PESTE PORCINA CLÁSICA (cólera del cerdo)

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1 CAPÍTULO PESTE PORCINA CLÁSICA (cólera del cerdo) RESUMEN La peste porcina clásica (PPC), también denominada cólera del cerdo, es una enfermedad vírica contagiosa de los cerdos. El agente causal es un miembro del género Pestivirus de la familia Flaviviridae, estrechamente relacionado con los virus de la diarrea bovina fetal y de la enfermedad de la frontera. Solo existe un serotipo de virus de la PPC (CSFV). La enfermedad puede tener un desarrollo agudo, subagudo, crónico, de aparición tardía o inaparente, dependiendo de varios factores víricos y del hospedador, siendo los más importantes la edad de los animales, la virulencia del virus y el tiempo de infección (pre- o post-natal). Los cerdos adultos suelen mostrar menos síntomas graves de la enfermedad que los jóvenes y tienen mayor probabilidad de supervivencia. En las cerdas gestantes, el virus puede atravesar la barrera placentaria e infectar a los fetos. La infección intrauterina con cepas del virus de baja o moderada virulencia origina lo que se conoce como el síndrome de la cerda portadora, que se caracteriza por la muerte prenatal o perinatal, el nacimiento de lechones enfermos o una camada aparentemente "sana" pero infectada persistentemente. Un brote de PPC tiene graves consecuencias económicas para el mercado de los cerdos y de sus productos derivados. La elevada variabilidad clínica de la PPC dificulta a menudo el diagnóstico realizado sobre bases clínicas y patológicas. Los métodos de laboratorio son por tanto, esenciales para un diagnóstico inequívoco. La detección del virus, del ácido nucleico vírico en la sangre y de anticuerpos en el suero son los mejores métodos para diagnosticar PPC en cerdos vivos, mientras la detección del virus o del ácido nucleico vírico o del antígeno en muestras de órganos resulta más adecuada en cerdos muertos. Identificación del agente: Para la detección del antígeno de la PPC puede utilizarse la inmunofluorescencia directa (IFD) en cortes de órganos de cerdos afectados. Para determinar si la fluorescencia se debe a antígenos de PPC o de Pestivirus que no producen PPC se emplean varios anticuerpos monoclonales. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza generalmente para la detección del fenómeno de la PPC. El aislamiento del CSFV se debe intentar en la línea celular de riñón de cerdo (PK-15) o en otra línea celular adecuada. El crecimiento del virus en los cultivos se examinan por inmunofluorescencia o tinción con inmunoperoxidasa; los aislamientos positivos se caracterizan posteriormente por medio de MAbs y por secuenciación génica parcial. Los protocolos basados en la reacción en cadena de la polimerasa para la identificación del ácido nucleico del CSFV, están actualmente ganando aceptación internacional y se están utilizando en varios laboratorios, tanto para la detección del agente como para la diferenciación de los pestivirus de los rumiantes. Los enzimoinmunoensayos de captura antigénica (ELISA) son también útiles para realizar una criba en la piara pero no deben utilizarse en base a un solo animal. Pruebas serológicas: La detección de los anticuerpos específicos contra el virus es particularmente útil en las piaras donde se sospecha una infección por CSFV iniciada al menos 21 días antes. Los métodos serológicos son también adecuados para el control y para estudios de prevalencia, y resultan esenciales en el caso de que un país desee el reconocimiento internacional de estar exento de la enfermedad sin vacunación. Como en los cerdos de cría se observan ocasionalmente anticuerpos contra CSFV que muestran reacción cruzada con los pestivirus de los rumiantes, las pruebas de análisis deben acompañarse de pruebas confirmativas que sean específicas para CSFV Algunas pruebas ELISA son relativamente específicas para CSFV pero la prueba de la neutralización comparativa es el método Manual de la OIE sobre animales terrestres

2 definitivo de diferenciación, y compara el nivel de anticuerpos frente a diferentes especies de Pestivirus. Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Las vacunas contra la PPC contienen un virus vivo que se ha atenuado mediante pases en cultivos celulares o a través de los hospedadores adecuados que no pertenezcan a la familia Suidae. La producción de estas vacunas con virus vivos modificados (MLV) se basa en un sistema de lotes de inóculos que se ha validado respecto a la identidad del virus, esterilidad, pureza, seguridad, falta de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad. Si se utiliza el CSFV para la producción de vacunas o en estudios de infección experimental, las instalaciones deben cumplir los requisitos de Contención de la OIE para patógenos del Grupo 4. No se dispone de vacunas convencionales eficaces con virus completos inactivados. Están disponibles subunidades de vacunas marcadoras que, en contraste con las vacunas con MLV, inducen anticuerpos que pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural utilizando una prueba diagnóstica de acompañamiento. Las vacunas marcadoras registradas en la actualidad se basan en la principal glicoproteína de la envoltura vírica del CSFV (subunidad E2), y se producen en los insectos mediante la tecnología de ADN recombinante. A. INTRODUCCIÓN Los virus que causan la peste porcina clásica (PPC), la diarrea víral bovina (DVB) y la enfermedad de la frontera (EF) son miembros de la familia Flaviviridae, género Pestivirus, y están estrechamente relacionados entre sí tanto antigénica como estructuralmente. Los síntomas clínicos y las lesiones observadas post mórtem en los cerdos afectados por PPC son muy variables debido a factores dependientes del virus y de los hospedadores. Además, las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden dar lugar en cerdos a una enfermedad clínica que es indistinguible de la PPC (31, 33, 35). Los síntomas más destacados de la enfermedad son su aparición en todos los grupos de edad, acompañada por pirexia, agrupamiento de animales, inapetencia, torpeza, debilidad, conjuntivitis, estreñimiento seguido de diarrea y ataxia. Varios días después de la aparición de los síntomas clínicos, las orejas, el abdomen y la parte interna de los muslos pueden mostrar una decoloración morada. Los animales con la enfermedad en forma aguda mueren en 1 3 semanas. La muerte súbita en ausencia de enfermedad clínica no es sintomática de la PPC. En algunas circunstancias relacionadas con la edad del animal y su condición, así como con la cepa de virus implicado, puede aparecer la enfermedad en forma subaguda o crónica y durar 2 4 semanas o incluso meses. La enfermedad crónica acarrea una disminución del crecimiento, anorexia, pirexia intermitente y diarrea. Las infecciones congénitas persistentes pueden pasar indetectables durante meses y limitarse solo a unos cuantos lechones de la piara o puede afectar a una gran cantidad. Los síntomas clínicos son inespecíficos: debilidad en ausencia de pirexia. Las infecciones crónicas y persistentes siempre conducen a la muerte del animal. Las tasas de mortalidad en la piara pueden superar ligeramente el nivel esperado. La PPC afecta al sistema inmune, y una característica es una leucopenia generalizada, que a menudo puede detectarse antes de la aparición de la fiebre. La inmunosupresión puede acarrear infecciones concurrentes. En casos agudos, las lesiones patológicas graves pueden ser a menudo poco llamativas o están ausentes. En los casos típicos, los nódulos linfáticos se inflaman y enrojecen, y se presentan hemorragias en la serosa, en las membranas mucosas de los órganos intestinales. Pueden ocurrir infartos del bazo, los riñones, la vejiga urinaria, la piel y bajo la dermis. En los casos subagudos y crónicos, además de las lesiones anteriores, pueden observarse úlceras necróticas o en botón en la mucosa del tracto gastrointestinal, la epiglotis y la laringe. Los hallazgos histopatológicos no son patognomónicos. Las lesiones pueden incluir una degeneración parenquimatosa del tejido linfático, proliferación celular del tejido vascular intersticial y una meningoencefalitis no supurativa, con o sin desgarro vascular. Una fuente autorizada ha publicado recientemente una crítica útil sobre el diagnóstico de la PPC y su vacunación (3) que, a modo de guía general, también proporciona fuentes de información sobre la validación y la opinión científica acerca de la aplicabilidad de ciertos productos comerciales. B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO La variabilidad de los síntomas clínicos y de las lesiones post mórtem no suministran una evidencia firme para establecer un diagnóstico inequívoco. Otras enfermedades víricas pueden confundirse con la PPC, como la peste porcina africana, la dermatitis y el síndrome de neuropatía porcinos (PDNS), el síndrome de debilidad 2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

