TRAMPEO Y MUESTREO DE PEQUE ÑOS MAMÍFEROS PARA

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1 OPS/HPC/HCT/ ORIGINAL: INGLÉS TRAMPEO Y MUESTREO DE PEQUE ÑOS MAMÍFEROS PARA Departamento de Salud y Servicios Humanos Servicio de Salud Publica ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD Oficina Sanitaria Panamericana, Oficina Regional de la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

2 Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades Director: Dr. David Satcher Centro Nacional de Enfermedades Infecciosas (NCID) Director: Dr. James Hughes Ciencias de Laboratorio (NCID) Director Asociado: Dr. Joseph McDade División de Enfermedades por virus y Rickettsias (DVRD), NCID Director: Dr. Brian Mahy. Sección de Patógenos Especiales, DVRD, NCID Jefe: Dr. C.J. Peters Sección de Zoonosis por virus y Rickettsias, DVRD,NCID Jefe: Dr. James Olson. Oficina de Programa de Práctica de Salud Pública (PHPPO) Director: Dr. Edward Baker División de Sistemas de Laboratorio, PHPPO Director: Dra. Carlyn Collins Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio I. Maiztegui Directora: Dra. Delia Enría Representación de la Organización Panamericana de la Salud/Organización Mundial de la Salud en Chile Representante: Dr. Raúl José Penna Melo La versión original de este Manual fue publicada, en inglés, por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos de América. La coordinación de la producción del Manual en español estuvo a cargo de la Representación de la OPS/OMS en Chile. El texto fue traducido al español en el Instituto Nacional de Enfermedades AGRADECIMIENTOS Queremos agradecer a Barbara Ellis y John O Connor por su meticulosa revisión y sugerencias, que perfeccionaron este manuscrito. Jim Gathany se encargó de las fotografías y Karoyle Colbert hizo los mapas de distribución de especies. Agradecemos también a Diane Small por el diseño de la portada y la edición y a Stacy Howard por coordinar el proceso de publicación del manual.nuestro agradecimiento también a Marcelo Biglierei, Tito Gallardo y José Paura que se encargaron de realizar los mapas de la Argentina y de compaginar la traducción del manuscrito.

3 MÉTODOS PARA TRAMPEO Y MUESTREO DE PEQUEÑOS MAMÍFEROS PARA ESTUDIOS VIROLÓGICOS Este manual fue preparado por las siguientes personas: Dr. James N. Mills Dr. James E. Childs Dr. Thomas G. Ksiazek Dr. C.J. Peters División de Enfermedades Virales y por Rickettsias Centro Nacional de Enfermedades Infecciosas Sr. Wallis M. Velleca. División de Sistemas de Laboratorio Esta versión en español es una copublicación de las siguientes instituciones: Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos de América Servicio de Salud Pública Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades Insituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio Maiztegui de la República Argentina Organización Panamericana de la Salud Oficina Sanitaria Panamericana, Oficina Regional de la Organización Mundial de la Salud Febrero de 1998

4 Este manual fue traducido al español por: Gladys E. Calderón Instituto nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio I. Maiztegui Pergamino, Provincia de Buenos Aires República Argentina

5 Prefacio de la Organización Panamericana de la Salud A partir de 1993, año en que se desencadenó un brote de infección por virus hanta en el suroeste de los Estados Unidos de América, se han notificado infecciones humanas por ese agente en Argentina, Canadá, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay. Además, desde que se dispone de métodos específicos, se ha hecho el diagnóstico retrospectivo de la infección por este agente en varios países. En la 40 a Reunión del Consejo Directivo se aprobó una Resolución con respecto al virus hanta mediante la cual se exhorta a los estados miembros a que intensifiquen las medidas de vigilancia para la detección del síndrome pulmonar producido por los hantavirus; fortalezcan la capacidad para establecer acuerdos y mecanismos de colaboración entre los países para desarrollar la red de laboratorios destinados al diagnóstico de esta patología; promuevan la investigación interdisciplinaria e intersectorial sobre la ecología de la infección con el objeto de definir medidas de prevención adecuadas a las realidades epidemiológicas, y que estimulen, por medio de la información, la educación y comunicación a todos los niveles de la comunidad, la adopción de buenas prácticas de saneamiento ambiental. Esperamos que este documento sirva a los Países Miembros para cumplir con la Resolución mencionada anteriormente y que contribuya a la investigación y a la vigilancia de las enfermedades infecciosas transmitidas por La versión original de este Manual fue publicada en inglés por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos de América. La publicación fue traducida al español en el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio I. Maiztegui, en colaboración con el Programa de Enfermedades Transmisibles de la Organización Panamericana de la Salud. Stephen Corber Director, División de Prevención y Control de Enfermedades

