Para qué romper células?

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2 Para qué romper células? Para obtener productos que se encuentran en el interior de las células. La técnica de RC seleccionada determina el tamaño de los desechos y la influencia que tendrán en las operaciones que se utilicen para su separación.

3 Ejemplos de productos intracelulares Ácidos nucleicos Enzimas Tanasa Invertasa Proteasas DNA polimerasa Pigmentos B- ficoeritrina (BPE), colorante rosa Polímeros intracelulares AnBbióBcos

4 proteínas intracelulares Separación de células Rompimiento celular Caldo de fermentación Con células sobrenadante Sin células Células inmovilizadas o Células retenidas Separación, tratamiento de cuerpos de inclusión Concentración Purificación alta resolución refinamiento Refinamiento

5 La recuperación óptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las células.

6 Paredes microbianas:

7 MECANISMOS DE RUPTURA CELULAR La selección de una técnica depende de las caracterísbcas del producto: u Resistencia a: Medios alcalinos Solventes Detergentes Enzimas Temperatura Esfuerzo de corte La técnica ublizada determinará el tamaño de los desechos que se producirán

8 Los métodos de ruptura celular en la industria pueden ser divididos en: Métodos químicos Métodos Qsicos Métodos biológicos

9 ROMPIMIENTO CELULAR RUPTURA DE CÉLULAS DE MICROORGANISMOS Métodos Físicos Métodos Químicos Métodos Biológicos Ultrasonido Método Líquido Prensas Gaulin/ Manton Prensa de French Molinos Molino Dyno Molino coloidal Liofilización Tratamiento con ácidos Detergentes Enzimas que digieren la pared celular Fagos Método Sólido Congelación, descongelación Molino de bolas Prensas Prensa X Prensa Hughes Extracción con acetona/tolueno Cambio en la presión osmórca Agentes que inhiben la pared celular

10 Métodos químicos: Choque osmóbco Permeabilización Disolución lipídica (tolueno 10% de la biomasa) DigesBón enzimábca (enzimas que atacan la pared celular) Tratamiento alcalino Detergentes Liofilización

11 Los métodos no- mecánicos son fáciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta con adicionar 10 veces más reacbvo químico o enzimábco

12 Rompimiento celular por métodos químicos. TÉCNICAS Solubilización Choque osmótico PRINCIPIO Detergentes solubilizan la membrana Ruptura osmótica de la membrana ESTRÉS EN EL PRODUCTO Suave Suave COSTO Moderado/ Caro Barato EJEMPLO Ruptura de glóbulos rojos Disolución lipídica Digestión enzimática Tratamiento alcalino Permeabilización enzimatica Solventes orgánicos actúan sobre la pared celular desestabilizándola Rompimiento por la digestión de la pared celular La saponificación de los lípidos solubiliza la membrana Permeabilizan la membrana ocasionando la ruptura de la célula Moderado Suave Fuerte Suave Barato Caro Barato Caro Rompimiento de levaduras con tolueno Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima

13 Métodos mecánicos: Métodos a pequeña escala: Ultrasonificación Molido con abrasivos Homogeneizadores Métodos a gran escala: Homogeneizadores a alta presión Molinos de perlas

14 Rompimiento celular por métodos mecánicos TÉCNICAS PRINCIPIO ESTRÉS SOBRE EL PRODUCTO COSTO EJEMPLO Homogeneizador de cuchillos Las células son rotas en un mezclador Moderado Moderado Rompimiento de tejidos y células animales. Homogeneizador alta presión Las células son forzadas a pasar a través de un pequeño orificio, produciendo su ruptura por el esfuerzo de corte Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de células. Molienda Las células son rotas por medio de una molienda con abrasivos Moderado Barato Molino de perlas Las células son trituradas con perlas de acero o vidrio Fuerte Barato Rompimiento a gran escala para suspensiones de células y células de plantas Ultrasonificación Las células son quebradas en una cavidad ultrasónica Fuerte Caro Rompimiento de suspensiones de células a lo menos en pequeña escala

15 Métodos biológicos: Enzimas Fagos Agentes inhibidores de pared celular Estos métodos no son muy empleados debido a que son muy costosos.

16 Animales Micelio Bacterias Gram + Bacterias Gram Levaduras Esporas

17 Dificultad para rompimiento de diferentes Bpos de células. 7 = Fácil de romper 1 = Difícil de romper

18 Que hay que tomar en cuenta para la selección de un método de ruptura celular Naturaleza del producto intracelular Escala de la operación Velocidad Estabilidad del producto Pureza del producto Costo del método

19 CHOQUE OSMÓTICO Las células se colocan en un volumen de agua frecuentemente 2 veces mayor que el volumen de células. Las células se expanden, por un simple flujo osmóbco que se produce debido a que las células conbenen solutos, ocasionando que el agua entre al interior. Debido a esta expansión puede conducir a su lisis o rompimiento.

20 El uso de este método depende de la resistencia de las células. Ley de van`t Hoff

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23 Toluenización: Ruptura a altas concentraciones,, se trabaja a bajas temperaturas, células inacbvas metabólicamente. Permeabilización a bajas concentraciones, células metabólicamente acbvas comienzan a destruirse.

24 DigesRón enzimárca Consiste en el empleo de enzimas que atacan a la pared celular hidrolizándola. Permeabilizando la membrana para liberar compuestos intracelulares al medio o rompiendo completamente la célula.

