INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA CROMATOGRAFÍA DE GASES

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1 1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA METODOS EN BIOTECNOLOGIA CROMATOGRAFÍA DE GASES Biol. Laura Patricia Olguín Pérez Biol. Héctor M. Rodríguez Magadán 8 de Junio de 2004

2 2 CONTENIDO Antecedentes/Historia 1 Mecanismos de la cromatografía 2 Fundamentos teóricos 2 Nomenclatura 5 Fase móvil 6 Puerto de inyección 6 Horno de la columna 7 Fase estacionaria 8 Soporte 9 Columna cromatográfica 10 Detectores 15 Métodos 20 Análisis cualitativo 20 Métodos de coincidencia 21 Aplicaciones 31 Comida, saborizantes y fragancias 31 Químicos y petróleo 34 Ambientales 35 Médicas y biológicas 35 Industria 37 Otras aplicaciones 38 Aplicaciones prácticas 38 Cromatografía de gases como método principal 40 Innovaciones 41 Páginas web 45 Bibliografía 45

3 1 Antecedentes/Historia La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras la otra se mueve en una dirección definida. Los componentes son separados por sus diferentes tazas de migración (IUPAC). La cromatografía puede ser clasificada por su utilidad y en base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos. De acuerdo a su utilidad la cromatografía se clasifica en: analítica, utilizada para determinar los químicos presentes en una mezcla y en que concentración; y preparativa, utilizada para purificar grandes cantidades de químicos. La primera técnica cromatográfica fue ideada por el botánico ruso Mikhail Tswett en 1906, quien utilizó alúmina para separar los pigmentos coloreados de las hojas de las plantas. Tswett en su experimento original, metió dentro de un tubo de vidrio un fino polvo (sacarosa) para producir una columna de una altura deseada. Posteriormente, extrajo los pigmentos de hojas y los colocó en un solvente (éter de petróleo) y agregó un poco de la solución dentro de la columna. Cuando toda la solución había pasado a través de la columna se formó una estrecha zona inicial bajo la capa inicial del adsorbente. Después agregó más solvente y aplicó presión en la parte de arriba de la columna. Mientras el solvente iba pasando a través de la columna, los pigmentos se iban separando individualmente (Fig. 1). La clave del éxito de la columna de Tswett, fue la aplicación de la mezcla dentro de la columna en una zona inicial estrecha y la posterior aplicación del solvente fresco. Fig. 1. Columna cromatográfica de Tsweet 3. Y = amarillo, G = verde

4 2 En 1931, fue redescubierta por Richard Kuhn al utilizarla para el análisis de polienos. Los primeros en utilizar un gas como fase móvil fueron A. T. James y A. J. Martin en 1952, para separar ácidos grasos cortos. Posteriormente Dabrio, en 1971, la utilizó para separar metilaminas, aminas alifáticas y homólogos de piridina. Mecanismos de la cromatografía El movimiento de las substancias durante la cromatografía es el resultado de dos fuerzas oponibles, la fuerza de manejo de la fase móvil y la fuerza resistente o acción de retardo del sorbente. La fuerza de manejo mueve las substancias del origen de la columna en dirección del flujo de la fase móvil. La acción de retardo impide el movimiento de las substancias arrastrándolas del flujo y adhiriéndolas al adsorbente. Las moléculas se encuentran alternando entre estar pegadas al adsorbente o despegadas en el flujo, esto da como consecuencia que pese a que el flujo es constante, solo una fracción de las moléculas se están moviendo. Las substancias que se mueven más lentamente es porque están siendo unidas más fuertemente a la fase estacionaria, mientras que aquellas que se mueven más rápidamente es por que son menos solubles o de poca afinidad. La habilidad de tener una migración diferencial entre los componentes de la mezcla es el resultado de la selectividad del sistema cromatográfico. El flujo de la fase móvil no es selectivo en el sentido de que no afecta el movimiento de los solutos. Como parte del sistema cromatográfico, sin embargo, la fase móvil debe ser un poco selectiva para ayudar a la absorción de los solutos con la fase estacionaria. La fase estacionaria también juega un papel importante dentro del cromatograma debido a su acción resistiva como una fuerza selectiva de la velocidad de flujo de los solutos. Fundamentos teóricos Se han propuesto muchas teorías con complejos modelos matemáticos para explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas. Las más estudiadas son: Teoría de las placas teóricas (Martin y Synge) Teoría cinética (Van Deenter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer) Teoría desarrollada para columnas capilares (Golay) La principal es la teoría de las placas teóricas (theoretical plates theory), la cual plantea que una columna cromatográfica está constituída por una serie de placas contenidas en la fase estacionaria. Supone como constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa; que el volumen de fase móvil entre placas es constante; que las dos fases están en equilibrio en cada placa, y que el valor de coeficiente de distribución es constante e independiente de la concentración del soluto. Desventaja: además de que se basa en muchas suposiciones, la principal desventaja es la falta de conexión entre la eficiencia de la columna y las propiedades fisicoquímicas de la partícula.