3 multisistémica post-destete (PMWS), la púrpura trombocitopénica y varias enfermedades septicémicas como la salmonelosis (especialmente la producida por Salmonella choleraesuis), la erisipela, la pasteurelosis, la actinobacilosis (producida por Actinobacillus suis) y las infecciones con Haemophilus parasuis. De hecho, estas bacterias causan frecuentes infecciones concurrentes y el aislamiento de estos patógenos puede enmascarar al virus de la PPC (CSFV) como la causa real de la enfermedad. De forma similar, los PDNS pueden enmascarar una infección latente por PPC. Por tanto, un diagnóstico presuntivo basado en síntomas clínicos y en lesiones post mórtem debe confirmarse con las investigaciones en el laboratorio. Dado que la pirexia es uno de los primeros signos de la PPC y está acompañada por una viremia (7), la detección del virus o del ácido nucleico vírico en sangre, recogida en heparina, en etiléndiamino tetraacético (EDTA), o en tejidos recogidos de algunos animales febriles, es el método preferido para detectar las piaras infectadas en la fase inicial. De este modo, las pruebas laboratoriales de diagnóstico van a ser fundamentales considerando las graves consecuencias que puede tener un brote de PPC en el mercado de ganado porcino y de sus productos derivados. Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el ácido nucleico vírico o los antígenos víricos, o bien a la detección de los anticuerpos específicos. Para una interpretación correcta de los resultados de estas pruebas, el inspector veterinario debe prestar una atención particular a la presentación simultánea de dos o más de los síntomas predominantes de la enfermedad citados anteriormente. Para el diagnóstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar. Adicionalmente, se pueden tomar muestras de sangre de un grupo mayor de cerdos para la detección de los virus y los análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) pueden recogerse de un número mayor de cerdos. La PPC está bajo control oficial y el virus tiene un elevado riesgo de dispersión desde el laboratorio: en consecuencia, debe realizarse un análisis de riesgos para determinar el nivel necesario de seguridad para el diagnóstico y la caracterización del virus. La instalación debe cumplir los requisitos del Grupo de Contención apropiado según determina la estimación de riesgos resumida en el capítulo Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales. Los países sin acceso a un laboratorio regional o nacional especializado de ese tipo, deberían enviar las muestras a un laboratorio de referencia de la OIE. Los anticuerpos aparecen en la tercera semana de la enfermedad y persisten durante toda la vida del animal superviviente. Las muestras para detección de los anticuerpos se recogen en tubos ordinarios (no heparinizados) cuando hayan transcurrido 3 semanas o más desde que ocurrió el contacto sospechoso con un brote confirmado, utilizando cerdos convalecientes y piaras en contacto. 1. Identificación del agente a) Métodos inmunológicos Prueba de inmunofluorescencia La prueba de inmunofluorescencia (IFD) es una prueba rápida que puede utilizarse para detectar el CSFV en cortes finos de amígdalas, bazo, riñón, nódulos linfáticos o porciones distales del íleon. Los tejidos deben recogerse de varios animales (febriles y o enfermos) (4) y transportarse sin conservantes en frío, pero no congelados. Los cortes se tiñen directamente con inmunoglobulina anti-ppc conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se examinan en un microscopio de fluorescencia. El tejido de las amígdalas es el más adecuado durante la primera fase de la infección, ya que es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de infección (25). En casos subagudos y crónicos, el íleon es con frecuencia positivo y a veces, puede ser el único tejido que muestre fluorescencia. Un resultado negativo por IFD no elimina por completo la presencia de infección de la PPC. Cuando se mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener más muestras o intentar el aislamiento del virus en cultivo celular (por ejemplo, en riñón porcino [PK-15] u otra línea celular de origen porcino que sea sensible y que se conozca que está libre de contaminación con Pestivirus). Existe un riesgo relativamente alto de resultados falsos (positivos y negativos) cuando la IFD es utilizada por los laboratorios no muy familiarizados con el método. Por tanto, la IFD debería utilizarse solo por laboratorios que tienen experiencia en el uso de esta técnica, en aplicarla de forma rutinaria y hayan tenido entrenamiento en la interpretación de la fluorescencia. Procedimiento de la prueba En cada serie de muestras de órganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo. i) Se corta un trozo de las amígdalas, bazo, riñón o íleon, de aproximadamente 1 1 0,5 cm, y se monta con un compuesto criostático o con agua destilada en un criostato. ii) Se congela el trozo de órgano en el criostato. Manual de la OIE sobre animales terrestres

4 iii) Se cortan secciones de un grosor menor de 4 8 µm y se montan en cubres libres de grasa de mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posición (por ejemplo, arriba a la derecha). iv) Después de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analítico) durante 10 minutos a temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37 C. v) Los cortes se sumergen brevemente en una solución salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina el exceso de líquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en una cámara de incubación húmeda con un pequeño volumen de agua colocada en el fondo de la cámara. vi) Se deposita la solución de trabajo de inmunoglobulina anti-ppc en los cortes y se incuban en la cámara cerrada durante 30 minutos a 37 C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se añade la dilución de trabajo del conjugado con FITC, incubándose como se ha descrito antes. vii) Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente. viii) Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampón de montaje en un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta). ix) Se elimina el exceso del líquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para la fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra células con fluorescencia verde brillante. En las amígadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la línea epitelial de las criptas. En cortes de riñón, la fluorescencia es más abundante en los túbulos proximales y distales del córtex renal y en los conductos colectores de la médula. En el íleon, la fluorescencia es más destacable en las células epiteliales de las glándulas de Lieberkünhn, mientras que en el bazo la reactividad es más difusa, con concentraciones de células linfoides en la lámina linfoide periarterial (PALS). La IFD requiere utilizar una inmunoglobulina anti-ppc preparada a partir de un anticuerpo policlonal contra el CSFV que no distingue entre los antígenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para IFD en cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-csfv de cerdos libres del patógeno específico. La dilución de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un máximo de brillo con un mínimo de fondo. La prueba debería realizarse solo en muestras de animales recién muertos, dado que la autolisis y la contaminación bacteriana a menudo dan como resultado una tinción de fondo alta. Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los nódulos linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amígdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV pueden dar la prueba IFD positiva 2 semanas después de la vacunación (22, 28). La inoculación en conejo se utiliza para diferenciar entre las cepas de CSFV adaptadas a conejo y las cepas de campo. A diferencia de las cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reacción febril e inducen una respuesta inmune en los conejos cuando se suministran intravenosamente.csfv adaptadas al conejo. Dado que la secuenciación del ácido nucleico empieza a estar disponible y es más fiable, la inoculación de los animales ya no se considera necesaria para diferenciar entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV. En la prueba IFD, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas. Las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar síntomas clínicos y lesiones patológicas indistinguibles de las presentes en la PPC crónica (31, 33, 35). Las infecciones por CSFV o por pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros animales en contacto con un lechón IFD-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Si se aísla el virus o se puede detectar el ácido nucleico vírico utilizando la RT-PCR, las secuencias posteriores proporcionan una herramienta rápida y precisa para distinguir entre los pestivirus de los rumiantes y el CSFV. Otro método para distinguir estos virus es por inoculación de lechones seronegativos con una suspensión de material sospechoso seguido de al menos 4 semanas de pruebas de neutralización vírica (NV) en sus sueros para los anticuerpos respectivos. Sin embargo, las pruebas NV pueden durar varios días y los métodos de inoculación en los animales duran varias semanas. Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa La utilización de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de rábano (HRPO) o con FITC, o usados en conjunción con un conjugado anti-ratón, que sean capaces de detectar de modo específico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitirían, por una parte, una diferenciación inequívoca entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (11, 4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