6 PREFACIO Las enfermedades infecciosas siguen siendo la causa principal de defunción entre los humanos en todo el mundo, a pesar de los grandes avances médicos logrados durante la segunda mitad de este siglo. Muchas enfermedades infecciosas han sido reconocidas como amenazas para la salud humana; otras, las emergentes, se han identificado solo recientemente. Un número significativo de estas enfermedades se clasifica como zoonosis, debido a que los animales constituyen su reservorio natural. La incursión continua del ser humano en los ecosistemas naturales, y los cambios que ésta produce en dichos sistemas, probablemente llevarán a encuentros más frecuentes con conocidos como de agentes infecciosos aún no identificados. La vigilancia continua e intensa es uno de los instrumentos más útiles para reconocer y reducir al mínimo el impacto de los brotes de enfermedades infecciosas. Con respecto a las infecciones zoonóticas, la vigilancia puede llevarse a cabo por medio del seguimiento de las poblaciones que les sirven de reservorio. Los datos que se obtengan sobre la prevalencia de infección y las características de las especies que sirven de reservorio pueden utilizarse para evaluar el riesgo de enfermedad y disminuir o prevenir los brotes de enfermedades que afectan al ser humano. El brote de síndrome pulmonar por hantavirus (SPH) que surgió en 1993 en el sudoeste de los Estados Unidos de América es un ejemplo del tipo de encuentro entre el ser humano y un agente no identificado anteriormente. Ese episodio tuvo una tasa de letalidad de 70% entre una población de adultos predominantemente jóvenes y sanos. Se determinó que el agente etiológico había sido el virus Sin Nombre, cuyo reservorio es Peromyscus maniculatus o ratón campestre, que a su vez es uno de los roedores más corrientes y difundidos en América del Norte. Es necesario realizar estudios epidemiológicos y ecológicos de las poblaciones de roedores para determinar la amenaza a la salud pública y para ayudar a establecer pautas para la reducción de riesgos. También son ejemplo de virus transmitidos por roedores los miembros de la familia Arenaviridae, los cuales causan fiebres hemorrágicas y otras enfermedades en humanos en todo el mundo. El propósito de este manual es brindar una guía para aquellas personas involucradas en estudios ecológicos y epidemiológicos con poblaciones de roedores potencialmente infectados con hantavirus. Los procedimientos detallados en estas normas son también apropiados para estudiar otras poblaciones de pequeños mamíferos que puedan contener un agente infeccioso capaz de causar enfermedad o muerte. Este manual cubre los siguientes puntos en detalle: selección de sitios apropiados de recolección; métodos de trampeo para obtener una muestra representativa de la población de roedores; manejo, funcionamiento y colocación de trampas para pequeños mamíferos, técnicas seguras para trampeo y manejo de roedores; selección apropiada de fluidos y tejidos y métodos detallados para la obtención de las mismas; conservación, embalaje y envío apropiado de los especímenes al laboratorio; limpieza y descontaminación eficaz de trampas y otros materiales; descarte de desechos infecciosos; recolección y registro cuidadoso de todos los datos pertinentes. Para una mejor comprensión de estas técnicas, este manual incluye fotografías en blanco y negro. En los anexos se proveen modelos de formularios que pueden ser adaptados a programas específicos. Es nuestro deseo que la información contenida en este manual brinde asistencia a aquellos investigadores involucrados en la captura y manejo de pequeños mamíferos y facilite los esfuerzos de vigilancia necesarios para controlar y prevenir la diseminación de enfermedades infecciosas.

7 CONTENIDO CONTENIDO INTRODUCCION...1 SEGURIDAD...7 Desinfectantes...7 Ropa protectora y equipo...8 Seguridad respiratoria...9 Captura y transporte de los roedores...9 Selección del sitio de procesamiento...9 Productos químicos peligrosos...10 Anestesia...10 Obtención de muestras de sangre...11 Autopsia...11 Limpieza...12 Embalaje y envío de especímenes...12 Otros agentes infecciosos...12 PROTOCOLO PARA TRAMPEO Y PROCESAMIENTO...15 COLOCACIÓN Y CONTROL DE TRAMPAS...15 EQUIPO Y MATERIALES...15 PROCEDIMIENTO...15 Preparación para la expedición de trampeo...15 Colocación de trampas...16 Recolección de los roedores capturados...17 PROCESAMIENTO DE ROEDORES CAPTURADOS...19 EQUIPO Y SUMINISTROS...19 PROCEDIMIENTO...20 Selección del sitio de procesamiento...20 Obtención de sangre de los roedores capturados...20 Obtención de datos reproductivos y medidas estándar de roedores...26 La autopsia de los roedores capturados...26 Descontaminación de las trampas...29 Limpieza...29 Envío de muestras para pruebas de hantavirus...30 Preparación de especímenes y archivo...32 BIBLIOGRAFIA...33 ENFERMEDAD POR VIRUS HANTA EN LA REPUBLICA ARGENTINA...37 ENFERMEDAD POR VIRUS HANTA EN CHILE...41 ANEXOS...45 Lista de verificación de materiales...47

8 Documentación para el transporte de materiales peligrosos...49 Formulario de recuento de trampas...51 Hoja de datos de evaluación del hábitat...53 Lista de verificación para preparación del procesamiento...55 Planilla de datos de autopsia...57 Planilla de datos de autopsia. Explicación de términos...59 Provedores de equipo especial para captura y procesamiento de roedores...61 Instrucción de embalaje

9 INTRODUCCIÓN En la primavera y verano de 1993, un gran número de casos humanos de síndrome de insuficiencia pulmonar en el sudoeste de los Estados Unidos de América llamó la atención de las autoridades de salud pública (Childs et al. 1994, Duchin et al. 1994, Fourcar et al. 1994, Nichol et al. 1993). La evolución rápida de la enfermedad, el hecho de que afectara a adultos jóvenes previamente sanos y la alta tasa de letalidad (inicialmente cerca de 70%) fueron alarmantes. Los esfuerzos realizados por un gran número de organizaciones, incluso departamentos de salud locales y estatales, universidades, el Servicio de Salud de las Poblaciones Indígenas, la División de Salud del Pueblo Navajo y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), condujeron a una rápida identificación del agente infeccioso y de su mecanismo de transmisión. El microorganismo causante de la enfermedad fue identificado como un hantavirus que infecta a los roedores de la zona. El virus fue aislado en cultivo de tejido y se denominó virus Sin Nombre (SNV). La enfermedad humana asociada ha sido denominada síndrome pulmonar por hantavirus (SPH) (Elliot et al. 1994). El reservorio principal en el sudoeste norteamericano es el ratón de la especie Peromyscus maniculatus. La enfermedad humana por hantavirus no es nueva. Un hantavirus transmitido por Apodemus agrarius (ratón campestre rayado) causó alrededor de 3000 casos de fiebre hemorrágica coreana entre las tropas de las Naciones Unidas durante la guerra de Corea. El agente etiológico de esa enfermedad fue aislado en 1976 y se denominó virus Hantaan, por el río del mismo nombre que atraviesa la zona endémica de la enfermedad (Lee et al. 1978). A partir del primer aislamiento, se han descrito al menos otros tres hantavirus en otras especies de roedores en Asia y Europa (cuadro 1). Las enfermedades causadas por estos virus están agrupadas bajo el nombre de fiebres hemorrágicas con síndrome renal (FHSR), y sus manifestaciones varían desde una insuficiencia renal leve hasta un paro renal completo acompañado de síndrome de filtración capilar y manifestaciones hemorrágicas. En los Estados Unidos, sólo recientemente se empezó a sospechar la presencia de enfermedad por hantavirus. El virus Seúl, que causa FHSR en Corea y China, posiblemente se introdujo en ciudades portuarias de los Estados Unidos por medio de su huésped principal, la rata Noruega (Rattus norvegicus). El virus se encuentra ahora en poblaciones de ratas en la mayoría de las grandes ciudades de todo el mundo (LeDuc et al. 1986), y hay pruebas de que en los Estados Unidos puede causar enfermedad aguda y predisponer a los individuos a enfermedad renal crónica (Glass et al. 1993, 1994). El virus Prospect Hill (PHV), aislado en los inicios de Microtus pennsylvanicus), representa el primer hantavirus autóctono de América del Norte (Lee et al. 1985). Se ha encontrado PHV en 25% de los ratones de pradera sometidos a pruebas serológicas (Childs et al. 1988, Yanagihara et al. 1987). A pesar de que se han detectado anticuerpos para PHV en el suero de mamálogos profesionales (Yanagihara et al. 1984), no se conocen casos de enfermedad humana. Sin embargo, estos resultados deberán ser reconsiderados en vista de los recientes descubrimientos de otras cepas de hantavirus en los Estados Unidos y de la marcada reacción cruzada de estas cepas por prueba de inmunofluorescencia y enzimoinmunoensayo. Se cree que el virus Sin Nombre no es una cepa de evolución reciente y que la enfermedad de roedores y humanos no es nueva. Se ha encontrado considerable variación genética entre cepas de SNV que infectan poblaciones de P. maniculatus y que se encuentran distantes geográficamente, lo cual indica que el virus ha sido endémico por muchos años entre poblaciones de roedores y ha sufrido cambios genéticos importantes. (Nichol et al. 1993, Spiropoulou et al. 1994). Se han encontrado pruebas de infección por SNV en sueros de poblaciones de P. maniculatus obtenidos en los inicios de la década de Los casos humanos de SPH han sido identificados retrospectivamente por immunohistoquímica o a partir de bloques de tejidos conservados, obtenidos incluso en 1978 (Goodman et al. 1994); un caso fue inferido a partir de la historia de la enfermedad y por serología de 1959.

