílico correspondiente a la región polisacarídica (Rietschel et al., 1994). El LPS es único para cada especie bacteriana y éstas se distinguen por las variaciones limitadas que residen en la porción del lípido A: (i) el patrón de acilación; (ii) la composición de ácidos grasos; (iii) la presencia de 4-amino-deoxi-L-arabinosa y/o fosfoetanolamina unida a los grupos fosfato en los disacáridos formados por unidades de glucosamina y (d) el número de ácidos grasos. La región del lípido A es la responsable de la toxicidad del LPS y de ella depende la inducción de la respuesta biológica frente a la endotoxina (Müller-Loennies et al., 1998; Seydel, 2000). Los residuos acilo del lípido A le confieren a los agregados de LPS la capacidad de formar diversos tipos de estructuras micelares. La capacidad de los diferentes serotipos de LPS de ejercer su actividad endotóxica está relacionada con su estructura micelar y su fluidez (Brandenburg et al., 1996; Schromm et al., 1998). El núcleo interno del LPS está constituído por el lípido A unido a un oligosacárido único de las bacterias denominado ácido 2-ceto-3-deoxioctulosónico (KDO). Al azúcar terminal del núcleo externo de la molécula de LPS se encuentran enlazadas las cadenas O-específicas (antígeno O), constituídas por unidades de oligosacáridos repetidas y altamente inmunogénicas (van Amersfoort et al., 2003). Existe una gran variabilidad en la composición y longitud del antígeno O, única para cada especie de bacteria Gram-negativa. Las cepas bacterianas que poseen el antígeno O por su apariencia lisa se denominan smooth LPS, a diferencia de las cepas cuyo LPS carece de este polisacárido y son rugosas, que se denominan rough LPS (Kato et al., 2000). LPS Antígeno O Núcleo interno y externo (región polisacarídica) Lípido A membrana externa peptidoglicano membrana interna Bacterias Gram-negativas Figura 1. Representación esquemática de la estructura del LPS. La figura fue tomada de Miyake (2004). 7

13 Revisión Bibliográfica II.2.2 La estructura del ácido lipoteicoico El LTA es el componente estructural de la membrana celular externa de las bacterias Gram-positivas y puede considerarse la contraparte del LPS. La arquitectura de la pared celular de estas bacterias difiere notablemente de las bacterias Gram-negativas, pues sólo consta de una membrana celular en la cual se inserta el LTA y el PGN. El LTA posee una estructura lipídica de un residuo hexapiranósido de diacilglicerol enlazado a unidades repetidas de fosfatos de poliglicerol altamente cargadas (Figura 2). Entre las especies de bacterias Gram-positivas existen diferencias marcadas en relación con la longitud de las cadenas aciladas y la composición oligosacarídica de la porción del fosfato de glicerol (Fischer et al., 1990; Fischer, 1993). El LTA, al igual que el LPS, contiene en su estructura regiones lipofílicas e hidrofílicas, por lo que ambas estructuras forman agregados en solución. Las preparaciones de LTA purificado forman micelas simples, compuestas por alrededor de 150 moléculas de LTA. Debido a su estructura, el LTA no tiene la capacidad de conformar membranas, por lo que se inserta en membranas constutuídas por otros lípidos como diglucosildiacilglicerol, fosfatidilglicerol, diacilglicerol y lisilfosfatidilglicerol (Fischer, 1994). Unidades repetidas Figura 2. Estructura de la molécula del LTA. La figura fue tomada de Van Amersfoort et al. (2003). II.2.3 La estructura del peptidoglicano La molécula de PGN es un componente esencial de la pared celular de prácticamente todas las bacterias y no está presente en las células eucariotas. Esta estructura es un polímero formado por residuos de N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina (MurNAc-GlcNAc), unidos mediante un enlace glicosídico β(1-4) y enlazados por péptidos compuestos por L- y D- aminoácidos (Figura 3) (Schleifer y Kandler, 1972; Doyle y Dziarski, 2001). Las cadenas de glicano son muy similares en todas las especies bacterianas, normalmente se encuentran N-acetiladas, aunque en ocasiones son O-acetiladas. EL PGN se localiza a lo largo de toda la membrana citoplasmática de la bacteria garantizando su forma y la resistencia a la presión osmótica de la célula. En las bacterias Gram-positivas el PGN constituye aproximadamente la mitad de la masa de la pared celular, a la cual se unen covalentemente polisacáridos y proteínas para conferirle su consistencia. En el caso de las bacterias Gram-negativas, una capa relativamente fina de PGN envuelve a la membrana citoplasmática que se encuentra subyacente a la membrana externa, la cual contiene al LPS (Rosenthal y Dziarski, 1994; Dziarski, 2003). 8