5 36, 38). Un prerrequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de los rumiantes (11). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-ppc conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como única confirmación de que un aislamiento corresponde a la PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-ppc conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como la única confirmación de que un aislamiento corresponde a PPC. Procedimiento de la prueba i) Se cortan ocho o más secciones (4 8 µm) de las amígdalas que son positivas por IFD, o de otro órgano positivo si no se dispone de amígdalas. ii) Se fijan los cortes con acetona (grado análitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al aire. iii) Se preparan diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS + 0,01% de Tween 80 + suero de caballo al 5%, ph 7,6. (también puede utilizarse MAb conjugado con FITC, así como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario). iv) Después de lavar con PBS, se depositan en la dilución de trabajo del conjugado monoclonal respectivo dos cortes, y otros dos en la dilución de trabajo del conjugado policlonal (controles). v) Se incuba durante 1 hora a 37 C en una cámara húmeda. vi) Se lavan seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez. vii) Se tiñen los cortes con una solución recién preparada de cromógeno del substrato 1 durante 5 15 minutos a temperatura ambiente. viii) Se lavan los cortes con acetato sódico 0,05 M, ph 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para microscopía. ix) Se examinan las secciones en un microscopio de fondo claro. La tinción del citoplasma de las células del epitelio de las criptas de las amígdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo. x) Interpretación de la prueba: Anticuerpo policlonal Anticuerpo monoclonal específico para Cepa PPC Cepa PPC vacunal Cepa DVB/EF Interpretación + + Cepa de campo de la PPC Cepa vacunal de la PPC + + Cepa DVB/EF + Otros Pestivirus*, no PPC Se debe considerar siempre la existencia de cepas nuevas de la PPC, y cualquier aislamiento de casos en que se sospeche la PPC debería enviarse al laboratorio de referencia de la OIE. Prueba de captura del antígeno Para un diagnóstico rápido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura del antígeno (ELISA) para investigar en piaras en las que se sospecha que se han infectado recientemente. Las pruebas ELISA son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra varias proteínas víricas en el suero, en la fracción leucocitaria de la sangre o en 1 Solución de cromógeno del substrato A. Solución base de cromógeno: 0,4% de 3-amino-9-etil carbazol; N, N-dimetil-formamida (1 ml). Cuidado, compuesto TÓXICO. Esas dos sustancias con cancerígenas y producen irritación en los ojos, la piel y el aparato respiratorio B. Acetato sódico 0,05 M, ph 5,0; 19 ml (esterilizados por filtración con membrana). C. Solución base de substrato (peróxido de hidrógeno al 30%). Mantener las soluciones base A y C a 4 C en la oscuridad y la solución B a temperatura ambiente. La solución base A puede mantenerse a 4 C durante al menos 6 meses y la solución C 1 año. Inmediatamente antes de su uso, diluir 1 ml de la solución A en 19 ml de la solución B. Añadir después 10 µl de la solución base C. Mezclar bien y teñir los cortes. Manual de la OIE sobre animales terrestres

6 sangre completa anticoagulada; además, se pueden utilizar algunos kits de prueba para probar homogeneizados titulares clarificados (8). La técnica es relativamente simple de realizar, no requiere servicios de cultivo de tejidos, se puede automatizar y se pueden conseguir los resultados en medio día. La desventaja de que es menos sensible que el aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos suaves o subclínicos, puede compensarse probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia. No obstante, debe tenerse también en cuenta la baja especificidad de estas pruebas. La prueba no es apropiada para el diagnóstico de la PPC en un solo animal. b) Aislamiento de virus El aislamiento de virus en cultivos celulares es un método de diagnóstico de PPC más sensible, pero más lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento se realiza mejor en células PK-15, que se dividen rápidamente, y que se siembran sobre cubres simultáneamente con una suspensión de las amígadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras líneas celulares, pero deberían ser por lo menos tan sensibles como las células PK-15. Los cultivos se examinan para focos fluorescentes por IFD después de horas o, después de 4 días de incubación, se fijan por tinción con inmunoperoxidasa. Para fines de diagnóstico, el órgano más adecuado para aislar el virus de los cerdos muertos o sacrificados son las amígdalas. Alternativamente, también se pueden utilizar el bazo, el riñón, el íleon o los nódulos linfáticos. Un procedimiento detallado del aislamiento de virus es el siguiente: i) Se prepara una solución base concentrada 100 veces de glutamina-antibiótico: disolver la glutamina (2,92 g) en 50 ml de agua destilada (solución A) y se esteriliza por filtración. Se disuelve cada uno de los siguientes antibióticos en 5 10 ml de agua destilada estéril: penicilina (10 6 Unidades Internacionales [UI]; estreptomicina (1 g); mycostatín ( U); polimixina B ( U); y kanamicina (1 g). Se juntan estas soluciones (solución B). Se mezclan asépticamente las soluciones A y B, y se completa hasta 100 ml con agua destilada estéril y se guarda a 20 C en alícuotas de 5 ml. La constitución exacta del antibiótico no es definitiva siempre que se consiga la esterilidad y las células no estén afectadas. ii) Se cortan en trozos pequeños 1 2 g de tejido y se machacan en un mortero u otro aparato con arena estéril y un pequeño volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homogénea. Alternativamente, se puede utilizar una trituradora a 4 C. iii) Se hace una suspensión al 20% (p/v) añadiendo solución salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio mínimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensión, se añade 1 ml del base de glutamina-antibiótico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente hasta 1 hora. iv) Se centrifuga a g durante 15 minutos v) Se tripsiniza una monocapa de células PK-15, se centrifuga la suspensión celular a 160 g durante 10 minutos y se resuspende para que contenga aproximadamente células/ml en medio de cultivo (MEM de Eagle con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y de anticuerpos contra pestivirus; y 0,2 ml de la solución stock de glutamina-antibiótico por cada 10 ml de la suspensión celular). Como guía, una botella de 75 cm 2 dará aproximadamente 50 ml de suspensión celular a una concentración adecuada. vi) O bien: Inoculación con la suspensión. Se mezclan nueve partes de la suspensión celular (del paso (v)) y una parte del sobrenadante (del paso (iv)) y se inocula 1,0 1,5 ml en 6 8 tubos Leighton con cubres, o en otros recipientes apropiados de cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con solo 1,0 1,5 ml de suspensión celular. Después de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres tubos como controles positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminación con esta suspensión vírica positiva. También deben prepararse cultivos negativos. Se incuba a 37º. O: Inoculación por monocapas preformadas: para cada tejido, inocular 1,0 1,5 ml de suspensión de células (preparadas como en el paso (v)) en 6 8 tubos de Leighton con cubres u otros frascos de cultivo celular apropiados. Se Incuba a 37 C durante un mínimo de 4 horas y un máximo de 36. Luego se escurre el medio, se inocula 0,2 ml de líquido sobrenadante (del paso (iv)), se incuba durante 1 hora a 37 C, se lava y se recubre con 1 ml de medio de crecimiento y se incuba a 37 C. vii) En los días 1, 2 y 3 post-inoculación, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan con acetona fría (de grado analítico) durante 10 minutos, y se tiñen con un conjugado directo anti- 6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