5 3 La ecuación de esta teoría 1 : N= número de placas teóricas, adimensional t r = tiempo de retención de un compuesto, minutos w= ancho del pico a media altura, minutos N=16(t r /w) 2 La teoría cinética considera el comportamiento en un proceso cromatográfico en función de los factores cinéticos que intervienen: Variaciones en las velocidades de flujo, debido a las diferentes rutas que puede tomar el analito durante su migración a través del empaque. Difusión axial o longitudinal del soluto en la fase móvil. Resistencia a la transferencia de masas entre la fase móvil y la fase estacionaria. La ecuación de Van Deemter 1 : HETP o H=A+B/u+Cu HETP o h= altura equivalente a una placa teórica, milímetros. u= L/ t r aire promedio de la velocidad lineal, cm/seg A= 2λd p difusión aparente B= 2γD m coeficiente del término debido a la difusión molecular C= (8/π)(k /[1+ k ] 2 )(d f /D s ) coeficiente del término debido a la resistencia a la transferencia de masas En la teoría para las columnas capilares se considera que la difusión aparente no contribuye de manera apreciable al ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas. El coeficiente relacionado con la difusión molecular tiene un valor de uno debido a que la distancia que recorre la partícula es igual a la longitud de la columna. El término relacionado con la transferencia de masas viene dado en función del diámetro de la columna, pues en este tipo de columna es más importante que el tamaño de partícula de relleno. La ecuación de esta teoría es un caso particular de la ecuación de la teoría cinética, en este caso se omite el término A pues su valor es despreciable; se relacionan las magnitudes que caracterizan la geometría del soporte y el término C se presenta de manera distinta pues en este tipo de columna es más importante la fase móvil que el tamaño de partícula.

6 4 Circulación del gas portador La ley de Darcy 1 correlaciona la velocidad lineal de un gas que circula por una columna con el gradiente de presión. u= velocidad lineal en un punto de la columna z=distancia a la entrada de la columna η= viscosidad del gas dp= gradiente de presión de un elemento dz= longitud de columna k=constante de permeabilidad. u= - (k/η) (dp/ dz) Las respectivas integraciones de la ecuación permiten obtener una que relaciona el valor de la presión con la posición de la columna, otra que indica la velocidad media, la compresibilidad o factor de obstrucción Coeficiente de reparto (K) Propiedad termodinámica del sistema soluto-fase estacionaria-fase móvil independiente del proceso cromatográfico. Concentración de soluto en la fase estacionaria frente a concentración de soluto en fase móvil a temperatura constante. Factor de capacidad (k ) Depende de las propiedades termodinámicas del sistema (K) y además es función de las características de la columna en particular. Probabilidad de encontrar una molécula determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil Relación frontal (R f ) La relación frontal y el factor de capacidad son dos maneras de medir el mismo fenómeno. Representa la relación entre las velocidades medias del soluto y la fase móvil en su recorrido por la columna. Tiempo muerto ( t m ) Es el tiempo de retención de una sustancia insoluble en la fase estacionaria (K=0).

7 5 Volumen de retención (V R ) Es el volumen de fase móvil necesario para transportar el soluto de un extremo a otro de la columna. Se denomina volumen de retención neto al volumen verdadero y corregido, el cual se obtiene a partir de la ecuación que involucra además la compresibilidad del gas portador. El volumen de retención específico está delimitado por la temperatura. Retención relativa (r x:p ) Conservan las propiedades del coeficiente de reparto y son fáciles de calcular, su manejo se dificulta al momento de elegir un patrón adecuado. Se utiliza para disminuir el efecto de errores, sobre todo, en el conocimiento del peso de la fase estacionaria en la columna. Resolución Cada sustancia se desplaza a una velocidad característica dada por el valor de su relación frontal en dichas condiciones. Altura equivalente a una placa teórica. Por tratarse de un método donde se separa por elución es mejor referirse a tiempo de elución más que a distancias recorridas. Eficacia Una columna será más eficaz mientras mayor sea el número de placas teóricas que tenga. Para poder hacer comparaciones entre columnas es necesario establecer condiciones similares de trabajo. Nomenclatura Desde el primer cromatógrafo de Tswett hasta los cromatógrafos de ahora siguen utilizando la misma nomenclatura para sus componentes: Un tubo de metal o vidrio se llena con un sólido activo (adsorbente) para formar una columna cromatográfica. La mezcla a separar es aplicada en una zona inicial y es lavada con un solvente, líquido de lavado o revelador. La serie de resultados se denomina cromatograma, y el lavado de la zona inicial para formar el cromatograma es la formación o desarrollo del mismo. Cuando el agente a detectar se trata con un agente químico para formar un color, se dice que la cromatografía está siendo revelada. La combinación del solvente, la mezcla y el adsorbente son llamados sistema cromatográfico. Cada sistema cromatográfico está compuesto por una fase móvil (solvente) y una fase estacionaria (la columna).

8 6 Si los componentes de la mezcla son analizados cuantitativamente, recibe el nombre de evaluación o cuantificación. Si el soluto es separado del adsorbente por lavado antes del análisis, entonces se le llama elución y al agente a ser analizado se le llama eluyente, al líquido que sale de la columna se le nombra efluente. Cuando la fase móvil es líquida, la técnica suele recibir un nombre relacionado con la forma en que se dispone la fase estacionaria (columna, capa fina, papel, etc.). Existen tres formas de desarrollar este proceso: elución, análisis frontal y desplazamiento. Cuando la fase móvil es un gas, solamente se utilizan columnas y el proceso siempre se realiza por elución. La forma más usual de hacer cromatografía de gases es utilizando un líquido como fase estacionaria; recibe entonces el nombre de cromatografía gas-líquido (CGL). También se utilizan absorbentes, dando lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS), pero en mucho menor proporción. La cromatografía de gases es una técnica analítica que puede ser utilizada para separar compuestos orgánicos basada en sus volatilidades. También provee información cualitativa y cuantitativa de los componentes presentes en una mezcla. Los componentes son separados por sus diferencias de partición entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria en la columna, permitiendo que sean separados en tiempo y espacio. Un cromatógrafo de gases consiste de: 1. Fase móvil. 2. Puerto de inyección. 3. Horno de la columna. 4. Columnas 5. Fase estacionaria. 6. Detector. 7. Sistema de registro de datos. Fase móvil (mobile phases) Gaseosa, líquida o fluido supercrítico (potencia disolvente de los fluidos a temperaturas y presiones superiores al punto crítico). Estas fases son generalmente gases inertes como Helio, Argón o Nitrógeno. El gas portador lleva las moléculas del analito a través de la columna, este movimiento es inhibido por la adsorción que presenta el analito tanto en las paredes de la columna cuanto en los materiales empaquetados en la misma. Puerto de inyección (inyection port) Es un dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente del gas portador. Existe cierta variedad de diseños según el tipo de muestra que se trata de analizar. El más común es el inyector de líquidos, que puede utilizarse para sólidos (en disolución) y gases