10 Cuadro 1. Roedores como huéspedes primarios, su distribución y asociación con enfermedad humana de los hantavirus más importantes identificados. Virus Distribución Huésped primario Enfermedad humana Hantaan Asia, Rusia Apodemus agrarius FHSR grave Seúl En todo el mundo Rattus norvergicus FHSR leve o moderada Dobrava/ Belgrado Balcanes Apodemus flavicollis FHSR grave Puumala Escandinavia Europa, Clethrionomys glareolus FHSR leve Rusia, Balcanes Prospect Hill América del Norte Microtus pennsylvanicus Se desconoce Sin Nombre América del Norte Peromyscus maniculatus SPH Black Creek Canal Sudeste de Estados Unidos Sigmodon hispidus SPH New York-1 Este de los Estados Unidos Peromyscus leucopus SPH El Moro Canyon Oeste de los Estados Unidos Reithrodontomys magalotis Se desconoce Bayou Sudeste de los Estados Oryzomys palustris SPH Unidos Bloodland Lake América del Norte Microtus ochrogaster Se desconece Isla Vista Oeste de Estados Unidos Microtus californicus Se desconece Rio Segundo Costa Rica Reithrodontomys megalotis Se desconece Caño Delgadito Venezuela Sigmodon alstoni Se desconece Juquitiba Brasil Se desconece SPH Rio Mamore Bolivia/Peru Oligoryzomys microtis Se desconece Laguna Negra Oeste de Paraguay Colomys laucha SPH Andes Sudoeste de Oligoryzomys longicaudatus SPH Argentina/Chile Lechiguana Argentina Central Oligoryzomys flavescens SPH Bermejo Noroeste de Argentina Oligoryzomys chacoensis Se desconece Oran Noroeste de Argentina Oligoryzomys longicaudatus SPH Maciel Argentina Central Bolomys obscurus Se desconece Pergamino Argentina Central Akodon azarae Se desconece

11 El principal reservorio de SNV en los Estados Unidos es Peromyscus maniculatus. Otras especies de Peromyscus pueden servir como huéspedes competentes, y varias otras especies, incluso de ardillas listadas (Tamias spp.), han presentado anticuerpos para hantavirus (Childs et al. 1994). A pesar de que la infección por hantavirus no parece afectar la salud de los huéspedes roedores, estos pueden desarrollar infecciones crónicas a lo largo de la vida con eliminación de virus en la orina, materia fecal y saliva (LeDuc 1987). El principal modo de infección a las personas es a través de la inhalación de virus en aerosoles (Tsai 1987). Los aerosoles infecciosos pueden ser generados con la eliminación de orina o a partir de secreciones respiratorias. También pueden producirse aerosoles secundarios al remover materiales contaminados como tierra, basura o nidos de animales. Estos aerosoles presentan riesgo particular en espacios cerrados. Las condiciones ideales para la transmisión del virus a humanos se dan cuando los individuos cohabitan con roedores infectados o mientras realizan la limpieza de edificaciones infestadas por roedores. A no ser que se tomen precauciones de bioseguridad apropiadas, también tiene riesgo de infectarse el personal que manipula roedores que han estado confinados en trampas pequeñas, o el que toma muestras de sangre o tejido de roedores infectados. Algunos datos preliminares indican que los biólogos que trabajan en el terreno tienen mayor riesgo de contraer SPH. De los 118 casos confirmados de SPH en los Estados Unidos, 3 afectaron a biólogos de fauna silvestre o a mamálogos (Armstrong et al. 1994). En Canadá, uno de los tres primeros casos identificados de SPH fue un biólogo de fauna silvestre que estaba trabajando con mamíferos (LCDC 1994). Los hantavirus relacionados con el SNV han sido identificados en zonas de los Estados Unidos donde no se encuentra P. maniculatus. En Louisiana, la secuenciación genética de virus recuperado de una persona con SPH indicó que su infección correspondía a un hantavirus que no era SNV (Khan et al. 1995). En Florida, un caso aparente de SPH llevó a que se estudiaran las especies de roedores de la zona y al aislamiento de un tercer hantavirus autóctono de Sigmodon hispidus (rata algodonera) (Rollin et al. 1995). Se han identificado otras cepas de hantavirus por la reacción en cadena de la polimerasa a partir de Reithrodontomys megalotis en Nuevo México y Microtus californicus en California (Hjelle et al. 1994, B. Hjelle, comunicación personal). Una cepa de hantavirus muy similar a SNV fue identificada en un caso fatal de infección adquirida en Nueva York o Rhode Island; y se aisló una cepa similar de Peromyscus leucopus (ratón de pata blanca) capturado en Nueva York (Song et al. 1994). En el Nordeste de los Estados Unidos se hallan poblaciones de P. leucopus con anticuerpos que reaccionan a SNV. P. maniculatus es uno de los roedores más ampliamente distribuido en América del Norte (figura 1a). En su mayoría, ocupa todos los hábitats terrestres de América del Norte, excepto el sudeste y la costa atlántica. Las pruebas P. maniculatus está infectada con SNV en gran parte de la zona que habita en los Estados Unidos. P. leucopus se encuentra en la mitad oriental de los Estados Unidos, excepto en el extremo sudoriental (figura 1b). S. hispidus se encuentra en el sudeste y región sudcentral de los Estados Unidos y se extiende hacia el norte de M. pennsylvanicus se encuentra principalmente hacia el norte de los Estados Unidos y Canadá (figura 1c) y R. megalotis, en gran parte del oeste de los Estados Unidos (figura 1d). En los Estados Unidos, los hantavirus son de importancia para la salud pública dada su alta tasa de letalidad entre los pacientes que desarrollan SPH (cerca de 40%). Es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos y ecológicos de poblaciones de reservorios para determinar la amenaza a la salud pública y para ayudar a elaborar normas para disminuir el riesgo. Estos estudios deberán dirigirse a los siguientes aspectos: 1. El potencial de que se presenten casos humanos de SPH en diferentes zonas de los Estados Unidos; 2. La prevalencia, incidencia y patrones temporales de infección en las especies reservorio; 3. El efecto del clima, calidad del hábitat y dinámica de la población huésped en el ciclo de transmisión; 4. Los modos de transmisión entre poblaciones de reservorios y de roedores a humanos; 5. Los efectos de la infección sobre los movimientos, longevidad y dinámicas de población del huésped; 6. La identificación de otros hantavirus que puedan causar enfermedad, sus huéspedes y su distribución 7. Métodos para disminuir el contacto entre roedores infectados y humanos, y