7 CSFV a la dilución de trabajo apropiada, o bien se tiñen indirectamente, como se describe en la Sacción B.1.a. Si la suspensión de amígdalas al 2% resulta tóxica para las células, la prueba debe repetirse utilizando una dilución mayor u otro órgano. El uso del método en el que se emplean monocapas preformadas (indicado antes) nos ayudará a evitar la repetición de la prueba. viii) Después de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, ph>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia. En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden usarse también para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulación de fondo plano o placas M24. En tal caso, las placas se fijan y se tiñen como se describe más adelante para la prueba de neutralización ligada con peroxidasa (NPLA). La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clínicamente enfermos es una muestra adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fracción de leucocitos u otros componentes, pero por razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (10). El procedimiento es el siguiente: i) Se congela una muestra de sangre completa a 20 C y se descongela en un baño a 37 C. ii) Se inoculan 300 µl de sangre hemolizada en una monocapa de células PK-15 crecidas hasta un 75% de confluencia 2 en una placa M24, y se permite la adsorción durante 1 hora a 37 C. iii) Se elimina el inóculo, se lava la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y se añade medio de cultivo. iv) Después de una incubación de 3 4 días, las placas se lavan, se fijan y se tiñen, como se describe más adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 µl para compensar la mayor superficie celular. Nota: este método es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la detección de PPC aguda. Reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa Se han descrito muchos métodos de (RT-PCR) y otros se están aún desarrollando (20). Este método aceptado internacionalmente es rápido y más sensible que los ELISA de captura de antígeno, el aislamiento vírico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado para el diagnóstico preclínico. Se han descrito varios protocolos de PCR convencionales y en tiempo real (14, 20, 24, 26, 27) y se puede obtener un protocolo adecuado en la literatura o en los laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (véase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres). Debido a su rapidez y sensibilidad, la RT-PCR posee un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de enfermedad y está aceptada por varios países y por la Unión Europea (1). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que pueden ocurrir resultados positivos falsos debidos a la contaminación del laboratorio así como resultados negativos falsos debidos a los inhibidores contenidos en la muestra. Cualquier resultado positivo de brotes deberían confirmarse siempre con otras pruebas. Es obligatorio incluir un número adecuado de controles positivos y negativos en cada serie; también es recomendable que se incluyan controles internos. Para posteriores detalles sobre las técnicas de PCR, véase el capítulo Validación y control de calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva así como a órganos sólidos, y se ha utilizado con éxito para controlar brotes. La epidemiología molecular de la PPC se basa en la comparación de diferencias genéticas entre los virus aislados. La amplificación del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciación nucleotídica es el método más simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiológicos moleculares (23). Se han estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la región 5 no codificante (5 NCR) del genoma (150 nucleótidos) y la otra en el gen de la glicoproteína mayor E2 (190 nucleótidos). En resumen, el método usado consiste en extraer el ARN vírico de cultivos de células PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar una o ambas zonas dentro de 5 NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotídica de los productos y comparar con la información acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para 2 La inoculación simultánea, aunque ligeramente más sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir con la adhesión de las células a la superficie. Manual de la OIE sobre animales terrestres

8 investigación epidemiológica molecular. Se debe obtener un permiso de importación antes de su envío. Recientes descubrimientos sobre el análisis de secuencias de los pestivirus de los rumiantes destacan la necesidad de analizar múltiples regiones con el fin de clasificar las cepas por este método (15). 2. Pruebas serológicas La detección de los anticuerpos específicos contra el virus es útil cuando se sospechan infecciones con cepas de PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21 días post-infección. Las investigaciones serológicas dirigidas a detectar focos residuales de infección, especialmente en piaras de producción, pueden ser también útiles para la erradicación de PPC en una fase terminal. Como la incidencia de la infección con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cría, solo resultan útiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberían confirmarse por pruebas NV comparativas. Las pruebas de neutralización se realizan en cultivos celulares utilizando un método virus constante/suero variable. Como el CSFV no es citopático, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras su multiplicación, por un sistema indicador. La NPLA (29) y la prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (18) son las técnicas más ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema NPLA es actualmente el preferido, es fácil de leer y tiene la ventaja de que puede determinarse mediante el uso de un microscopio de luz invertida, aunque puede realizarse a simple vista una primera valoración del título. a) Prueba de la neutralización ligada a la peroxidasa (prueba obligada para el comercio internacional) La NPLA se realiza en placas de microtitulación de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56 C durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilución inicial de suero de 1/5 (dilución final 1/10). Para los programas de seguimiento en un país, puede ser suficiente una dilución al 1/10. En cada prueba deben incorporarse los controles apropiados para asegurar la especificidad y la sensibilidad de las reacciones. Procedimiento de la prueba i) En dos pocillos de una placa de microtitulación se depositan 50 µl de diluciones de suero en medio de crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibióticos). El suero fetal bovino debe estar libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tinción inespecífica). ii) Se añade a los pocillos 50 µl de suspensión vírica, diluida en un medio de crecimiento hasta contener aproximademente 100 DICT 50 /50 µl, y se mezcla el contenido en un agitador de microplacas durante 20 segundos. iii) Se incuban las placas en un incubador de CO 2 durante 1 hora a 37 C. iv) Se añaden a todos los pocillos 50 µl de medio de crecimiento con células/ml. v) Se dejan crecer las células a 37º en una atmósfera con un 5% de CO 2 hasta confluencia, normalmente en 3 4 días. vi) Se elimina el medio de crecimiento y se lavan las placas una vez con NaCl 0,15 M. vii) Se secan las placas en papel absorbente. viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes métodos: Se incuban las placas 45 minutos a 37 C, y luego a 20 C durante al menos 45 minutos. Se sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 µl de paraformaldehido al 4% en PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 5 10 minutos. Se elimina el paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0,15M; o Se incuban las placas a C durante 1 2 horas; o Se fijan las placas en acetona al 80% y se incuban a 70 80º durante una hora; o Se fijan las placas en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total a C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo se 8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