9 7 (mediante jeringas especiales). El inyector se trata de una cámara situada a la entrada de la columna y calentada independientemente de ésta (a temperatura superior del punto de ebullición del componente más volátil de la muestra, generalmente), que suele tener una membrana de caucho a través de la cual se introduce la muestra con la ayuda de una microjeringa hipodérmica. Inyección de la muestra evaporada e introducirla a la columna a través de un septo de plástico (estable a la temperatura de inyección, debe ser reemplazado periódicamente). Temperatura de inyección debe ser de 10 a 50 mayor a la temperatura de la columna. Jeringas: varios estilos disponibles. Aguja fija, removible. Varios tamaños y ángulos. Volúmenes de la muestra desde 1 µl, líquidos de µl y gases ml. Inyección rápida para introducirla en una sola descarga y no debe haber aire al momento del llenado. Precisión de la inyección +/-1%. Incremento de la precisión al utilizar circuitos (gas sampling loops) y válvulas para introducir cantidades constantes. Equipo no caro y requiere temperatura constante. La técnica de inyección de muestra recomendada para líquidos en cromatografía de gases es el método de flujo del solvente. El solvente puro es introducido a la jeringa seguido de una bolsa de aire, después se coloca la solución muestra, y finalmente otra bolsa de aire. Se lee el volumen de la muestra y posteriormente se inyecta al cromatógrafo. Horno de la columna En el interior se sitúa la columna, donde se debe tener una buena regulación de la temperatura. Dentro del horno la columna se conecta en un extremo al puerto de inyección, y en el otro al detector. La columna debe estar en el centro del horno sin tener contacto con las paredes (Fig. 2). Percha de la columna Columna de capilaridad Fig. 2. Horno con columna capilar.

10 8 Fase estacionaria (stacionary phase) La fase estacionaria es la encargada de separar los componentes de la muestra. Esta puede ser un sólido o un líquido, dispuestos sobre un sólido que actúa como soporte (columna). El sólido de la fase estacionaria puede ser de aluminio, sílica gel, carbón o tierra de diatomeas; y el líquido de la fase estacionaria debe tener una baja viscosidad y una alta y diferencial solubilidad. Cuando la fase estacionaria es un sólido, la interacción que puede tener con la fase móvil se puede clasificar en: Adsorción, intercambio iónico y de filtración sobre geles porosos. Cuando es un líquido, la interacción con la fase móvil recibe el nombre de reparto, esta última es la forma más usual de hacer cromatografía de gases. Para obtener la mejor resolución de dos substancias dentro de la columna, se requiere tener una fase estacionaria donde su retención relativa sea mayor a la unidad. Esto depende del punto de ebullición y el coeficiente de actividad de los solutos en dicha fase. De aquí que en series homólogas el orden de elución sea el de los puntos de ebullición crecientes, independientemente de la fase empleada, salvo en casos especiales. Por otra parte, dos sustancias de punto de ebullición idéntico, pero de estructura química diferente, podrán separarse fácilmente con base en su distinta solubilidad. Para la elección de la fase estacionaria se deben de tener en cuenta las siguientes consideraciones: Los límites de temperatura del líquido elegido, considerando su viscosidad y volatilidad. Un descenso en la temperatura de la columna aumenta el tiempo de retención de los solutos y en ocasiones puede mejorar las separaciones. Pero cuando la viscosidad de la fase estacionaria se hace demasiado alta, o se alcanza el punto de fusión, generalmente la eficacia de la columna baja enormemente. La posibilidad de reacciones irreversibles con la columna. Este fenómeno podría impedir el uso de una fase que para diferentes solutos resultaría excelente. Por ejemplo, los ácidos no pueden analizarse en fases de carácter básico, ni los aldehídos en THEED (tetrahidroxietiletilendiamina), pues reaccionan para formar acetales, que se quedan en la columna. Con frecuencia la reacción no ocurre con la fase misma, sino con impurezas en ella. La fuerza de interacción soluto-solvente que han de influir en los coeficientes de actividad de los componentes de la mezcla. La elección de la fase se hace teniendo en cuenta la polaridad de los solutos a separar y de su tiempo de retención en la fase a medida que su polaridad aumenta. La elección de la fase estacionaria dependerá no solo de la presencia de polaridad dentro de los solutos, sino más bien de una visión de conjunto de la mezcla compleja que se desee separar. Puesto que el grado de separación de dos sustancias depende de sus respectivos coeficientes de reparto en la fase estacionaria, cada mezcla particular debe tener, al menos teóricamente, una fase que efectúe la separación mejor que las demás. Dependiendo del