12 8. La relación entre densidad de población del reservorio, actividad viral e incidencia de enfermedad en humanos. Para estos estudios será necesario seleccionar sitios de colección apropiados, métodos de trampeo que provean una muestra representativa de la población de roedores; técnicas seguras de trampeo y manejo de roedores y colección adecuada de especímenes; adecuada conservación, empaquetamiento y envío de especímenes al laboratorio; descontaminación y limpieza correcta de trampas y otros materiales; descarte apropiado de desechos infecciosos y colección y registro cuidadosos de todos los datos. Este manual es una guía para aquellas personas que llevan a cabo estudios ecológicos y epidemiológicos con poblaciones de roedores que tienen el potencial de estar infectados con hantavirus. Sin embargo, los procedimientos detallados en este manual son apropiados para cualquier estudio de poblaciones de pequeños mamíferos que involucre un agente zoonótico infeccioso que puede causar alta mortalidad. Los protocolos descritos aquí han sido aprobados por el comité de cuidado y uso de animales de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (EUA). Los investigadores que realicen estudios con animales vivos deberán hacer aprobar sus protocolos de investigación por el comité de cuidado y uso de animales de su institución. Además deberán realizar tales investigaciones de acuerdo con los lineamientos federales (NIH 1985), el Acta Federal de Bienestar Animal (P.L ), así como las enmiendas P.L y P.L ) y el Acta de Especies Comprometidas (P.L ), y otras leyes, reglamentos o políticas locales y estatales aplicables.

13 Peromyscus maniculatus Sigmodon hispidus Ambas especies Figura 1. (a) Distribución de Peromyscus maniculatus, reservorio del virus Sin Nombre y Sigmodon hispidus, reservorio del virus Black Creek Canal. Los triángulos indican la ubicación de los 118 casos de SPH identificados hasta el 6 de septiembre de (b) Peromyscus leucopus, probable reservorio del virus New York-1.

14 Figura 1. (c) Distribución de Microtus pennsylvanicus, reservorio del virus Prospect Hill. (d) Distribución de Reithrodontomys megalotis reservorio del virus Moro Canyon. Distribución de roedores basada en W.H.Burt y R.P. Grossenheider, Guía de mamíferos silvestres. 3 edición. Houghton Mifflin, Boston 1976.