9 obtiene un secado completo después de 3 5 minutos según se observa por el color blanquecino de la monocapa celular). ix) Se añade a cada pocillo 50 µl de un suero porcino hiperinmune contra la PPC o un anticuerpo monoclonal, diluido en NaCl 0,5 M que contiene 1% de Tween ,1 ml de azida sódica, ph 7,6. Incubar a 37 C durante 15 minutos. La dilución de trabajo del antisuero debe determinarse mediante titulación previa: es decir, un suero con un título por NPLA de 1/ puede utilizarse a 1/100. x) Se lavan cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, ph 7,6. xi) Se añaden a cada pocillo 50 µl de un conjugado de Ig-HRPO anti-cerdo o anti-ratón (según convenga), diluido a su dilución de trabajo con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, ph 7,6, y luego se incuba durante 10 minutos a 37 C. xii) Se lavan las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, ph 7,6. xiii) Se añaden 50 µl de solución de cromógeno del substrato a cada pocillo y teñir durante minutos a temperatura ambiente. Esta solución se describe en la Sección B.1.a. Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa. xiv) Se lee la prueba visualmente. Las capas celulares infectadas se tiñen total o parcialmente de color marrón rojizo. Debe examinarse la monocapa por microscopía a baja resolución para determinar el punto final de la titulación. El citoplasma de las células infectadas se tiñe de rojo oscuro. xv) En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de células, de suero positivo y de titulación del virus problema. La titulación del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una concentración entre 30 y 300 DICT 50 / 50 µl. Nota: El tiempo de incubación dado anteriormente es solo como orientación. Para conservar los reactivos, pueden utilizarse tiempos de incubación mayores con diluciones de reactivos adecuadas a dichos tiempos. b) Prueba de neutralización vírica con anticuerpos fluorescentes (prueba prescrita para el comercio internacional) i) Se siembra una suspensión de células PK-15 a una concentración de células/ml en tubos Leighton con un cubre. ii) Se incuban los cultivos 1 2 días a 37 C hasta que alcancen el 70 80% de confluencia. iii) Se inactivan los sueros durante 30 minutos a 56 C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar con una dilución inicial del suero de 1/5 (dilución final 1/10). iv) Se incuban durante 1 2 horas a 37 C volúmenes iguales de suero diluido y de suspensión vírica que contenga 200 DICT 50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml durante 1 2 horas a 37ºC. De esta forma se utiliza una cantidad constante de CSFV de 100 DICT 50 por cada pocillo de reacción. v) Se retiran los cubres de los tubos Leighton, Se lavan brevemente en medio sin suero, Se cubre la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37 C en una atmósfera húmeda. vi) Se colocan los cubres en un tubo Leighton limpio y se incuban los cultivos en un medio de mantenimiento durante dos días más. vii) Se retiran los cubres de los tubos Leighton, se lavan las monocapas dos veces con PBS, ph 7,2, durante 5 minutos cada vez, se fijan con acetona pura durante 10 minutos y se tiñen con la solución de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37 C antes de lavar. viii) Se montan los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, ph > 8,0, y se examinan para flluorescencia. Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulación, se puede seguir el procedimiento para la NPLA (ver más adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tiñen a continuación con la dilución de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37 C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecte la fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de longitud focal larga. En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con el BVDV o el BDV reaccionan a baja dilución en las pruebas FAVN o NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La intensidad de la reacción cruzada depende de la cepa de pestivirus del rumiante que esté implicada y del intervalo entre la infección y el tiempo de muestreo (37). Los altos niveles de anticuerpos que se alcanzan normalmente después de exposición a la infección por PPC, incluso con cepas de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos contra PPC, lo que evita muchas, aunque no Manual de la OIE sobre animales terrestres

10 todas, las reacciones cruzadas (29, 30). En caso de duda continuada, son útiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una cepa de BDV que sean representativas del país o de la región. Las pruebas comparativas de neutralización son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT 50 de cada cepa vírica seleccionada. Las pruebas comparativas se realizan según los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las líneas celulares deben ser adecuadas para el BVDV y el DVB. Los títulos de neutralización se expresan como el inverso de la dilución más alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de tres veces o más entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una infección por la especie de virus que da el título más alto. Para obtener un resultado definitivo, podría ser necesario utilizar diferentes cepas del mismo genotipo, y/o probar varios cerdos de una piara infectada. c) Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional) Las técnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado y se han descrito varias de ellas (por ejemplo: 5, 13, 17, 21, 34). Las pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el sistema de prueba debe asegurar la identificación de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de la respuesta inmune a la infección. Antígeno: El antígeno debe derivar de, o corresponder a, proteínas víricas de una de las cepas recomendadas de CSFV. Las células utilizadas para preparar antígeno deben estar libres de cualquier otra infección con Pestivirus. Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una proteína vírica inmunodominante del CSFV. Los ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM. La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralización al menos 21 días después de la inoculación. La prueba ELISA solo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es específico para la PPC, las muestras positivas deben analizarse además por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por otros pestivirus. El ELISA bloqueante de captación de complejos (5) es un método de un solo paso muy adecuado para utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rápida y fácil de realizar, y detecta anticuerpos contra las cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la infección. Como los MAbs son específicos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captación de complejos detectará anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser más problemáticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmación. Recientemente se ha descrito un nuevo ELISA que utiliza proteínas de fusión derivadas de péptidos víricos (19). Se alega que esta prueba proporciona una mayor sensibilidad y una detección de anticuerpos más rápida que las obtenidas mediante el ELISA convencional, pero, en este momento, se desconoce su reactividad con el anticuerpo causada por diversas cepas de la PPC. Se puede obtener más información sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE. C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC. C1. vacunas con virus vivos modificados Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenúan mediante pases en cultivo celular o en una especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La producción se lleva a cabo en cultivos celulares o en no-suidae basándose en un sistema de lotes de siembra. Este debe ser validado respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad, ausencia de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad. Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el capítulo son de naturaleza general y puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales. 10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

11 El servicio de producción de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prácticas de bioseguridad. Si se utiliza el CSFV para producción de vacunas o para estudios de desafío de las vacunas, la parte del servicio donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contención del Grupo 4 de patógenos como se señala en el capítulo Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones óptimas para la obtención del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer experimentos con curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composición del medio, de la regulación del ph y del contenido atmosférico del CO 2, la concentración inicial de células sembradas, la relación entre la superficie de la capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las células al tiempo de la infección vírica, condición estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicación vírica, etc. Para las vacunas producidas en animales, los factores que deben ser investigados para determinar el máximo de crecimiento vírico y los tejidos a recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamaño del inóculo (número de ID 50 animal [dosis infecciosa del 50%]), patogénesis de la infección, y síntomas clínicos. Cualquiera que sea el método de producción, el substrato debe recogerse en condiciones asépticas y someterse a un ciclo de congelación y descongelación para liberar los virus asociados a las células. Los elementos celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtración o centrifugación a baja velocidad. Se añade un estabilizador, como lactosa, a una concentración final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilización para asegurar un lote uniforme. En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en más de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogéneo. 1. Control del inóculo a) Características del inóculo Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inóculo de siembra deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmación de identidad, esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuación, los experimentos piloto también deben realizarse con muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de siembra probado antes. A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos de 6 8 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al azar si es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual paridad. El virus de siembra debe ser estéril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean específicos contra una cepa virulenta de CSFV en cerdos. b) Método de cultivo La producción se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no pertenezca a la familia Suidae. c) Validación como vacuna i) Pureza La vacuna debe ser virológicamente pura. Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto se repite 3 semanas después utilizando la misma dosis y vía de administración. Se toman muestras de suero 2 semanas después de la última inoculación y se analizan por el método más sensible para ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB, fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, síndrome porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos, teschovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus porcino (tipos 1 y 2) ii) Seguridad Las vacunas deben ser probadas para cualquier efecto patogénico en cerdos sanos y también en cerdos que pueden ser inmunodeprimidos debido a la presencia de infección o medicación concurrente, y también deben probarse para garantizar que la vacuna no atraviesa la placenta en el caso de cerdas preñadas. Manual de la OIE sobre animales terrestres