11 9 tipo de material es la temperatura máxima a la que se puede trabajar. Las fases se pueden clasificar en: No polares: para separar sustancias poco o nada polares. El más utilizado son las gomas de silicona OV-1, OV-101 o SE-30, para trabajar hasta más de 300ºC donde se consiguen eficacias de columna extraordinarias. Con carácter ligeramente polar: utilización general, buena selectividad para mezclas mixtas. Sebacato de dietil (2 etil hexilo), aceite de silicona, gomas de silicona. De polaridad media o alta: no aptos para hidrocarburos no aromáticos. Aceite de Ucon LB-550X, polifenil éter, Carbowax 1 540, succinato de butanodiol. Columnas con fase mixta: para resolución de separaciones parciales con dos o más líquidos. Posibilidad de separar hasta 50 sustancias mezclando dos, tres y cuatro líquidos para formar la columna final. Aunque es más laboriosa y poco práctica la representación gráfica esto ha sido simplificado al utilizar programas computacionales. Soporte (Support) La función básica del soporte sólido es sostener la fase estacionaria. El soporte debe de tener elevada superficie por unidad de volumen, estabilidad térmica, dureza mecánica, inactividad química y baja resistencia al paso de un gas. La mayoría está hecho de tierra de diatomeas (diatomita o Kieselguhr), principalmente se trata de sílice hidratada microamorfa, la calcinación de esta tierra dará lugar a diversos productos según la forma y temperatura de tratamiento. Fundente carbonato sódico, productos blancos utilizados para filtración. Celita, Celatom. Tiene menor actividad superficial residual. El cromosorbo G es utilizado en columnas con poca fase estacionaria y se obtienen mejores eficacias. El cromosorbo A es utilizado en escala preparativa. Sin fundente y a mayor temperatura, productos rosados utilizado para ladrillos refractarios. Sil-O-Cel, Sterchamol, C-22. Son de mayor superficie y mejor resistencia mecánica, pero son los que presentan mayor actividad superficial residual. Todos los soportes porosos tiene cierta actividad residual debida a la presencia de iones metálicos o defectos de superficie, y a los grupos OH de las moléculas. Esta actividad modifica el desarrollo normal del cromatograma, por lo tanto este efecto debe ser disminiudo desactivando el soporte. Una manera es cubrirlos con la misma fase estacionaria, la cua se adsorbe fuertemente en estos puntos y el efecto sobre el soluto es menor. También se puede hacer por lavado ácido

12 10 o básico, aunque el sistema más utilizado es hacer reaccionar los grupos hidroxilo de la superficie del soporte con reactivos adecuados. El más común es la silanización, en el que se hace reaccionar con dimetil diclorosilano, y pueden encontrarse comercialmente con el mismo nombre que el material original (Cromosorbo) o nombres especializados. Aunque para casos extremos pueden presentarse aún fenómenos de adsorción que se eliminan añadiendo una pequeña cantidad de fase estacionaria muy polar (Carbowax). Columna cromatográfica Las columnas están hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de vidrio, dobladas o enrrolladas. Excepto para las de vidrio, las columnas son empacadas mientras se están doblando. Las columnas analíticas tienen una longitud de 1-6 m. de longitud y de 2-4 mm. de diámetro. Según se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que alcance la relación de fases se originan los diferentes tipos de columnas. La separación de la mezcla se realiza dentro de la columna, por lo tanto, es la parte más importante del cromatógrafo. La primera columna utilizada fue una de relleno (James & Martin, 1952), posteriormente fue introducida la columna capilar, siendo así los dos extremos en la gama de columnas utilizadas en la cromatografía de gases. El criterio para la diferenciación de columnas es con base en dos propiedades de éstas: Relación de fases: volumen de fase móvil/volumen de fase estacionaria; V m /V s Permeabilidad: representada por una constante dependiente de las características geométricas de la columna; k Con base en estas dos características se encuentran los siguientes tipos de columnas, en las que V m /V s y k aumetan en orden progresivo 1 : 1. Clásicas de relleno 2. Capilares rellenas 3. Capilares de capa porosa 4. Capilares abiertas La elección de las columnas es lo más crítico, existen dos diferencias fundamentales que deben ser cosideradas para la elección de la columna: la cantidad de muestra que admiten (capacidad de carga) y los valores de los flujos del gas portador. La capacidad de carga se define como la cantidad de muestra que se puede inyectar sin pérdida apreciable de eficacia y está relacionado con la cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la columna.

13 11 Las columnas empaquetadas contienen un soporte sólido inerte con una cubierta delgada de la fase líquida. El soporte sólido es frecuentemente tierra de diatomeas. La fase líquida puede tener una viscosidad baja y una alta solubilidad para la mezcla de componentes. Las columnas de capilaridad originalmente contenían una película del líquido cubriendo la pared interna de la columna de vidrio o metal. Las columnas de capilaridad ahora contienen una capa de revestimiento sólido dentro de ella con poro en el centro. Estas columnas son mejores porque se les puede aplicar una velocidad óptima de flujo más rápida (aprox. de 2-5 ml por min en lugar de 1 ml por min). Debido a este tipo de columnas, los análisis han podido ser más sensibles. La cantidad de muestra que admite una columna capilar sin que sufra sobrecarga es mucho menor que en una columna clásica. La sobrecarga se alcanza cuando la concentración de soluto en la fase estacionaria es tan grande que la isoterma de distribución deja de ser lineal. 1.- Columnas clásicas de relleno Constituídas por un tubo de metal o vidrio con relleno de soporte granular con la superficie recubierta por una película de la fase estacionaria. Longitud 1-10 m Diámetro interno 2-4 mm hasta 5 cm en escala preparativa Tamaño de la partícula de relleno diez veces menor que el diámetro del tubo Capacidad de carga grande Relación de fases pequeña Permeablilidad baja A mayor tamaño de partícula del relleno mayor será su permeabilidad, cuanto más rugosa sea su superficie mayor capacidad de carga se obtendrá. Por esta razón es el único tipo de columna que se usa a escala preparativa. La suspensión del soporte en la disolución de la fase estacionaria debe agitarse mecánicamente y, si es necesario, calentar ligeramente para evaporar la mayor parte del solvente. El tubo de la columna debe estar perfectamente limpio, para rellenarlo se debe introducir un extremo de ésta en el relleno preparado con la ayuda de un embudo, mientras que por el otro extremo se hace vacío con una bomba. Como tapones es conveniente utilizar lana de vidrio o cuarzo y una malla metálica fina (Fig. 3). 2.- Columnas capilares rellenas Se distinguen de las columnas clásicas de relleno por le diámetro interno del tubo, no excede un milímetro. Además, la relación entre los diámetros del tubo y de la partícula de