15 SEGURIDAD Se supone que la vía principal de infección humana con hantavirus es por inhalación de virus en aerosol, eliminado por orina, materia fecal y saliva de los roedores infectados. La exposición a roedores infectados en ambientes cerrados es particularmente peligrosa. Se detectaron casos de FHSR (fiebre hemorrágica con síndrome renal) en personas que estuvieron expuestas durante pocos minutos en cuartos que contenían animales infectados o en laboratorios de investigación (Tsai 1987). Se han detectado varios casos de SPH (síndrome pulmonar por hantavirus) en personas que han estado trabajando o viviendo al interior de ambientes con roedores. El contacto de membranas mucosas, conjuntiva o lesiones cutáneas con virus o material potencialmente infectado puede conducir a la infección humana, al igual que las mordeduras de roedores. La manipulación u obtención de muestras de sangre o tejido de animales vivos o recién muertos son fuente de exposición al virus presente en esos medios. Las medidas profilácticas más importantes que puede tomar el personal que realiza capturas, procesamiento, sangrado y disección de roedores es conocer las rutas potenciales de infección y evitar las situaciones que conduzcan a transmisión (CDC 1993). Las principales precauciones incluyen: reducir al mínimo la exposición a las heces de los roedores; evitar la creación de aerosoles; usar ropa protectora; anestesiar profundamente a los animales antes de manipularlos, y desinfectar adecuadamente las superficies de trabajo, equipo y ropa. También es necesario usar precaución para manipular muestras congeladas provenientes de animales potencialmente infectados (CDC 1994). Es importante que el personal que realice la captura y procesamiento de los roedores potencialmente infectados conozca el peligro asociado con dichas actividades para reducir al mínimo los riesgos de infección. Antes de iniciar la actividad de captura y procesamiento de roedores, se deberá tomar una muestra de suero de cada uno de los integrantes del equipo (muestra de base), que se conservará a -20 ºC. El personal deberá saber reconocer los síntomas de SPH (Duchin et al. 1994), de modo que todo trabajador que padezca de síntomas dentro de un plazo de 45 días después de la exposición, consulte al médico y le informe sobre las actividades de riesgo realizadas y la posibilidad de infección por hantavirus. La presencia de fiebre y mialgias puede ser suficiente para una primera evaluación. El reconocimiento temprano de la enfermedad y la atención apropiada pueden salvar la vida del paciente. Si el médico sospecha la presencia de infección por hantavirus deberá contactarse con las autoridades de salud pública local. Asimismo, el médico deberá tomar una muestra de sangre del paciente y enviarla junto con el suero de base al departamento de salud para examen de hantavirus. El grupo de trabajo de hantavirus del CDC cuenta con bibliografía adicional sobre reducción de riesgos que se puede obtener llamando al teléfono (404) Desinfectantes Una de las medidas más simples para prevenir la infección por hantavirus es el uso de desinfectantes apropiados. Los hantavirus tienen una envoltura lipídica y son sensibles a soluciones diluidas de hipoclorito (lavandina al 10% o lejía), Lysol de grado hospitalario al 5%, compuestos fenólicos, detergentes y otros desinfectantes de uso doméstico. La estabilidad de los hantavirus en el medio ambiente no está bien determinada, pero los viriones contenidos sobre superficies secas pueden permanecer viables por un período de dos días (J. Huggins et al. datos no publicados). Los desinfectantes deben usarse para: 1. limpiar los guantes de goma después de manipular trampas que contuvieron roedores o que contienen desechos de roedores; 2. descontaminar las trampas que contuvieron roedores o que contienen desechos de dichos animales; 3. limpiar las manos enguantadas después de manipular cada roedor o de realizar una disección y antes de quitarse 4. sumergir y desinfectar los instrumentos utilizados en la disección, y 5. limpiar las superficies de trabajo y otros materiales que puedan haberse contaminado al trabajar con los roedores.

16 Para el uso de cualquiera de los desinfectantes aprobados por el Organismo de Protección del Ambiente (EUA) deben seguirse las instrucciones del fabricante. El Lysol es un desinfectante eficaz, que se mantiene estable por períodos prolongados. En el campo se puede preparar fácilmente una solución al 5% (dilución 1/20 con agua común) y colocarla en recipientes grandes con capacidad para sumergir las trampas tipo Sherman o Tomahawk. Este tipo de descontaminación no alterará el éxito del trampeo posterior si después del contacto con Lysol las trampas se enjuagan adecuadamente. La lejía es un desinfectante económico y fácil de obtener. Una solución al 1% (dilución 1/100) es adecuada para limpiar superficies potencialmente contaminadas. Una solución al 10% es más eficaz para áreas muy sucias o materiales contaminados con materia fecal de roedores o materiales de los nidos de los roedores. Se deberán usar soluciones frescas (preparadas en el día) de hipoclorito; no se recomienda este producto para desinfectar trampas, porque corroe el material. Es práctico usar botellas plásticas con sistema de aerosol para contener el desinfectante en la dilución adecuada; de esta manera se logra una buena dispersión sobre los instrumentos, guantes o superficies de trabajo. Ropa protectora y equipo Para la colocación de trampas limpias se recomienda usar pantalones largos, medias, zapatos amarrados o botas de goma. Una medida de seguridad adicional puede ser el uso de overoles que se quiten después de finalizar el trampeo y procesamiento de los animales. Esta ropa debe lavarse al terminar el día; se deberá también usar guantes de goma gruesa para manipular las trampas que contienen roedores o están potencialmente contaminadas por dichos animales (figura 2). No se aconseja usar guantes de látex puesto que pueden romperse fácilmente al contacto con superficies cortantes de las trampas. Para la manipulación y procesamiento de roedores, el personal debe usar: 1) ropa de cirugía atada en la espalda (camisolín), descartable, u overoles descartables; 2) cubrecalzados (cubrebotas) descartables; 3) dos pares de guantes de látex y 4) respirador con fuente de purificación de aire o respiradores de media cara y anteojos protectores. Los respiradores deberán ser con filtros HEPA (filtros de alta eficiencia). Al finalizar el trabajo (procesamiento de los roedores y limpieza del material y del área de trabajo), el material descartable (camisolines u overoles, guantes y cubrebotas) deberá ponerse en bolsas plásticas bien cerradas y descartarse siguiendo las normas y reglamentos locales. Si la ropa utilizada no es descartable, se deberá sumergir en un desinfectante líquido (procedimiento realizado con guantes) y posteriormente deberá ser lavada con agua caliente y detergente. Con los guantes puestos, se lavarán las manos con un desinfectante o con agua y jabón; luego, se procederá a retirar los guantes y se lavarán las manos con agua y jabón. Se recomienda secar la ropa en máquina secadora en ciclo de alta temperatura o al sol. Figura 2. El personal que recoge las trampas con animales capturados deberá usar camisa de manga larga, botas o zapatos con cordones y guantes de goma gruesa. Las trampas que contienen animales deberán colocarse en doble bolsa plástica para ser transportadas al lugar de procesamiento. Seguridad respiratoria Antes de utilizar un respirador, es indispensable realizar un adiestramiento completo sobre protección respiratoria, que incluya pruebas sobre la eficacia del sello, pruebas de capacidad pulmonar e instrucciones sobre el uso y cuidado del respirador (Ref. 29 CFR , Normas de Protección Respiratoria de la Administración de Salud y Seguridad Ocupacional de los Estados Unidos, OSHA). El departamento local de salud o la oficina de área de la OSHA