14 Revisión Bibliográfica Figura 3. Estructura de la molécula de PGN. La figura fue tomada de Dziarski (2003). II.3 El reconocimiento de componentes bacterianos por el hospedero Los organismos superiores han desarrollado dos sistemas de defensa que cooperan entre sí en la respuesta contra las infecciones: (i) un sistema innato no clonal que reconoce rápidamente diferentes patrones moleculares conservados en los patógenos y (ii) un sistema adaptativo sustentado en el reordenamiento de los genes y la expansión clonal, una vez detectados antígenos específicos de los patógenos. En los últimos años se profundizó en el conocimiento sobre determinadas moléculas en el hospedero que poseen la capacidad de reconocer patógenos de una manera no clonal y específica (Medzhitov, 2001). Esta respuesta inmune también conduce a la activación de la respuesta inmune adaptativa (Janeway, 1992; Fearon y Locksley, 1996). Los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) son las moléculas blanco de la respuesta inmune innata. Estas moléculas tienen las siguientes características: (i) se expresan usualmente por los microbios y no por las células propias del organismo, (ii) muestran poca variación entre los microorganismos de una clase determinada, y (iii) su expresión es esencial para la supervivencia del microorganismo. Estos elementos permiten que el sistema inmune reconozca determinadas clases de microorganismos, así como sus variaciones genéticas o mutaciones (Ozinsky et al., 2000). Pequeños cambios estructurales en los PAMPs afectan su unión eficiente a los receptores tipo Toll (TLR), cruciales para reconocimiento por el hospedero de distintas clases de microorganismos (Teixeira et al., 2002). Por ejemplo, la molécula de LPS generalmente interactúa con el receptor TLR4. Sin embargo, el LPS de las cepas Porphyromonas gingivalis o Leptospira interrogans es reconocido por el receptor TLR2, pues el lípido A de estas bacterias carece del ácido mirístico unido al disacárido compuesto por N-glucosamina y posee un mayor número de ácidos grasos. Por otra parte, el contenido elevado del aminoácido alanina en la estructura del LTA, le confiere a esta molécula una mayor hidrofobicidad e inmunogenicidad, esencial para la activación del TLR2. También, en las 9

15 Revisión Bibliográfica lipoarabinomanosas de micobacterias, la presencia de una capa de fosfoinositol a diferencia de una capa de manosa, es fundamental para la activación de los macrófagos a través del reconocimiento por el TLR2 (Teixeira et al., 2002). Otro ejemplo constituye el ADN de las bacterias. En el genoma de los vertebrados las repeticiones de secuencias citocina-guanina (CpG) son poco frecuentes y el residuo citocina se encuentra mayormente metilado, no así en las bacterias. Cambios funcionales pequeños como la sustitución de un nucleótido o la metilación de un residuo de citocina dentro del motivo de secuencias CpG, elimina completamente la actividad inmunogénica del ADN bacteriano. Se ha demostrado experimentalmente que la respuesta inmune frente a las bacterias también puede activarse mediante el uso de oligodeoxinucléotidos sintéticos (ODNs) con repeticiones o motivos de secuencias CpG (ODNs-CpG) (Pisetsky,1996). El ADN bacteriano constituye uno de los principales PAMPs reconocidos por el sistema inmune. Golenbock y colaboradores demostraron que el ADN de las bacterias se internaliza hacia compartimentos subcelulares (Latz et al., 2004). Por ello, su receptor específico se transloca desde el retículo endoplasmático hacia el compartimento celular donde se acumulan los ODNs-CpG. El reconocimiento eficiente de los ODNs-CpG de bacterias por el sistema inmune induce principalmente