14 12 relleno es del orden de tres a cinco veces. Esto hace que sea un relleno más irregular y una permeabilidad del orden de diez veces superior. Longitud de m. Diámetro interno de 1 mm. Tamaño de la partícula de relleno de 3 a 5 veces Capacidad de carga pequeña Relación de fases grande Permeablilidad mayor que las clásicas Al ser mayor la permeabilidad pueden construirse columnas más largas (10-50 m). Guichon (1966) y Halasz (1967) han hecho estudios muy detallados de este tipo de columna. Este tipo de columnas no está comercializado, debido a lo difícil de introducir un soporte en un tubo capilar metálico de esa longitud. Por el contrario, es más sencillo cuando se trata de tubos de vidrio. Se rellena un tubo Pyrex con el soporte elegido antes de estirarlo, entonces al capilar resultante contiene ya el soporte en su interior. La fase estacionaria se introduce de manera similar a las columnas capilares abiertas (Fig. 3). 3.- Columnas capilares de capa porosa En este caso el soporte es depositado en la pared interior del tubo, después es recubierto por la fase estacionaria y la parte central del capilar permanece vacía. Longitud de m Diámetro interno de mm Tamaño de la partícula de relleno varía entre el de un soporte clásico y las partículas de carbono producidas por la pirólisis de una sustancia orgánica. Permeablilidad valores máximos (al igual que las capilares abiertas) El procedimiento dependerá de la naturaleza de la columna y del soporte. Columna metálica: se prepara una suspensión del soporte, se llena la columna con la suspensión, se cierra un extremo y se evapora el agente dispersante quedando así adheridos a la pared del capilar. Columna de vidrio: similar al de columnas capilares rellenas. La diferencia consiste en introducir una varilla de acero inoxidable un el tubo de vidrio y situar el soporte entre ambos. Después se procede al estirado manteniendo fija la varilla (Fig. 3). 4.- Columnas capilares abiertas También conocidas como columnas Golay, quien fue el primero en utilizarla (Golay, 1958). La fase estacionaria va depositada en la pared interior del tubo que actúa como soporte.

15 13 Longitud hasta 200 m, los más utilizados varían entre m Diámetro interno mm Capacidad de carga muy pequeña Relación de fases es la más alta Debido a la pequeña cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la columna tiene una capacidad de carga muy pequeña. Necesita detrectores más sensibles. La naturaleza del tubo y el procedimiento seguido para su limpieza son de gran importancia en este tipo de columnas, ya que la pared del mismo sirve como soporte y su capacidad de retención del solvente influirá notablemente en la uniformidad de la película formada. Uno de los métodos consiste en llenar el tubo con una disolución diluida de la fase estacionaria en un disolvente volátil, cerrar un extremo e introducirla en una estufa con una temperatura superior al punto de ebullición del solvente, la fase quedará depositada sobre la pared del capilar. Temperatura programada. Entre homólogos el tiempo de retención aumenta exponencialmente con el número de carbonos. Conforme aumenta el tiempo de retención, el ancho aumenta y la altura disminuye haciendo imposible la detección después de que algunos picos han eluído. Como la solubilidad de un gas en un líquido disminuye conforme la temperatura se eleva, se puede reducir la retención de un material aumentando la temperatura de la columna. Se debe considerar la solubilidad, cambios en la volatilidad y estabilidad de los solutos, cambios en el flujo y estabilidad de la fase estacionaria. La temperatura debe de estar dentro de Tmin/Tmax de la columna. Algunos GC permiten programación más compleja que el simple incremento gradual de la temperatura. Determinar la temperatura inicial y el tiempo basado en la mejor separación posible de los primeros picos. Repetir uno para los últimos picos para encontrar la mejor temperatura y tiempo. Experimentar con varias rampas para el resto de los componentes. Los flujos del gas portador que se utilizan en columnas capilares suelen ser del orden de ml/min, mientras que en una columna clásica ascienden a un orden de ml/min. Para poder utilizar la columna capilar con éxito será necesario intoducir entre el inyector y la columna un dispositivo denominado divisor de flujo, cuya finalidad es permitir la entrada en la columna de una pequeña fracción solamente del flujo que pasa por el sistema de inyección. La relación de división (flujo al exterior/flujo que pasa por la columna) suele oscilar entre 50 y 120. Esto permite disminuir la cantidad de muestra que pasa por la columna (que queda reducida a la fracción que indica la relación de división) y aumentar la velocidad lineal del gas portador en el sistema de inyección en la cantidad indicada por la relación de la división (la difusión molecular en esta parte del instrumento se hace muy pequeña).

16 14 Entre los factores que disminuyen la eficacia de una columna se encuentran: Longitud de la columna. Limita en cuanto a las velocidades lineales del gas portador, originando tiempos de análisis muy largos y sin mejorar la resolución. Diámetro de la columna. Más importante en columnas capilares abiertas, por la resistencia que opone la fase móvil a la transferencia de masas. Tamaño de la partícula de relleno. Naturaleza de las fases. Fase estacionaria: no afecta. Gas portador: viscosidad y valores del coeficiente de difusión en la fase móvil. Cantidad de fase estacionaria. A menor cantidad mayor eficacia. Temperatura de la columna. Al aumentar esta disminuye la eficacia al afectar directamente en el coeficiente de reparto. Velocidad del gas portador. Una velocidad elevada es la óptima. Cantidad de muestra inyectada. Clásica de relleno Capilar de capa porosa Capilar abierta Tubo o Fase estacionaria Grano de soporte Fig. 3. Tipos de columnas cromatográficas.