17 podrán proporcionar orientación en estos aspectos. Las oficinas de seguridad de la mayoría de las universidades de los Estados Unidos proporcionarán pautas y procedimientos para obtener y usar los respiradores. El principio de los respiradores es que todo el aire inspirado pasa a través del filtro HEPA eliminándose partículas de tamaño muy pequeño. Es indispensable que el respirador esté correctamente ajustado y evitar así el ingreso de aire no filtrado. Existe otro tipo más nuevo de respiradores que eliminan este riesgo, pero es más caro. Consiste en una capucha que cubre toda la cabeza y la cara y, por medio de una batería, genera un flujo contínuo de aire filtrado a través de filtros HEPA. Estos equipos (PAPR, figura 3) son más cómodos que los respiradores de presión negativa, pero también requieren capacitación y mantenimiento apropiados. Captura y transporte de los roedores Las trampas que contienen roedores capturados deberán manipularse con guantes de goma gruesa. No se recomienda el uso de guantes de cuero, debido a que estos no pueden ser descontaminados con desinfectante. Las trampas que contienen roedores deberán ser colocadas inmediatamente dentro de una bolsa plástica doble que deberá cerrarse perfectamente (figura 2). Las bolsas se abrirán solamente cuando se llegue al lugar de procesamiento y con ropa protectora, incluso respiradores. Se deberá tener en cuenta que si se han generado aerosoles, estos se encuentran concentrados en una pequeña área dentro de la bolsa. Las bolsas con los roedores deberán ser transportadas en la parte trasera de una camioneta para proteger a los pasajeros. Si no se dispone de camioneta, los roedores deberán ser transportados en el baúl de un auto. Si las bolsas son transportadas en camioneta, se deberán cubrir con una lona de color claro para proteger a los animales del sol en los días de calor. Selección del sitio de procesamiento Figura 3. Usar equipo de protección para manipular y obtener nuestras de animales capturados. El uso de un respirador, como el PAPR mostrado aquí, Es imprescindible localizar un área adecuada de procesamiento antes de iniciar las actividades de trampeo. El sitio de procesamiento deberá estar ubicado en un sector separado, lejos de la circulación humana, ganado u otros animales domésticos. En condiciones favorables de tiempo, es preferible realizar el procesamiento al aire libre, por la ventilación y para aprovechar el efecto antiviral de la luz ultravioleta natural. Una lona sostenida por tensores protegerá a los técnicos de la lluvia y el sol. Si se debe trabajar adentro, el lugar deberá tener un ventilador o ventanas que permitan ventilar el lugar. La tabla de procesar, las superficies de trabajo, las sillas y el piso deberán ser de un material no poroso que pueda desinfectarse y limpiarse fácilmente. Si el procesamiento se realiza sobre una superficie de madera, ésta deberá cubrirse con un material plástico que facilite la descontaminación. Cuando el trabajo se realiza al aire libre, los trabajadores deberán sentarse con el viento de atrás formando un ángulo de 45º; los animales capturados y contenidos en las bolsas plásticas deberán ser colocados a favor del viento, y los vehículos y equipo contra el viento. Una vez que se han abierto las bolsas que contienen los animales capturados, todo el personal sin protección respiratoria deberá permanecer contra el viento, a una distancia de 10 m, por lo menos, del área de procesamiento. Dicho personal podrá regresar al área de procesamiento solamente después de que haya finalizado el mismo, los materiales contaminados se hayan colocado en bolsas plásticas de bioseguridad cerradas y el área haya sido

18 adecuadamente desinfectada. Si el procesamiento fue realizado en el interior, el piso o lona deberán ser lavados con desinfectante y el área se ventilará durante 30 minutos antes de que el personal ingrese sin respiradores. Productos químicos peligrosos El procesamiento de roedores para estudios de hantavirus también requiere trabajar con agentes químicos que pueden ser peligrosos. Frecuentemente se usa formalina al 10% para fijar y preservar los cadáveres de los roedores. La formalina deberá manejarse con cuidado, porque es un carcinógeno potencial, y se ha de mantener siempre en un recipiente irrompible con cierre hermético. El recipiente no deberá llenarse hasta el tope para evitar que se rebalse cuando se le introduzcan animales durante el trabajo de campo. El personal deberá usar guantes de goma y protección ocular cuando vierta, mezcle o coloque cadáveres de animales en formalina. Este producto se deberá usar en áreas ventiladas y mantener en recipientes debidamente cerrados cuando no esté en uso. Los anestésicos usados en el procesamiento son también potencialmente peligrosos para los trabajadores. Todos los, halotano, cloroformo, éter) deberán usarse en áreas ventiladas y mantenerse en recipientes debidamente cerrados. Los recipientes, a su vez, serán guardados lejos del fuego, así como las bolsas utilizadas para la anestesia, cámaras de anestesia y algodón o gasas embebidas con anestésico. Los derrames deberán ser contenidos inmediatamente. Habrá que tener extremo cuidado cuando se usa cloroformo, puesto que es tóxico y un carcinógeno potencial. El halotano tiene además el potencial de causar daño hepático. El éter es inflamable y explosivo y su uso no se recomienda. No se deben transferir los anestésicos de su recipiente original. Algunos anestésicos por inhalación pueden degradar el plástico y corroer el metal. Deberán tomarse precauciones especiales cuando se trasladan materiales peligrosos tales como cloroformo y formalina. Para mayor información, véanse los reglamentos federales de los Estados Unidos (49 CFR secciones 171 y 172) y las normas sobre cantidades máximas de productos que se pueden Anestesia Los animales no deberán manipularse fuera de las trampas, a menos que se encuentren profundamente anestesiados, según los procedimientos detallados en este manual. Se recomiendan los anestésicos por inhalación más que los inyectables, para evitar el uso de agujas. Se recomienda el uso de metoxiflurano (Metofane ) sobre otros inhalantes tales como halotano, cloroformo, éter o dióxido de carbono, debido a su seguridad y mayor margen terapéutico de error. Asimismo, es menos probable que se administre una sobredosis a los animales y los hará permanecer inconscientes por más tiempo. Si mientras se intenta anestesiar a un animal éste se escapa, los trabajadores no deberán intentar recapturarlo con las manos, puesto que el peligro de mordedura es muy grande. Si el procesamiento se realiza en un recinto cerrado, el animal puede ser recapturado por medio de varias trampas de captura viva o trampas guillotina colocadas durante la noche. Obtención de muestras de sangre El sangrado del plexo retroorbitario es preferible a la punción cardíaca, debido al peligro asociado con el uso de agujas. Se recomienda que todo principiante adquiera la técnica practicando con ratones de laboratorio antes de trabajar con los roedores del campo. Con práctica, la técnica es segura, rápida y provee un volumen de sangre adecuado. Se deberá tomar el tubo capilar heparinizado o pipeta Pasteur, de aproximadamente 1,5 cm, de la parte terminal que entra en la órbita y aplicar una presión suave para evitar romper el tubo. Cuando ha terminado el sangrado, no es necesario expulsar la pequeña cantidad de sangre que puede sobrar en el tubo capilar. Si se usa una pipeta Pasteur, la sangre puede ser expulsada suavemente dentro de un criovial con un bulbo de goma. Se deberá evitar la formación de espuma o burbujas y dejar el último milímetro de sangre en la pipeta para evitar la creación innecesaria de aerosoles. Un animal que empieza a despertarse mientras está sangrando, deberá colocarse inmediatamente en la cámara de anestesia y el trabajo de los técnicos continuará solamente después de que el animal esté profundamente anestesiado. En roedores grandes (por ejemplo ratas), el sangrado retroorbitario puede ser difícil; entre los roedores pequeños, el sangrado Peromyscus) que en otros (Microtus). En ciertas circunstancias, puede ser