la producción de especies reactivas del oxígeno. Estas moléculas modifican el balance redox de la célula y conducen a la activación de las vías de señalización mediadas por NF-κB, p53, AP-1 y MAPK (Häcker et al., 1998; Takeshita et al., 2004). Además, el ADN de las bacterias tiene un efecto mitogénico sobre la proliferación de las células B (Krieg et al., 1995), y también previene la apoptosis de estas células, fenómeno regulado por la activación de NF-κB (Yi et al., 1998). Por otra parte, los ODNs-CpG han sido utilizados como adyuvantes en vacunas y en la inmunoterapia del cáncer y de enfermedades alérgicas. Recientemente se ha sugerido que los ODNs-CpG pueden fortalecer la resistencia frente a infecciones polimicrobianas y de esta manera incrementar la respuesta inmune innata (Weighardt et al., 2000). II.4 La familia de los receptores tipo Toll Existe una amplia gama de patrones moleculares, que son reconocidos por moléculas que actúan como receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Por ejemplo, la familia de los TLR reconoce estructuras microbianas conservadas y participa directamente en la respuesta de macrófagos y células dendríticas a las infecciones microbianas. Además, se ha descrito en la literatura científica la participación de receptores solubles y de membrana, así como co-receptores intracelulares en la activación de los TLR (McKnight y Gordon, 2000). Los TLR son capaces de discriminar entre varios tipos de PAMPs (Figura 4). Está documentado ampliamente el reconocimiento del LPS de las bacterias Gram-negativas por el TLR4 (Miyake, 2004), mientras que se requiere del TLR9 para la activación celular por los motivos CpG del ADN bacteriano (Klinman y Currie, 2003). Además, el TLR3 y el TLR5 son necesarios para la respuesta antiviral al ácido ribonucleico (ARN) de doble cadena (ARNdc) y la activación por la flagelina de bacterias, respectivamente (Alexopoulou et al., 2001; Hayashi et al., 2001). Por otra parte, el TLR2 es menos 10

16 Revisión Bibliográfica específico, y se activa por diferentes PAMPs como el LTA y el PGN de las bacterias Gram-positivas, las lipoarabinomananosas y los fosfoglicolípidos de micobacterias (Kirschning y Schumann, 2002; Tapping y Tobias, 2003; Krutzik y Modlin, 2004), el zimosan de levaduras (Sato et al., 2003), y los lipopéptidos de micoplasma (Takeuchi et al., 2001). Algunos autores han sugerido que esta diversidad de ligandos para TLR2 se debe a la capacidad de este receptor de formar heterodímeros con TLR1 y TLR6, los cuales definen receptores con distintas especificidades, expandiendo así el rango de patógenos reconocidos por el sistema TLR (Ozinsky et al., 2000; Sandor et al., 2003). Actualmente se ha establecido que el TLR4 es el receptor principal para el LPS lo cual se sustenta por ejemplo, en los experimentos realizados por Hoshino y colaboradores quienes demostraron que ratones deficientes en el gen TLR4 no responden a la infección por el LPS (Hoshino et al., 1999, Faure et al., 2001). Otros reportes indican que los ratones deficientes en el gen que codifica para el TLR2, responden normalmente al insulto infeccioso por el LPS, por lo que este receptor no participa en la activación celular mediada por la endotoxina. Del mismo modo, el análisis en ratones deficientes en TLR2 reveló que este receptor es fundamental para el reconocimiento del LTA y el PGN. En correspondencia, los ratones deficientes en TLR2 son susceptibles a las infecciones por Staphylococcus aureus (Takeuchi et al., 1999; Takeuchi et al., 2000). zimosan ácido lipoteicoico peptidoglicano lipoproteínas flagelina Compuestos anti-virales CpG ADN LPS ARNdc Figura 4. Reconocimiento de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) por los TLRs. La figura fue tomada de Takeda y Akira (2004). II.5 Otras moléculas involucradas en el reconocimiento de componentes estructurales de las bacterias La molécula CD14 es el marcador más descrito en los monocitos y los macrófagos. Esta molécula es una glicoproteina de 55 kda que se encuentra en la superficie de las células mieloides, anclada a la membrana a través de un enlace glicosil-fosfatidilinositol (Gegner et al., 1995). El CD14 conjuntamente con las proteínas LBP, TLR4 y MD-2 funciona como receptor del LPS de bacterias Gram-negativas, pero también es el receptor de otros componentes estructurales de bacterias Gram-positivas; por lo que se considera un prototipo de receptor para moléculas PAMPs. Estudios de comparación y de identificación de residuos importantes para la interacción del CD14 con el LPS y el PGN indican la presencia de una 11