12 En las pruebas de seguridad en cerdos convencionales, uno de cada diez cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los cerdos se observan durante las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas corporales y se toman muestras de sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se anotan sus pesos en el momento de la inoculación y 2 semanas más tarde. Ningún animal debe morir o mostrar síntomas de enfermedad causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La temperatura diaria media del cuerpo no debe alcanzar o superar los 40,5 C durante el período de la prueba. El aumento diario de peso medio no debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al del grupo control. Se puede despreciar la leucopenia (número de leucocitos < células/ml) si solo ocurre en un cerdo durante 1 día. Para garantizar el debilitamiento, incluso en los cerdos inmunodeprimidos, cada uno de diez cerdos se inmunodeprime mediante inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de peso corporal durante 5 días consecutivos. Al día 3 cada animal se inocula con el equivalente de una dosis de vacuna, y se observa durante las tres semanas siguientes. Ningún animal debe morir o enfermar debido al virus vacunal. Para garantizar la inocuidad en animales preñados, cada una de diez cerdas gestantes de días, se inoculan intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacuna. Otros diez animales de la misma paridad y gestación sirven de control. La vacunación no debe de interferir con la gestación a término, y el número de lechones vivos nacidos del grupo de prueba no debe ser significativamente menor (p<0,05) que el del grupo control. Para ensayos de campo se utiliza un mínimo de 200 cerdos paridos y criados por al menos 20 cerdas, y que sean seronegativos para CSF y BDV. Las camadas se distribuyen del mismo modo en dos granjas por lo menos. La mitad de los lechones de cada camada se inoculan intramuscularmente a los 7 14 días de edad con el equivalente de una dosis de vacuna. Los lechones no inoculados son los utilizados como controles. Todos los lechones se pesan al tiempo de la inoculación y 2 semanas más tarde, y se observan durante 3 semanas. Una tasa de mortalidad que supera el 5% debido a causas ajenas a la vacunación invalida la prueba. Ningún animal debe morir o mostrar signos de la enfermedad debido al virus vacunal. El peso medio ganado por los lechones inoculados no debe ser un 20% menor que el de los controles durante las 2 semanas post-inoculación. iii) iv) Ausencia de transmisión Para confirmar la ausencia de transmisión, se dividen 24 cerdos seronegativos en cuatro grupos iguales. En cada grupo se inoculan cinco cerdos intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacuna. El resto de los cerdos representa los controles. Todos los cerdos se inoculan 6 semanas después como desafío con al menos 10 5 PID 50 (dosis infecciosa del 50% de los cerdos) de una cepa virulenta de CSFV. Todos los animales control deben ser serológicamente negativos al tiempo del desafío, y morir después durante las 3 semanas siguientes. Todos los cerdos vacunados deben permanecer sanos y sobrevivir. Estabilidad de la atenuación Para confirmar la estabilidad de la atenuación vírica, cada uno de dos cerdos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus de lote de siembra equivalente a 100 dosis de vacuna y se sacrifican 6 7 días después. Se juntan las amígdalas de ambos cerdos y se prepara una suspensión al 10% en PBS, ph 7,2. Esto se usa para inocular intramuscularmente otros dos cerdos con 2 ml y luego se sacrifican 6 7 después. Este protocolo se repite 5 veces. Durante estos pases, el tejido de amígdalas se puede guardar a 4 C, si el almacenamiento es menor de 24 horas, o a 70 C por períodos más largos. Al mismo tiempo, la presencia del antígeno de PPC se confirma en cada pase por una prueba directa de IFD en cortes finos de las amígdalas o por aislamiento del virus en un substrato adecuado. Si después de un cierto pase no se puede demostrar CSFV o antígeno, se realiza una segunda serie de pases para mostrar infección, comenzando con los últimos dos cerdos de la serie previa. Se inoculan intramuscularmente cinco cerdos con el sexto pase del virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de vacuna o, si no se ha alcanzado este pase, con el pase más alto de las dos series en que se detectó virus o antígeno vírico. Se inoculan de modo similar cinco cerdos adicionales con una dosis de virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de la vacuna. Todos los cerdos se pesan al mismo tiempo de la inoculación y de nuevo 2 semanas más tarde. Se recoge sangre diariamente con anticoagulante durante la primera semana, y todos los cerdos se mantienen bajo observación durante 3 semanas. Ningún animal debe morir o enfermar por el virus de la vacuna. El peso medio adquirido en los dos grupos durante las primeras 2 semanas no debe diferir significativamente (p<0,05). Cuando mucho, se permite leucopenia (número de leucocitos < células/ml) en un cerdo de cada grupo durante 1 día. 12 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