17 15 Detectores Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas acarreador, convirtiendo una señal no medible directamente en una señal elaborable de una propiedad física. Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas acarreador puro (blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente separados en la columna, esto es traducido en una señal eléctrica que es amplificada y registrada al momento de salir de la columna. Un buen detector es altamente sensible (sensibilidad), tiene una respuesta lineal (linearidad) sobre un amplio rango de concentración y es relativamente insensible a variaciones de flujo y temperatura (rango dinámico lineal). Pueden ser clasificados por: Grado de selectividad: universales que responden a la mayoría de los solutos; específicos-selectivos con respuesta a un grupo particular de sustancias. Recuperación de la muestra: en referencia a si la muestra es destruída o no. Modo de respuesta: dependientes de flujo de masa (cantidad de soluto independientemente de la cantidad de gas portador); dependientes de concentración (cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador). Proceso de detección: ionización; óptico-espectroscópico; electroquímico. Los detectores más ampliamente utilizados son el detector de conductividad térmica (TCD) y el detector de ionización de flama (FID). Detector de conductividad térmica (TCD thermal conductivity detector) Consiste de dos celdas metálicas idénticas, cada una conteniendo un filamento de alambre de tungsteno o de tungsteno con lámina de oro. El efluente fluye a través de una celda y el gas portador (He o H 2 ) fluye a través de la otra. En un lado de la muestra el gas fluye por el filamento mientras que en el lado de referencia el gas puede pasar sobre el alambre del filamento y difundir a través de él. Los filamentos son calentados por una corriente eléctrica. La temperatura del elemento censor depende de la conductividad térmica del gas que fluye alrededor. Cambios en conductividad térmica, como cuando las moléculas orgánicas desplazan un poco al gas portador, provocan un incremento en la temperatura del elemento el cual está siendo monitoreado como un cambio en la resistencia. Dos pares del TCD son utilizados en cromatógrafos de gases, un par localizado en la salida de la columna para detectar los componentes separados mientras van saliendo, el otro par localizados antes del inyector o en una columna de referencia separando las resistencias de los dos pares y están acomodados en un circuito de puente. Para un máximo de sensibilidad, la temperatura del filamento es incrementada, la temperatura y la velocidad del flujo son disminuidas y se escoge un gas con mayor

18 16 conductividad térmica (la mayoría de los gases orgánicos tienen calores de conductividad bajos). Este es un método no destructivo dependiente de concentración, con selectividad universal, con un límite de detección de ~400 pg/ml de gas portador. Su modo de detección es debido al cambio de resistencia del cable basado en la termoconductividad del gas cuando fluye a través de la columna (Fig. 4). Fig. 4. Detector de conductividad térmica 6 Detector de ionización de flama (FID flame ionization detector) El FID consiste de una flama hidrógeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen de la columna pasan a través de la flama, la cual rompe las moléculas orgánicas y produce iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una señal eléctrica. Es extremadamente sensible en un amplio rango dinámico. La única desventaja es que destruye la muestra. La muestra debe ser un combustible, esta entra en la base del detector, se mezcla con el hidrógeno y entra a la flama. Hay compuestos con poca o sin respuesta al FID, compuesto como el NH 3, CS 2, Nox, CO, CO 2, O 2, H 2 O, N 2, compuestos perhalogenados, etc. La respuesta está basada en el número de carbonos y otros elementos tales como halógenos y el oxígeno presentes que reducen la combustión.

19 17 Este es un método destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para compuestos orgánicos, con un límite de detección de ~ 100pg/seg. Su modo de detección es debido a la producción de iones en una flama resultando en una corriente que puede ser medida (Fig. 5). Fig. 5. Detector de ionización de flama 6 Detector fotométrico de flama (FPD flame photometric detector) Es uno de los más usados en los métodos selectivos de cromatografía de gases. El FPD consiste de una flama reductora que produce especies quimioluminiscentes. Estas especies emiten una luz característica que es óptimamente filtrada por la longitud de onda deseada, la cual determina que componentes son los detectados. La luz filtrada es medida por un fotomultiplicador (PMT) y transducida a una señal. Se puede agregar un segundo fotomultiplicador, el cual permite una detección simultánea de una segunda señal. Los filtros para FPD pueden ser seleccionados para diferentes componentes, pero los más comunes son para la detección de sulfurados y fosforados en mezclas complejas. La

20 18 selectividad de FPD clásicos (como una porción por peso del carbono) es 10 5 sulfurados y 10 6 para fosforados. para La cromatografía de gases con FPD puede ser usada para detectar componentes sulfurados en extractos crudos de aceite y en contaminantes de gas natural. También puede ser utilizado para detectar pesticidas y herbicidas organofosforados, así como de componentes sulfurados volátiles en el análisis de alimentos. Este es un método destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para S, P, Sn, B, As, Ge,Se, Cr; con un límite de detección de ~ 100pg/seg. Su modo de detección es debido a la producción longitudes de onda particulares resultando en una corriente que puede ser medida. Fig. 6 Detector fotométrico de flama 6

21 19 Detector de captura de electrones (ECD electron capture detector) Es altamente sensible a compuestos halogenados y por lo tanto muy útil en la detección de pesticidas. Da un poco de respuesta a hidrocarburos y otros carbonilos conjugados. Para este tipo de cromatografía la muestra debe contener una fase gaseosa electrófora. Este es un sistema donde se detectan partículas ß por absorción de especies que contienen halógenos, nitrilos, nitratos, organometales y dobles enlaces conjugados. Las partículas ß son emitidas por una fuente de 63 Ni, los electróforos las absorben reduciendo la corriente, siendo esta la base de la respuesta(fig. 7). Fig. 7 Detector de captura de electrones 6 Detector de fotoionización (PID photoionization GC detector) Este tipo de detector es muy selectivo para los compuestos con hidrocarburos aromáticos o con heteroátomos, los cuales tienen potenciales de ionización. Utiliza luz ultravioleta para ionizar un analito, la longitud de onda oscila entre nm. Los iones producidos son colectados por electrodos siendo la corriente generada una medida de la concentración del analito. Este es un método no destructivo dependiente de concentración, con selectividad para compuestos alifáticos, aromáticos, heterocíclicos, organosulfurados y algunos organometálicos, cetonas, ésteres, aldehídos y aminas; con un límite de detección de ~2pg/seg. Su modo de detección es debido a los potenciales de ionización de los compuestos analizados (Fig. 8).