17 Revisión Bibliográfica secuencia común (aminoácidos 51-64) para la unión de ambos PAMPs, así como de secuencias diferentes para la unión al LPS (aminoácidos 7-14 y 33-44) y al PGN (aminoácidos ) respectivamente. Esto le confiere al CD14 capacidad para unir ligandos diferentes. Por otra parte, sólo se unen a este receptor polímeros de PGN de alto peso molecular, los cuales desencadenan la activación celular mediada por CD14. La proteína LBP favorece la unión del LPS al CD14. Teniendo en cuenta que el receptor CD14 no posee dominio transmembrana o intracitoplasmático, por lo que no es capaz de transmitir una señal del exterior de la célula hacia el citoplasma, su función es transferir los componentes microbianos al co-receptor TLR (Stefanova et al., 1991; Lee et al., 1993). Además de la familia de los receptores TLR y de la molécula CD14 se han descrito otras moléculas involucradas en el reconocimiento de componentes estructurales de las bacterias. Recientemente se han identificado proteínas de reconocimiento para el PGN (PGRPs) como una nueva familia de PRRs, la cual se encuentra altamente conservada entre las especies de insectos y de mamíferos. Hasta el presente se han caracterizado 4 moléculas PGRP en humanos, las cuales se expresan diferencialmente en distintos órganos y tejidos y reconocen tanto a la molécula PGN como a las bacterias Gram-positivas (Kang et al., 1998; Mellroth et al., 2003). Por otro lado, se conoce que las proteínas citoplasmáticas Nod1 y Nod2 actúan como reguladoras intracelulares de la activación celular (Inohara et al., 2002). Inicialmente se postuló que estas proteínas eran activadas por el LPS de bacterias Gram-negativas. Sin embargo, estudios recientes indican que Nod1 y Nod2 se activan por fragmentos de PGN como el dipéptido muramilo (Inohara et al., 2003; Girardin et al., 2003a, 2003b). Además, Nod1 y Nod2 no responden a preparaciones de LPS purificado, por lo que la respuesta inicial de estas proteínas reguladoras a endotoxina se asocia con la contaminación de la preparación de LPS con fragmentos de PGN (Dziarski, 2003). La proteína Nod1 se expresa constitutivamente en diferentes tejidos, pero la expresión de Nod2 se restringe a los monocitos. Nod1 y Nod2 activan el factor transcripcional NF-κB, de manera independiente de la vía de señalización por TLR y del marcador de diferenciación de células mieloides (MyD88) (Inohara et al., 2000). Como se comentó anteriormente, la activación celular por el polímero PGN o fragmentos de PGN de alto peso molecular ocurre a través del CD14 y el TLR2, los cuales no responden a la estimulación por el dipéptido muramilo. De esta manera, la activación de Nods por fragmentos de moléculas de bajo peso molecular de bacterias Gram-positivas constituye un mecanismo alternativo a la activación celular por el LPS o el PGN, mediado por los receptores CD14 y TLR2 (Galelli y Chedid, 1986; Takada y Galanos, 1987). II.6 La señalización intracelular mediada por los receptores tipo Toll Varios grupos de investigadores independientes demostraron que los TLR al reconocer los diferentes antígenos microbianos inducen la activación de células presentadoras de antígenos, especializadas en la activación de las células T y de esta manera participan en la respuesta inmune adaptativa (Medzhitov, 2001; Schnare et al., 2001; Takeda et al., 2003). Aunque algunas vías de señalización son compartidas 12