25 DigesRón enzimárca A ph< 5 las células no se rompen aún cuando la pared haya sido destruida por digesbón. Los costos son muy altos No hay recuperación de las enzimas empleadas Mayor suscepbbilidad a Gram + Ejemplos Gram(+): lisozima Gram(- ): lisozima + AEDT Levaduras: β1,3- glucanasa, β1,6- glucanasa manasa, quibnasa

26 Permeabilización con detergentes Los detergentes Benen una zona hidroqlica y otra hidrofóbica, por esta razón pueden interactuar tanto con el agua como con los lípidos. Su habilidad se basa en la solubilización de los lípidos de la pared celular Los detergentes más ublizados son de tres Bpos: Detergente aniónico Detergente cabónico Detergente no- iónico

27 Ejemplos Detergentes aniónicos : Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Sulfonato de Sodio Tauroclorato de Sodio Colato de sodio Ejemplos Detergentes cabónicos: Bromuro de CaBltrimeBl Amonio (CTAB) Ejemplos Detergente no- iónicos Triton X- 100 Tween Spam

28 Permeabilización con detergentes A bajas concentraciones no se produce degradación de lípidos. A alta concentración se produce una degradación que resulta lineal a la concentración de detergente, junto a esta variable también se altera la tensión superficial de la solución.

29 Permeabilización con detergentes Procedimiento: 1. Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de células. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de células. 2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La suspensión resultante se centrifuga para remover los fragmentos de células y se pasa por etapas de extracción para aislar el producto.

30 Permeabilización con detergentes Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, ph ; min) Ventajas: Simple y barato Aplicación a gran escala Desventajas: Tratamiento fuerte, los lípidos son converbdos en detergentes No selecbvo Aplica únicamente si las enzimas a aislar son estables a ph alcalino

31 Ultrasonificación Frecuencias >20 KHz produciendo vibraciones que provocan el fenómeno de cavitación. Se producen zonas de baja presión en el líquido El líquido se transforma en gas formándose pequeñas burbujas Las burbujas colapsan debido a los cambios de presión. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el líquido que rompen las células.

32 Ultrasonificación Desventajas: Producción de radicales libres Destrucción del producto por las ondas Destrucción del producto por la temperatura Elevados requerimientos de energía Altos costos

33 Homogeneización Homogeneizadores: el material biológico se somete a una fuerte presión hidrostábca (500 atm) y la presión se libera bruscamente que el líquido salga por una válvula.

34 La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la rupturas. Estos se pueden obtener por: 1. Émbolos 2. Cuchillas 3. Pistones

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37 Congelación- descongelación Formar y deshacer los cristales de hielo Ventajas: Muy simple de realizar Se realiza a bajas temperaturas Desventajas: Tiempos largos Algunos microorganismos son resistentes Sensibilidad de las enzimas a congelación/ descongelación

38 Molino de perlas Operación intermitente: El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinébca de primer orden. El balance de masa liberada puede ser expresado mediante la ecuación:

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41 Ejemplo 1: Obtención y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa, a parbr de extractos celulares de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM5. Las bacterias con lisozima se colocaron en un baño maría durante 12 horas a 40 C. Posteriormente, se completó el rompimiento celular por sonificación en un equipo Branson Sonifer (VWR Company), con la siguientes indicaciones: Output control: 7, Duty cycle: 60, Time: 10 minutos

42 Posteriormente se solubilizó con el detergente Tritón X- 100 debido a que la enzima que se desea obtener estaba ligada a la membrana. La metodología ublizada consisbó en agregar a cada 600mL de extracto celular después de la sonificacion, 200mL de Tritón X- 100; se dejó homogenizar la solución. Se dejó actuar por una hora y se centrifugó a rpm durante 45 min en una centrifuga refrigerada. Se tomó el sobrenadante y el detergente remanente fue rebrado mediante diálisis.

43 Ejemplo 2: Ruptura celular de Saccharomyces cerevisiae por medio de métodos químicos. Se basan en el uso de solventes orgánicos y detergentes para acelerar los procesos de autólisis de S. cerevisiae. El sistema se basa en la autólisis celular por medio de una plasmólisis originada por tratamiento de las células con solventes orgánicos.

44 Para seguir la liberación del contenido intracelular miden la canbdad de la proteasa vacuolar carboxipepbdasa. Y liberada por la célula, requiriendo el proceso un fino control del ph alrededor de 8. Entre los solventes orgánicos destacan los alcoholes de cadena entre 6 y 9 carbonos de longitud.

45 Los detergentes con mejores resultados son el Tritón X- 100 y N- laurilsarcosina. Ventajas a nivel industrial: No requiere aparatos especiales Restos celulares fáciles de separar por centrifuga Costo de los productos inductores bajo. Desventajas: Dificultad para eliminar compuestos químicos Riesgo de desnaturalización Largos Bempos para lograr la autólisis 20-30h. Aumentan el riesgo de las proteínas de interés por la proteasas presentes.

46 Ejemplo 3: Ruptura celular de S. cerevisiae por medio de enzimas líbcos combinado con el uso de estabilizadores osmóbcos. Con estos tratamientos se ha logrado la liberación selecbva de enzimas y proteínas localizados en diferentes comparbmientos celulares. El complejo empleado procede de Oerskowia xanthinoly;ca. Se trata de una mezcla de enzimas líbcos con acbvidades en beta- 1,3- gluconasa, proteasa, beta- 1,6- glucanasa, mananasa y quibnasa.

47 Todas actúan en forma sinérgica en la degradación de la pared celular, la acbvidad mananasa que degrada la capa externa de manano de la pared y la beta- 1,3- glucanasa para la degradación de la capa interna de glucano. La produccion de estas enzimas obtenida en un fermentados de 2000 litros es suficiente para lisar un fermentador de 100,000 litros de S. cerevisiae.

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