19 necesario hacer punción cardíaca para obtener suficiente cantidad de sangre. En tales casos, deberán tomarse precauciones extremas para evitar lesiones por punción con aguja. Los trabajadores deberán usar una jeringa y aguja limpias para cada animal, y nunca se deberá restituir la tapa plástica o sacar la aguja de la jeringa después de su uso. Las jeringas y agujas, después de su uso, deberán descartarse en un recipiente sin rajaduras, de paredes resistentes al paso de agujas u otros elementos punzantes. Más adelante, se detallan las técnicas de sangrado. Si se produce alguna lesión, mordedura o punción que lesione la piel, se debe parar el trabajo que se está realizando y limpiar las manos enguantadas o el área de la lesión con desinfectante. A continuación la persona afectada dejará el área de procesamiento, se quitará los guantes u otra cobertura de la piel, se lavará las manos y se tratará de sacar sangre o fluido de la herida, que se limpiará cuidadosamente con desinfectante. Se deberá informar inmediatamente el accidente al personal médico. Si aparece fiebre y dolores musculares u otros síntomas similares a la influenza en un plazo de 45 días después del accidente, se buscará atención médica y se notificará al médico de la posibilidad de infección por hantavirus. Autopsia Para reducir el peligro de accidentes durante el procesamiento, los técnicos deberán usar tijeras romas para la autopsia de animales muertos. Los guantes deberán ajustarse bien sobre los dedos antes de iniciar la incisión para evitar cortarlos. Una vez que se abre la cavidad abdominal, la tijera no se utilizará más. A menos que por el protocolo de investigación se requiera evitar la contaminación cruzada entre órganos, se puede utilizar un simple par de pinzas de punta roma, sin dientes, para obtener todos los órganos requeridos. También se pueden utilizar las pinzas para tomar y romper el diafragma y tener acceso a la cavidad torácica. Los instrumentos usados deberán colocarse en un recipiente con desinfectante mientras dura el procesamiento o por un mínimo de 15 minutos; seguidamente se deberán limpiar en desinfectante fresco mediante frotado con un cepillo, como se describirá mas adelante. Después de procesar cada animal, todas las gasas o algodones sucios, toallas de papel y otras basuras deberán colocarse en bolsas claramente identificadas como peligro biológico; los guantes, superficies de trabajo y el exterior de los viales que contienen los especímenes deberán limpiarse con desinfectante y toallas de papel antes de procesar el próximo animal. Los cadáveres que no se guarden deberán ser rociados con desinfectante y colocados en doble bolsa plástica para luego incinerarlos. Sin embargo, es preferible sean enviados para certificación de especímenes a un museo. En ese caso deberán ser colocados en formalina al 10% (9 partes de agua y 1 parte de formalina comercial, la cual es una solución de 40% de gas formaldehido en agua) para fijar los tejidos e inactivar cualquier virus. Si los cadáveres no se han abierto para tomar muestras de órganos, deberán abrirse desde la parte inferior del abdomen hasta la parte superior del tórax para que la formalina penetre en todos los tejidos. Es importante no colocar demasiada cantidad de animales en el recipiente en relación con la cantidad de formalina preparada. La relación de volumen de cadáveres a volumen de fijador no deberá exceder 1:2 y los primeros deberán quedar totalmente sumergidos; se permitirá su fijación por 7 días antes manipularlos. Las trampas que contuvieron animales capturados o que fueron visitadas por animales (demostrado por la presencia de orina, materia fecal o materiales de nido) deberán ser descontaminadas antes de volverlas a usar o guardarlas. La descontaminación deberá realizarse sumergiendo las jaulas y cepillándolas en un baño desinfectante, como se describe más adelante en este manual. Los guantes de látex finos pueden cortarse fácilmente con los alambres u otras partes cortantes de la superficie exterior de la trampa, sin que el técnico se de cuenta. Siempre deberán usarse guantes de goma gruesa para manipular las trampas (por ejemplo, al sacudir los animales de la trampa dentro de la bolsa de anestesia y al descontaminar las trampas en baño de desinfectante). Los guantes de goma gruesa pueden ponerse encima de los guantes Limpieza Una vez finalizado el procesamiento de roedores, el área de procesamiento deberá ser cuidadosamente descontaminada, siguiendo paso a paso las instrucciones de la sección de métodos de este manual. Los contactos con un