18 Revisión Bibliográfica por la mayoría de los TLRs, numerosas evidencias indican que existen diferencias entre estas cascadas de señalización, y consecuentemente, en el patrón de expresión de genes (Medzhitov, 2001; Barton y Medzhitov, 2003; Takeda et al., 2003). La región citosólica de todos los TLR contiene un dominio Toll/receptor de Interleucina 1 (TIR). Este dominio TIR controla la dimerización entre los TLRs y las proteínas adaptadoras que contienen dominios TIR. El marcador de diferenciación de células mieloides, MyD88, y la proteína adaptadora que contiene TIR (TIRAP), denominada también Mal (MyD88 tipo adaptador), se asocian a los TLR a través de TIR y reclutan las quinasas asociadas al receptor de IL-1 (IRAK). Las quinasas IRAK-1 e IRAK-4 activan al factor asociado al receptor de TNF (TRAF 6), mientras que IRAK-M actúa como un regulador negativo de la señalización por TLR y contribuye al fenómeno de la tolerancia al LPS, en el que las células continuamente expuestas a la endotoxina se vuelven resistentes a estímulos ulteriores (Kobayashi et al., 2002). Luego de la fosforilación por IRAK, TRAF-6 se une a las proteínas ubiquitinadas Ubc13 y Uev1A y forma un complejo enzimático conjugado a ubiquitina, que posteriormente induce a la quinasa activada por TGF-β (TAK-1). La proteína TAK-1 a su vez, fosforila las quinasas MKK3 y MKK6, las cuales conducen a la estimulación de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p38 y de la quinasa Jun-amino terminal (JNK). Tanto la MAPKp38 como la JNK participan en la activación de factores transcripcionales como la proteína de unión a la secuencia CRE (CREB), ATF-1, ATF-2, c-jun y Elk-1 (Karin et al., 1997; Rolli et al., 1999), los cuales controlan la trascripción de diversos genes para citocinas y mediadores de la inflamación. A la vez, la quinasa TAK-1 regula la activación del complejo de quinasas de IκBα (IKK). Figura 5. Representación esquemática de la vía de señalización por los TLRs. La figura fue tomada del sitio web: 13

19 Revisión Bibliográfica La fosforilación de IKK conduce a la activación de NF-κB, factor transcripcional que regula la expresión de diversos genes como TNFα, IL-1, IL-6, IL-8 y otros mediadores de la respuesta inmune (Abraham, 2000). El esquema que representa la cascada de activación descrita anteriormente, se muestra en la Figura 5. II.7 El factor transcripcional NF-κB La familia del NF-κB conservada filogenéticamente está constutuída por factores reguladores de la transcripción (González-Crespo y Levine, 1994; Ghosh et al., 1998). Además de las bien documentadas implicaciones del NF-κB en la respuesta inmune innata, este factor transcripcional desempeña importantes funciones en el sistema inmune adaptativo. El NF-κB participa en la activación de linfocitos, en el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas; induce la expresión de los genes de citocinas (IL-1, IL-6, IL-8) y receptores de citocinas (IL-2R), de las moléculas de adhesión (ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1), y de las proteínas asociadas a factores transcripcionales (IκBα, c-myc, p53) (Baeuerle y Henkel, 1994; Siebenlist et al., 1994; Gerondakis et al., 1998; Hatada et al., 2000). Numerosas evidencias experimentales indican que la activación descontrolada de los genes regulados por el NF-κB es un factor determinante en la evolución de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes (Yamamoto y Gaynor, 2001a). La familia del NF-κB desempeña también otras funciones celulares que no están confinadas al sistema inmune; por ejemplo, participa en el mecanismo de protección contra la apoptosis y en la progresión del ciclo celular (Ghosh et al., 1998; Foo y Nolan, 1999). Se conocen cinco proteínas que conforman la familia NF-κB en mamíferos: p50/p105, p65/rela, c-rel, RelB, y p52/p100; las cuales poseen una región aminoacídica central conservada conocida como dominio homólogo Rel. Este dominio participa en la unión a ADN, en la interacción con las proteínas inhibidoras del NF-κB (IκB) y en los eventos de dimerización (Duckett et al., 1993; Ghosh et al., 1998). Aunque se han descrito varios dímeros del NF-κB, la forma clásica o más frecuente es el heterodímero p65/rela con la subunidad p50. La activación del NF-κB por los PAMPs involucra una serie de eventos que culminan en la disociación del complejo NF-κB/IκB y la translocación del NF-κB hacia el núcleo. Las proteínas IκBα, IκBβ e IκBε se unen a los diferentes miembros de NF-κB enmascarando su señal de