22 20 Fig. 8 Detector de fotoionización 6 Métodos Análisis cualitativo La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos de separación más eficaces que se conocen; cada componente de una muestra suministra tres unidades de información: posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posición, un solo parámetro expresado cuantitativamente expresado como dato de retención, suministra la información cualitativa y los otros proporcionan la información cuantitativa. Para simplificar el problema del análisis cualitativo se supone que el cromatograma se ha registrado en las condiciones óptimas, los picos están totalmente separados con resolución superior a la unidad y que cada uno de ellos corresponde a un solo compuesto. En los casos favorables es posible identificar los componentes por la posición de los picos, pero por lo general la ambigüedad es tan grande que el analista ha de completar la información con la obtenida por otros métodos analíticos, siendo preferibles las técnicas multiparamétricas, como la espectrometría de masas o la espectroscopía de infrarrojo.

23 21 En la siguiente tabla se resumen los procedimientos utilizados para identificar los picos cromatográficos. No existe un método general aplicable a todos los problemas prácticos, la información cromatográfica cualitativa depende del conocimiento previo de la composición de las muestras y casi siempre se han de combinar varias de las operaciones incluidas en la tabla para seguir identificaciones fiables. A pesar de los inconvenientes del método, la cromatografía de gases en combinación con otras técnicas es el instrumento más eficaz conocido hasta la fecha para determinar la composición cualitativa de mezclas complejas de compuestos orgánicos. Tabla. 1 Identificación cualitativa por cromatografía de gases 2. Solamente se estudia la identificación por procedimientos cromatográficos teniendo siempre en cuenta que se ha de completar, excepto en los casos favorables, por análisis con otros métodos. Entre los más eficientes están el de pasar directamente los efluentes a un espectrómetro de masas, o de infrarrojo, colocados a la salida de la columna y el de condensación y análisis por otras técnicas instrumentales o químicas. Métodos de coincidencia El método más simple de identificación cromatográfica consiste en comparar el volumen de retención de un compuesto problema con el de un patrón, determinado en las mismas condiciones operativas y en la misma columna. Como estas condiciones son difíciles de mantener constantes en cromatogramas registrados sucesivamente y todavía más difíciles en días diferentes, es mejor añadir el patrón como un marcador a la muestra problema y comprobar si no coincide con alguno de los picos originales. Si por el contrario, aumenta la

24 22 altura de alguno de ellos, es una evidencia de la coincidencia de los volúmenes de retención. La respuesta negativa no es ambigua; se puede afirmar que ninguno de los componentes de la muestra es el patrón. Pero en caso contrario la ambigüedad es muy grande, sobre todo si se analizan compuestos que no han sido previamente estudiados por cromatografía de gases. Al estudiar la probabilidad de que el pico que coincide con el patrón sea el patrón, la certeza es la identificación de que un pico depende de sustancias eluidas cerca del mismo con las que puede confundirse. Expresando cuantitativamente esta observación intuitiva se tiene 2 : ρ = h/(v 1 r-v 2 r)/δv r ρ = número total de picos/número total de divisiones Si se sabe de antemano que la mezcla solamente contiene carbono e hidrógeno, dato suministrado por el análisis elemental orgánico, h sería el número posible de hidrocarburos eluidos entre los volúmenes de retención V 1 r y V 2 r. La menor diferencia de volúmenes de retención detectable, δv r al nivel de confianza de 95 % vale 4σ Vr (σ Vr es el error típico de las medidas duplicadas del volumen de retención). En otras palabras si en un cromatograma fuera posible incluir todos los eluyentes posibles entre V 1 r y V 2 r el número de sustancias que dentro del error experimental serían simultáneamente eluidas sería ρ, o en densidad de los picos. En la práctica la distribución de picos sigue la distribución de Poisson 2. p n = e -p ρ n /n! en la que p n es la probabilidad de encontrar n solutos en el intervalo unitario δv r Para reducir las identificaciones erróneas a 1 en 1000, solamente serán permisibles 4 eluyentes. Esto significa que en la mayoría de los casos prácticos es imposible la identificación en éste nivel con una sola columna a partir de los datos de retención. La única manera de eliminar esta dificultad es reducir ρ, y por tanto, p es. Esto es equivalente a reducir δv r o h. La primera alternativa implica mejorar la precisión de las determinaciones de rutina de las medidas de retención a un nivel superior al 1%, muy difícil de conseguir en la practica. Por otra parte, es posible reducir fácilmente ρ por medio de otro tipo de información, análisis elemental, técnicas instrumentales o separación en otras columnas cromatográficas. Son evidentes las razones de la separación en varias columnas, pero una discusión semicuantitativa aclara las limitaciones del tratamiento estadístico.