20 laboratorio local u hospital para que se reciban las bolsas de peligro biológico que contienen basura para descarte deberán hacerse por adelantado, de acuerdo con regulaciones locales y estatales. Solamente se usarán crioviales con tapa de rosca, preferentemente externa (en el anexo 7 figura una lista de proveedores) y con cierre hermético. Cualquier fragmento de sangre o tejido deberá limpiarse de la superficie de los viales con desinfectante y toalla de papel. Los viales deberán ser claramente rotulados con el número de animal y tipo de tejido; luego se colocarán en cajas de congelador u otro recipiente duro y se embalarán con hielo seco, con material de embalaje absorbente, de acuerdo con los procedimientos descritos en este manual. Otros agentes infecciosos Las personas que manipulan pequeños mamíferos y realizan trabajo de campo en zonas de bosques y arbustos corren el riesgo de adquirir muchas infecciones zoonóticas. Las precauciones para prevenir la infección por hantavirus también son eficaces para prevenir la infección por leptospiras o virus de la coriomeningitis linfocitaria, los cuales pueden ser distribuidos por aerosoles o contacto directo con orina infecciosa. La fiebre por mordedura de rata es otra infección sistémica que puede contraerse por la mordedura de un roedor infectado. Esta es otra razón por la cual no se debe intentar capturar con la mano a los roedores que se hayan escapado. Los animales solamente se deben manipular cuando están profundamente anestesiados. Por otra parte, distintas infecciones pueden ser transmitidas por ectoparásitos de los animales (por ejemplo, fiebre de Colorado transmitida por garrapatas, erlichiosis, enfermedad de Lyme, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, tularemia). Es importante hacer lo posible para prevenir picaduras de ácaros o garrapatas y remover rápidamente cualquier ácaro que comience a fijarse. La fijación de ácaros puede reducirse al mínimo usando pantalones largos de colores claros con el puño plegado dentro de las medias, camisa de manga larga, sombrero y zapatos cerrados (Buchstein y Gardner 1991). La ropa, especialmente las medias y los puños de los pantalones y la camisa, puede ser tratada con un repelente para artrópodos, como permetrina. Sin embargo, se deberá evitar la inhalación, ingestión o el contacto de la piel con la permetrina. Al final del día, se deberá realizar una búsqueda cuidadosa de ácaros en todo el cuerpo, especialmente en la ingle, la axila y el cuero cabelludo. Cualquier garrapata que se encuentre se sacará cuidadosamente tomándola con una gasa o pinzas y sin apretarla. El área afectada deberá limpiarse bien con un antiséptico antes y después de quitar la garrapata. Se lavarán las manos. Las personas que trabajan con roedores salvajes en zonas que se encuentran al oeste del meridiano 101º en los Estados Unidos pueden estar expuestas al bacilo de la peste por la picadura de garrapatas infectadas. Las mismas medidas seguidas para prevenir la fijación de ácaros pueden ser útiles para proteger de la garrapata. Cuando se procesan animales, los guantes de látex deberán ponerse sobre el puño de la vestimenta u overol para impedir que las garrapatas lleguen a los brazos. Los trabajadores que están frecuentemente expuestos a animales salvajes deberán estar vacunados contra la rabia. Este manual no trata el tema de procedimientos de laboratorio para la manipulación de sangre y muestras de tejidos potencialmente infectados. Estas muestras deberán tratarse de acuerdo con las prácticas de bioseguridad de nivel 3. Refiérase a CDC (1994a) para protocolos de diagnóstico con muestras de roedores. Todo trabajo de laboratorio que incluya inocular muestras con virus a P. maniculatus u otras especies permisivas deberá ser realizado en un nivel 4 de bioseguridad (CDC 1994b, Mills et al. 1995). Véase CDC y NIH (1993) donde figura una explicación de los criterios de niveles de bioseguridad. Cuando haya especies que son reservorios conocidos o sospechosos de SNV o cepas relacionadas, deberán aplicarse consideraciones especiales para 1) preparar pieles para museos y esqueletos de animales muertos recientemente o congelados; 2) manipular especímenes o tejidos de museo congelados; 3) conducir clases en el terreno para estudiantes de biología de vida silvestre; 4) realizar estudios con marcación y recaptura, y 5) establecer o expandir colonias de laboratorio de roedores salvajes. Estas precauciones y consideraciones se tratan en otra parte (Mills et al. 1995).

21 PROTOCOLO PARA TRAMPEO Y PROCESAMIENTO I. EQUIPO Y MATERIALES COLOCACIÓN Y CONTROL DE TRAMPAS Cebo Jabón de manos Repelente de insectos Guantes de goma gruesa Agua para lavar Cinta adhesiva blanca para rotular Trampas Sherman Tablilla para sostener papeles Marcadores indelebles Trampas Tomahawk Lápices Bolitas de algodón (en tiempo frío) Cinta o bandera deslindadora Papel Formularios para control de trampas Bolso o mochila Manzanas Formularios de evaluación del hábitat Bolsas plásticas para recolección NOTA: El siguiente protocolo describe procedimientos para trampeo de remoción de pequeños mamíferos. Trampeo de remoción significa que los roedores capturados no son regresados al sitio de captura. En estos casos, los animales serán sacrificados y se les hará autopsia para obtener muestras de tejidos de órganos para tratar de realizar el aislamiento viral y otros análisis. Suponiendo que el éxito del trampeo sea de alrededor de 15%, un equipo de dos a tres personas pueden colocar, recolectar y procesar las capturas usando 100 a 200 trampas por noche, durante una expedición al campo de cuatro días (tres noches). II. PROCEDIMIENTO A. Preparación para la expedición de trampeo 1. Con bastante anterioridad al inicio de la expedición de trampeo, se deberán obtener los permisos necesarios y los protocolos aprobados de uso y cuidado de animales. Habrá que obtener anticipadamente información sobre especies en extinción o protegidas en el área de trampeo y aprender a evitarlas o reconocerlas y liberar a estos animales de la captura. También se contactará a los propietarios de las tierras para obtener autorización para realizar el trampeo. 2. Verificar la integridad y funcionamiento del equipo, incluso los respiradores y filtros, trampas y generador de electricidad (si se usa). Cargar las baterías para los PAPR o balanza electrónica, si se ha de usar este equipo. 3. Preparar cebo. Se obtiene un buen cebo con avena arrollada mezclada con una pequeña cantidad de pasta de maní. Se puede usar la avena sin pasta de maní donde las hormigas constituyan un problema. El grano molido también puede ser un buen cebo de uso general (con o sin pasta de maní). 4. Preparar rótulos preimpresos para crioviales. Aunque los viales pueden rotularse con un marcador indeleble y con mínima información (número de animal, fecha, tipo de tejido), es preferible usar rótulos adhesivos que hayan sido impresos previamente con la información deseada por medio de un programa computarizado para preparar etiquetas. Este método disminuye errores de rotulación, aumenta la información disponible, asegura la legibilidad y ahorra tiempo en el campo. Antes de la expedición de trampeo, pueden imprimirse una o varias hojas de etiquetas para cada tipo de tejido, y el número exacto de viales pueden ser rotulados inmediatamente