Implementación de un protocolo de fertilización in vitro en bovinos en el laboratorio de reproducción animal de Zamorano

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1 Implementación de un protocolo de fertilización in vitro en bovinos en el laboratorio de reproducción animal de Zamorano J O H N J A I R O H I N C A P I E P H. D. J E S S I C A G A R C Í A R E C I L L A S I N G. A G R. J O S E L U I S M A R T Í N E Z Q U I N T E R O I N G. A G R.

2 INTRODUCCIÓN Biotecnología de la reproducción Herramientas Fertilización In Vitro (FIV) Ventajas Producción de embriones Obtención de oocitos Maduración in vitro Fertilización in vitro Cultivo in vitro

3 1. Preparación de medios: MATERIALES Y MÉTODOS Solución salina al 0.9% (NaCl) Medio de Colección de Oocitos (OCM) Medio de Maduración de Oocitos (CCOs-MMO) Soluciones TL Medios TALP (Tyrode s Albumina Lactato Pyruvato) Fluido Sintético de Oviducto (SOF) Percoll 90%

4 2. Lavado de ovarios: Solución de transporte 3. Recolección de oocitos: Microgotas flotantes de 50µL Incubadora Selección de ovarios y aspiración Medio OCM a baño María (5mL) Placa de búsqueda y placa nunclon 20 oocitos por microgota

5 4. Maduración in vitro: Búsqueda en placa grid Lavado y transferencia de oocitos 5. Fertilización in vitro: Elaboración de Percoll Percoll 90% y Percoll 45% Evaluación de semen Placa nunclon y Hepes-TALP Capacitación del semen Penicilamina-Hipotaurina- Epinefrina. IVF-TL

6 6. Cultivo de embriones: Microgotas de SOF Hepes- TL y hialuronidasa Vortex Lavado de embriones Desarrollo embrionario al tercer día Adición de suero fetal inactivado: quinto día Blastocistos al día 7

7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Número de oocitos recuperados utilizando la técnica de aspiración ovárica. Repetición Ovarios aspirados Oocitos extraídos Oocitos viables extraídos Oocitos degenerados Promedio de oocitos viables por ovario (65.61%) 76 (34.38%) (65.92%) 76 (34.08%) 4.0 Total (65.76%) 152 (34.23%) 4.2 Fernández et al. (1999): 45.98% y 54.01% Huanca et al. (2007): 60.7%. Cansino Arroyo et al. (2008): 63.14% y 36.89%

8 Detritus Zona pelúcida Células del cumulus oophorus Zona pelúcida A B Oocitos obtenidos de la punción ovárica con sus estructuras. A) Oocito viable B) Oocito degenerado.

9 Porcentaje de Maduración In Vitro (MIV) Repetición Oocitos iniciales Oocitos madurados Oocitos no madurados % (124) 14.48% (21) % (108) 26.53% (39) Total % (232) 20.55% (60) Fernández Reyes et al. (2010): en cerdas 32.1% y 67.8% Cansino Arroyo et al. (2008): SIT (74.93%), SIA (74.68%) y SIC (69.87%).

10 A B Oocitos obtenidos de maduración in vitro. A) Partes de un oocito madurado B) Oocito madurado y no madurado.

11 Porcentaje de fertilización in vitro de oocitos bovinos. Repetición Oocitos maduros iniciales Oocitos fecundados Oocitos no fecundados % (56) 54.83% (68) % (45) 58.33% (63) Total % (101) 56.46% (131) Cansino Arroyo et al. (2008): SIT (42.48%), SIA (34.94%) y SIC (31.12%). Fernández et al. (1999): 70%

12 C. polar Oocitos fertilizados en el día uno del proceso de fertilización in vitro.

13 Porcentaje de clivaje y apoptosis Repetición Número de oocitos fecundados Oocitos en proceso de clivaje Oocitos en proceso de apoptosis % (33) 41.1% (23) % (23) 48.8% (22) Total % (56) 44.5% (45) Lopez et al. (2007): 31%, 32%,37% y 43%. Mejía Isaza et al. (2009): KSOMaa (44%)

14 Embriones en clivaje (Blastocisto) Pipeta Drummond A B Embriones en clivaje obtenidos en el Laboratorio de Reproducción Animal de la EAP Zamorano. A) Estados embrionarios de clivaje. B) Selección de blastocistos con la pipeta Drummond.