25 23 La probabilidad que se eluyan simultáneamente picos conteniendo más de un componente en dos columnas diferentes A y B está dada por 2 : p es A+B = p es A *p es B como p es B <1 se deduce que p es A+B < p es A ; y por ello la separación en dos columnas ha reducido la probabilidad de identificación errónea debida a la elución simultánea. Siguiendo este procedimiento y separando en suficiente número de columnas es posible reducir p es a un valor muy pequeño. Sin embargo, para que se cumpla el procedimiento estadístico la distribución de los eluyentes ha de ser aleatoria, no será válido el razonamiento si el volumen de retención en la columna A está relacionado con el de la columna B. Por lo tanto, el empleo de varias columnas reduce la probabilidad de identificación errónea, más marcadamente cuando las columnas tienen comportamiento muy diferente. Retención relativa Los volúmenes de retención dependen de un gran número de variables operativas, debido a esto es difícil conseguir respuesta idéntica aún en columnas preparadas en las mismas condiciones; por lo tanto, para identificar sustancias a partir de datos bibliográficos se han de expresar las retenciones como variables reproducibles por diferentes equipos e investigadores. Se han utilizado dos procedimientos generales: a) Cálculo de los volúmenes de retención específicos b) Determinación de retenciones relativas a patrones Es difícil determinar rutinariamente el volumen de retención específico porque se necesita conocer con exactitud el peso de la fase estacionaria de la columna. En la práctica del análisis cualitativo se emplea corrientemente la retención relativa. Los componentes y el patrón han de registrarse en el mismo cromatograma. El cálculo es muy sencillo, se limita a la realización de dos medidas de distancia, una desde el máximo del pico del problema al pico del aire, y otra entre los máximos del patrón y el aire. La retención relativa de un compuesto es independiente de la longitud de la columna, del flujo del gas portador y de la cantidad de fase estacionaria; dependiendo solamente de la temperatura de separación y de la naturaleza de la fase estacionaria. Un inconveniente de la identificación por retenciones relativas es el gran número de sustancias empleadas como referencia, que hace difícil determinar la coincidencia de los datos publicados por diferentes autores. Es casi imposible en la práctica fijar un solo patrón

26 24 de referencia y su selección queda a disposición del especialista, por lo que existe gran número de datos de poca aplicación a problemas particulares. Optimización de flujos en capilaridad split/splitless en cromatografía de gases Por definición estándar, una cromatografía de gases es optimizada cuando la sensibilidad y resolución de una mezcla compleja es activado en el menor tiempo posible. Una cromatografía de gases optimizada que está bien calibrada cuando 1) las soluciones estándar de diferentes concentraciones son lineales, 2) los estándares a las mismas concentraciones se reproducen en un periodo de tiempo específico y 3) bajos niveles de concentración de picos tempranos y tardíos, acompañados con el menor ruido, son indicativos de una cromatografía bien calibrada. Si alguno de los criterios antes mencionados no se completan, todo debe ser repetido. Un sistema optimizado es muy difícil de mantener. Un cambio directo en el flujo, puede modificar completamente la forma de los picos y alterar toda la eficiencia de la columna. Complicaciones mayores se obtienen cuando se utiliza un sistema de dos columnas y una de ellas afecta el funcionamiento de la otra. Desafortunadamente, esto frecuentemente aumenta el tiempo de análisis. La dificultad con la optimización es que esto involucra muchas variables: 1) parámetros fijados como la longitud de la columna, diámetro interno, y capacidad de adhesión de la película; 2) parámetros operacionales como la temperatura de la columna, acarreador y flujo de gas, o los modos de inyección. Optimización del flujo acarreador para mejorar la resolución de la columna La resolución y separación de los picos son dos de los factores más importantes para la resolución de la columna. Resolución es la capacidad de la columna para separar dos picos adyacentes, dependientes de la selectividad y eficiencia. La eficiencia es la relación entre la longitud del tiempo que gasta el soluto en salir de la columna y la anchura del pico sobre la elución. Esto es determinado por el número efectivo de placas teóricas las cuales son secciones ideales de la columna donde los solutos se equilibran entre la fase estacionaria líquida y la fase gaseosa móvil. Expresado como 4 : N = 5,54 [(tr-to)/w1/2] 2 Donde tr es el tiempo de retención del soluto, to es el tiempo de retención de una sustancia sin retención o tiempo de volumen muerto, y w1/2 es el ancho del pico del soluto. Un valor alto de N indica una gran capacidad de retención del soluto de la fase estacionaria y una gran eficiencia de la columna. La presencia de un volumen muerto grande (to) esconde la eficiencia de la columna pero puede ser reducido incrementando la velocidad lineal del flujo del gas acarreador. La asociación entre la velocidad lineal y eficiencia de

27 25 columnas de capilaridad puede ser ilustrado más claramente sustituyendo la altura equivalente a una placa teórica (H) por número efectivo de placas teóricas (N). En este modelo, (N) está relacionado a la longitud de la columna (L) de acuerdo a H (HETP) = L/N. La figura 9 muestra (H) como una función de la velocidad promedio (u) donde Hmin y u min están bajo condiciones de flujo optimizados. Fig. 9 Punto general de Van Deemter 4. Para disminuir la viscosidad e incrementar la eficiencia de la columna, se debe seleccionar una velocidad de flujo lineal. En este valor, el tiempo de corrida es el más corto con una muy baja pérdida de eficiencia. De acuerdo a u min la eficiencia máxima es obtenida pero solo gastando mayor tiempo de corrida. La velocidades bajo u min caen en la parte de la curva donde la eficiencia y el tiempo de corrida son los peores. En general, todos los solutos se optimizan en algunos puntos directamente sobre u min pero moléculas grandes se optimizan en velocidades más bajas que moléculas pequeñas. El grado en el cual la velocidad lineal puede mejorar el comportamiento de la columna cuando la programación de la temperatura es específica al gas acarreador como se muestra en la figura 10. Claramente, el hidrógeno es la mejor elección para obtener la separación más grande en el periodo de tiempo más corto debido a su menor viscosidad que otros gases en temperaturas más altas. El helio, es una elección más práctica porque no se necesitan precauciones de ventilaciones.