translocación nuclear, y de esta manera causan su retención en el citoplasma y previenen la transcripción génica en el núcleo (Malek et al., 1998). Las señales de activación que provocan la degradación de la familia de proteínas IκB, se inician con la fosforilación de los residuos de serinas en las posiciones 32 y 36, y la consiguiente poliubiquitinación de la proteína fosforilada en los residuos de lisina 21 y 22. Estas modificaciones facilitan la proteolisis de IκB por el proteasoma S26 (Magnani et al., 2000). Por otra parte, la síntesis de las proteínas IκB que a su vez son reguladas por NF-κB, es importante para silenciar la señalización mediada por este factor transcripcional (Krappmann et al., 1996). 14

20 Revisión Bibliográfica Karin y colaboradores así como Zandi y colaboradores, identificaron a las proteínas del complejo IKK como proteínas quinasas responsables de la fosforilación de las proteínas IκB (Zandi et al., 1998; Karin, 1999). El descubrimiento de este complejo enzimático ha sido un paso de avance para dilucidar la regulación de la vía de señalización mediada por el NF-κB. El complejo IKK está conformado por las subunidades catalíticas IKKα e IKKβ y la subunidad reguladora IKKγ, también denominada modulador esencial del NF-κB (NEMO) (May et al., 2000). Los experimentos de mutagénesis sitio-específica realizados por Takeda y colaboradores y Tanaka y colaboradores, demostraron la heterogeneidad funcional de las subunidades catalíticas IKKα e IKKβ. Se requiere IKKβ, y no IKKα, para la activación de IKK, y por ende del NF-κB, por estímulos proinflamatorios como TNFα y el LPS (Takeda et al., 1999; Tanaka et al., 1999). Mientras que IKKα es esencial para la activación del complejo IKK por una serie de estímulos que no afectan la subunidad IKKβ (Ghosh y Karin, 2002). De igual manera, se plantea que IKKγ tiene un papel importante en la señalización por IKK, pues esta subunidad puede interactuar con diferentes activadores o proteínas de unión al complejo enzimático (Karin y Ben-Neriah, 2000). Recientemente se han identificado a la proteína de shock térmico (Hsp 90), la quinasa inductora de NFκB (NIK) y la proteína Cdc37 como componentes adicionales de este complejo de quinasas de talla aproximada 700 kda responsable de la fosforilación de IκB (DiDonato et al., 1997; Ghosh et al., 1998). Aún no se conoce en detalle, cómo determinadas vías de señalización activan el complejo IKK. Diferentes estudios indican que la estimulación de la respuesta celular por TNFα resulta en el reclutamiento de IKK hacia el complejo de señalización por el receptor de TNFα tipo 1 (TNFR1) (Devin et al., 2000; Zhang et al., 2000a). Las proteínas TRAF2 y TRAF5 reclutan a IKK hacia TNFR1, mientras que la proteína quinasa RIP1 interactúa con IKK y es responsable de su activación (Devin et al., 2000; Ghosh y Karin 2002). Otra proteína quinasa que actúa como molécula adaptadora en la activación de IKK es la proteína quinasa del retinoblastoma (PKR), necesaria además, para la activación del NF-κB mediada por LPS (Goh et al., 2000). La quinasa PKR y las quinasas RIP1 e IRAK1, activadas por la vía de señalización de TLR4, presumiblemente activan el complejo IKK por la interacción directa proteínaproteína con IKKγ (Bonnet et al., 2000). La respuesta celular a estímulos proinflamatorios como TNFα, IL-1 y LPS induce la cascada de activación clásica mediada por IKKβ, que conduce a la translociación nuclear del heterodímero p50/p65 (Tanaka et al., 1999). Por su parte, IKKα interviene en la activación del heterodímero p52/relb mediada por NIK, vía alternativa implicada en la respuesta de células B (Kaisho et al., 2001; Ghosh y Karin, 2002). II.8 La cascada de señalización mediada por el monofosfato de adenosina 3,5 cíclico El acoplamiento del complejo ligando-receptor a la proteína celular de unión al nucleótido guanina (proteína G), activa la enzima adenilato ciclasa (AC), lo cual conduce a la producción de monofosfato de adenosina 3,5 cíclico (AMPc) a partir de la defosforilación de adenosina trifosfato (ATP) (Figura 6). Se conoce que la expresión de genes implicados en la respuesta inmune, así como el metabolismo celular, 15