15 Embriones en apoptosis. Día 5 de cultivo.

16 Porcentaje de blastocitos obtenidos al día siete. Repetición Oocitos en proceso de clivaje Número de blastocistos % (15) % (15) Total % (30) Fernández et al. (2007): 0%, 2.1 % y 2.6% Mejía Isaza et al. (2009): KSOMaa (0%) y CR1aa (15%) Ratto et al. (1999): 15.7% en células oviductuales y 0% en medio condicionado. Ahuja Aguirre et al. (2009): KSOM (31.6%)

17 CONCLUSIONES Bajo las condiciones del Laboratorio de Reproducción Animal de la EAP Zamorano se obtuvieron: Mayor número de oocitos viables extraídos y un promedio de oocitos viables por ovario similar al de la literatura citada. Mayor porcentaje en maduración in vitro y blastocistos al día 7. Menor porcentaje de fertilización in vitro y apoptosis. Porcentaje de clivaje similar a los reportados en la literatura científica

18 Video FIV

19 Ingrediente Sp-TL HEPES-TL IVF-TL Agua (ml) Solución 17: NaCl (ml) Solución 18: KCl (ml) Solución 19: bicarb (ml) Solución 20: phosphate (ml) Solución 1: Na-lactate (ml) Solución 21: HEPES (ml) Solución 22: Ca chloride (ml) Solución 23: Mg chlor (ml) ph Osmolaridad (mosm)

20 Ingrediente Sp-TALP HEPES-TALP IVF-TALP TL (ml) BSA, Fracción V (mg) BSA, EFAF (mg)* Solución 2: pyruvato (ml) Solución 8: gentamicina (μl) Solución 7: heparina (μl)

21 Eficiencia del sistema de producción in vitro Eficiencia global Nº de ovocitos por ovario puncionado= 10 Porcentaje de ovocitos clivados / ovocitos totales = 80 Porcentaje de embriones / ovocitos totales al día 7 de cultivo = 30 Porcentaje de preñez al día 30 = ovocitos = 30 embriones transferibles 15 preñeces a los 30 días 13 nacimientos

22 Producción in vitro de embriones Aplicaciones/Ventajas Q Aumenta y estandariza su producción Facilita el progreso genético (puede duplicar la producción in vivo por superovulación) Optimiza el uso de semen de alto valor Aprovechar donantes Transgénesis Clonado

23 Producción in vitro de embriones Aplicaciones/Ventajas Aumenta y estandariza su producción, facilita el progreso genético IA o Servicio Natural: 6 terneros SOTE: 40 terneros OPU: 80 terneros

24 Producción in vitro de embriones Aplicaciones/Ventajas Optimiza la utilización de semen de alto valor IA 1,5 dosis: 1 ternero SOTE 2 dosis: 2 terneros PIV 1 dosis: 1 hasta 120 terneros

25 Producción in vitro de embriones Aplicaciones/Ventajas Aprovechar donantes Hembras prepúberes Hembras con defectos adquiridos que impidan la gestación Hembras sin respuesta superovulatoria Hembras preñadas Hembras faenadas/castradas

26 Implementación de un protocolo de fertilización in vitro en bovinos en el laboratorio de reproducción animal de Zamorano J O H N J A I R O H I N C A P I E P H. D. J E S S I C A G A R C Í A R E C I L L A S I N G. A G R. J O S E L U I S M A R T Í N E Z Q U I N T E R O I N G. A G R.

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