13 v) Inmunogenicidad Para demostrar una inmunogenicidad adecuada, se inoculan diez cerdos con una cantidad de virus equivalente a una dosis de vacuna cada uno, y otros dos cerdos se mantienen por separado no inoculados como controles. Todos los cerdos se someten una inoculación de desafío 7 días después con 10 5 PID 50 de una cepa virulenta de CSFV. Solo deben morir los controles. En una prueba para establecer la duración de la inmunidad, se inoculan diez cerdos con unas dosis de vacuna cada uno y otros dos se mantienen por separado como control. Seis meses después, los sueros de los cerdos inoculados se prueban para anticuerpos contra PPC; al menos ocho cerdos deben resultar positivos. Todos los cerdos se inoculan después en desafío con al menos 10 5 PID 50 de una cepa virulenta de VPCC y se observan durante 3 semanas. Solo deben morir los controles. Para determinar la protección al desarrollo del síndrome de la cerda portadora, se dividen al azar 20 cerdas grávidas en la misma fase de gestación en dos grupos. Un grupo se vacuna una o dos veces con una cantidad equivalente a una dosis de vacuna, y cuatro semanas después de la última inoculación se inoculan intranasalmente con una cepa de campo de baja virulencia, junto con las cerdas control no vacunadas. Todas las cerdas se sacrifican 4 semanas después y los fetos se examinan para presencia de CSFV o antígeno vírico. La vacunación debería reducir de modo significativo la transmisión transplacentaria del virus. En las condiciones de conservación prescritas por el fabricante para el producto final, un volumen de virus equivalente a una dosis de vacuna debe mantener su inmunogenicidad por lo menos hasta el final de la caducidad que se indique. 2. Método de producción Cada lote de vacuna de tipo MLV contra la PPC debe derivar del mismo lote de inóculo utilizado para las pruebas piloto. Además, cada lote debe prepararse de acuerdo con el protocolo de producción y bajo las condiciones expresadas para registrar el producto final. Las propiedades de cada lote y las del lote de siembra deben ser uniformes. 3. Control del proceso El protocolo de producción dependerá de la cepa vacunal, del sistema de producción (animales o cultivos celulares) y de los servicios disponibles. Las normas para vacunas obtenidas de cultivos celulares pueden variar en función del sistema de producción, es decir, si proceden de cultivos primarios, líneas celulares, monocapas o cultivos en suspensión. 4. Control de lotes Todos los cerdos utilizados en las pruebas de control deben tener 6 8 semanas y estar libres de anticuerpos contra el CSFV o el BVDV. Deben tener un origen, raza, y crianza uniforme y, cuando sea necesario, estar distribuidos en grupos aleatorios. a) Identidad La vacuna debe inducir anticuerpos neutralizantes específicos contra una cepa viruenta de CSFV. b) Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de materiales biológicos se presentan en el capítulo c) Inocuidad Se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis cada uno de la vacuna reconstitiuida, en una única inyección. Los cerdos se observan durante 3 semanas y se toma diariamente la temperatura corporal durante la primera semana. Ningún cerdo debe morir o mostrar síntomas de la enfermedad atribuidos a la vacuna, su temperatura corporal diaria no debe alcanzar nunca los 40,5 C o más, y deben crecer normalmente. d) Pureza El lote debe ser virológicamente puro. Para probar esto, se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis de vacuna cada uno. Se recogen muestras de suero al tiempo de la inoculación y 5 semanas después. Los sueros se prueban para los anticuerpos contra el DVB (neutralización durante 1 hora a 37 C) Manual de la OIE sobre animales terrestres

14 y contra parvovirus porcinos (inhibición de la hemaglutinación utilizando cuatro unidades hemaglutinantes). Los tres cerdos deben permanecer sin enfermedad. No es necesario realizar pruebas para pureza biológica con vacunas producidas en conejos. e) Potencia La potencia se expresa como el número de dosis protectoras del 50% (PD 50 ) contenidas en una dosis de vacuna. Una dosis de vacuna tiene al menos 100 PD 50. Se inoculan intramuscularmente dos grupos de cinco lechones de 6 8 semanas con una dilución 1/40 y 1/160 de la vacuna reconstituida, respectivamente, utilizando solución salina tamponada, ph 7,2. Dos semanas después, los cerdos vacunados y dos cerdos control se inoculan intramuscularmente con 10 5 PID 50 de una cepa virulenta de CSFV como desafío. Los cerdos se observan durante las dos semanas siguientes, período en el que los controles deben morir. Usando métodos estadísticos normales, a partir de los cerdos sobrevivientes que no muestran síntomas de PPC, se calcula el número de PD 50 contenido en la vacuna. La prueba de potencia se puede reemplazar por una prueba de infectividad, siempre que el fabricante pueda demostrar que existe una relación clara y reproducible entre el contenido del virus de la vacuna y la protección que confiere a cerdos en una inoculación de desafío. f) Estabilidad El período de validez de un lote de vacuna liofilizada contra la PPC no debe ser menor de 1 año. C2. Vacunas marcadoras Pese a la existencia de vacunas MLV seguras y eficaces contra la PPC, su uso no ha sido favorecido en la Unión Europea y algunos otros países libres o casi libres de PPC, debido a que los anticuerpos que inducen tales vacunas no pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural. Esta desventaja no se presenta en una vacuna marcadora que permite distinguir entre los animales infectados y los vacunados (DIVA). Es capaz de provocar una respuesta inmune protectora que puede distinguirse de la respuesta inmune inducida por el virus natural. Un prerrequisito adicional de la estrategia de cualquier DIVA es la disponibilidad de una prueba serológica acompañante que es muy discriminatoria para demostrar la ausencia de infección y para el rastreo de infecciones residuales. Las exigencias mínimas para las vacunas marcadoras contra la PPC y las pruebas discriminatorias acompañantes se resumen del siguiente modo (5): a) Vacuna La vacuna debe suministrar protección frente a cualquier contacto con el virus natural (es decir, puede prevenir signos clínicos y la re-excreción del virus). La eficacia de la vacunación debe demostrarse experimentalmente mediante estudios que analicen la transmisión del virus natural en grupos de cerdos vacunados. El efecto protector de la vacunación debe alcanzarse en el menor tiempo posible, preferiblemente antes de 2 semanas. Con preferencia, la protección rápida y fiable debe obtenerse después de una única aplicación. Además, debe asegurarse que la infección de cerdas gestantes vacunadas no ocasiona infección transplacentaria ni el nacimiento de crías con infección congénita por CSFV. La duración de la inmunidad debe ser superior a 6 meses. Hay muchas vacunas marcadoras contra la PPC en fase de desarrollo. En la Unión Europea se han registrado hasta ahora dos. Ambas son vacunas con subunidades, que emplean como inmunógeno la glicoproteína E2 del CSFV y que se han sometido a valoración independiente (9, 32). La subunidad E2 se produce en células de insectos infectados por baculovirus modificados genéticamente, que contienen el gen E2 del CSFV. Las vacunas, por tanto, no contienen ningún CSFV, y el baculovirus vector se inactiva químicamente. La preparación final contiene aceites minerales como adyuvantes para formar una emulsión doble (agua/aceite/agua) o simple (agua en aceite). Varios estudios acerca de la capacidad de las vacunas DIVA E2 para prevenir la transmisión vertical y horizontal, han dado resultados contradictorios (3). b) Prueba discriminatoria en paralelo La prueba serológica discriminatoria en paralelo debe ser muy sensible puesto que la vacunación reducirá la prevalencia de la enfermedad. Lo ideal es que proporcione diferenciación dentro del mismo período de tiempo en lo que se refiere al desarrollo del anticuerpo frente a la proteína inmunizadora y debe ser utilizada 14 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

15 en primer lugar como una prueba en la población. Una sensibilidad elevada reduce la especificidad de la prueba, ya comprometida por la presencia de anticuerpos contra otros pestivirus, por lo que se debe disponer de pruebas confirmativas adecuadas y rápidas para diferenciar los resultados positivos de los positivos falsos. Las pruebas en paralelo DIVA que existen para las vacunas con subunidad E2 son pruebas ELISA basadas en la detección de anticuerpos contra la proteína Erns (12, 16). Tales pruebas se han aprobado recientemente por la Comisión Europea (2) para la determinar si las piaras vacunadas con una vacuna con subunidad E2 también pueden haber estado expuestas al virus natural. Una valoración de su realización (12) revela que ningún ELISA discriminatorio detectó de forma consistente individuos vacunados con marcadores, cerdos destetados desafiados con PPC; de ahí la recomendación de utilizar tal estrategia solamente a nivel de la piara. REFERENCIAS 1. ANON (2002). Commission decision of 1 February 2002 approving a Diagnostic Manual establishing diagnostic procedures, sampling methods and criteria for evaluation of the laboratory tests for the confirmation of classical swine fever (2002/106/EC). Official Journal of the European Union. L39/ ANON (2003). Commission decision of 5 December 2003 amending Decision 2002/106/EC as regards the establishment of a classical swine fever discriminatory test. (2003/859/EC). Official Journal of the European Union. L324/ BLOME S., MEINDL-BOHMER A., LOEFFEN W., THUER B. & MOENNIG V. (2006). Assessment of classical swine fever diagnostics and vaccine performance. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 25, BOUMA A., STEGEMAN J.A., ENGEL B., DE KLUIJVER E.P., ELBERS A.R. & DE JONG M.C. (2001). Evaluation of diagnostic tests for the detection of classical swine fever in the field without a gold standard. J. Vet. Diagn. Invest., 13, COLIJN E.O., BLOEMRAAD M. & WENSVOORT G. (1997). An improved ELISA for the detection of serum antibodies directed against classical swine fever virus. Vet. Microbiol., 59, COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1997). The Use of Marker Vaccines in the Control of Infectious Diseases in Particular, Classical Swine Fever. Report Sci. Vet. Comm. Commission of the European Communities, DGVI, BII2, doc VI/8119, DEPNER K., GRUBER A. & LIESS B. (1994). Experimental infection of weaner pigs with a field isolate of HC/CSF virus derived from a recent outbreak in Lower Saxony. I: Clinical, virological and serological findings. Wien. Tierarztl. Monatsschr., 81, DEPNER K., PATON D.J., CRUCIERE C., DE MIA G.M., MULLER A., KOENEN F., STARK R. & LIESS B. (1995). Evaluation of the enzyme-linked immunosorbent assay for the rapid screening and detection of classical swine fever virus antigens in the blood of pigs. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 14, DEPNER K.R., BOUMA A., KOENEN F., KLINKENBERG D., LANGE E., DE SMIT H. & VANDERHALLEN H. (2001). Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial II. Challenge study in pregnant sows. Vet. Microbiol., 83, DE SMIT A.J., TERPSTRA C. & WENSVOORT G. (1994). Comparison of Viral Isolation Methods from Whole Blood or Blood Components for Early Diagnosis of CSF. Rep. Meeting Nat. Swine Fever Lab. Brussels November. Commission of the European Communities, DGVI/5848/95, EDWARDS S., MOENNIG V. & WENSVOORT G. (1991). The development of an international reference panel of monoclonal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from other pestiviruses. Vet. Microbiol., 29, FLOEGEL-NIESMANN G. (2001). Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial III. Evaluation of discriminatory ELISAs. Vet. Microbiol., 83, HAVE P. (1987). Use of enzyme-linked immunosorbent assays in diagnosis of viral diseases in domestic livestock. Arch. Experimentelle Veterinärmedizin, 41, HOFFMANN B., BEER M., SCHELP C., SCHIRRMEIER H. & DEPNER K. (2005). Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. J. Virol. Methods, 130, Manual de la OIE sobre animales terrestres

16 15. HURTADO A., GARCIA-PEREZ A.L., ADURIZ G. & JUSTE R.A. (2003). Genetic diversity of ruminant pestiviruses from Spain. Virus Res., 92, LANGEDIJK J.P., MIDDEL W.G., MELOEN R.H., KRAMPS J.A. & DE SMIT J.A. (2001). Enzyme-linked immunosorbent assay using a virus type-specific peptide based on a subdomain of envelope protein E(rns) for serologic diagnosis of pestivirus infections in swine. J. Clin. Microbiol., 39, LEFORBAN Y., EDWARDS S. IBATA G. & VANNIER P. (1990). A blocking ELISA to differentiate hog cholera virus antibodies in pig sera from those due to other pestiviruses. Ann. Rech. Vet, 21, LIESS B. & PRAGER D. (1976). Detection of neutralising antibodies (NIF) test: use of new technical equipment for laboratory swine fever diagnosis. In: CEC Seminar on Diagnosis and Epizootiology of Classical Swine Fever. EUR 5486, Lin M. TROTTIER E. & MALLORY M. (2005). Enzyme-linked immunosorbent assay based on a chimeric antigen bearing antigenic regions of structural proteins Erns and E2 for serodiagnosis of classical swine fever virus infection. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12, MCGOLDRICK A., LOWINGS J.P., IBATA G., SANDS J.J., BELAK S. & PATON D.J. (1998). A novel approach to the detection of classical swine fever virus by RT-PCR with a fluorogenic probe (Taq Man). J. Virol. Methods, 72, MOSER C., RUGGLI N., TRATSCHIN J.D. & HOFMANN M.A. (1996). Detection of antibodies against classical swine fever virus in swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope glycoprotein E2. Vet. Microbiol., 51, OGAWA N., NAKAGAWA H., YAMAMOTO H., SAWADA M., HANAKI T. & SAZAWA H. (1973). Viral detection in pigs inoculated with the GPE-strain of hog cholera attenuated virus. Ann. Rep. Nat. Vet. Assay Lab. (Japan), 10, PATON D.J., MCGOLDRICK A., GREISER-WILKE I., PARCHARIYANON S., SONG J.-Y., LIOU P.P., STADEJEK T., LOWINGS J.P., BJORKLUND H. & BELAK S. (2000). Genetic typing of classical swine fever. Vet. Microbiol. 73, PATON D.J., MCGOLDRICK A., BENSAUDE E., BELAK S., MITTELHOLZER C., KOENEN F., VANDERHALLEN H., GREISER- WILKE I., SCHEIBNER H., STADEJEK T., HOFMANN M. & THUER B. (2000). Classical swine fever virus: a second ring test to evaluate RT-PCR detection methods. Vet. Microbiol., 77, RESSANG A.A. (1973). Studies on the pathogenesis of hog cholera. Zentralbl. Veterinarmed. [B], 20, RISATTI G.R., CALLAHAN J.D., NELSON W.M. & BORCA M.V. (2003). Rapid detection of classical swine fever virus by a portable real-time reverse transcriptase PCR assay. J. Clin. Microbiol. 41 (1), RISATTI G., HOLINKA L., LU Z., KUTISH G., CALLAHAN J.D., NELSON W.M., BREA TIO E. & BORCA M.V. (2005). Diagnostic evaluation of a real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of classical swine fever virus. J. Clin. Microbiol 43 (1), TERPSTRA C. (1978). Detection of C-strain virus in pigs following vaccination against swine fever. Tijdschr. Diergeneeskd, 103, TERPSTRA C., BLOEMRAAD M. & GIELKENS A.J.L. (1984). The neutralising peroxidase-linked assay for detection of antibody against swine fever virus. Vet. Microbiol., 9, TERPSTRA C. & WENSVOORT G. (1988). The protective value of vaccine-induced neutralising antibody titres in swine fever. Vet. Microbiol., 16, TERPSTRA C. & WENSVOORT G. (1988). Natural infections of pigs with bovine viral diarrhoea virus associated with signs resembling swine fever. Res. Vet. Sci., 45, UTTENTHAL A., LE POTIER M.F., ROMERO L., DE MIA G.M. & FLOEGEL-NIESMANN G. (2001). Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial I. Challenge studies in weaner pigs. Vet. Microbiol., 83, VANNIER P. & CARNERO R. (1985). Effets pour le porc d un virus propagé par un vaccin contre la maladie d Aujeszky. Point Vet., 17, Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

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