Métodos moleculares en la identificación eritrocitaria. Dr. Higinio Estrada Juárez Investigador en Ciencias Médicas Hematología Perinatal

Transcripción

1 Métodos moleculares en la identificación eritrocitaria Dr. Higinio Estrada Juárez Investigador en Ciencias Médicas Hematología Perinatal

2 Prevenir en un porcentaje significativo la aloinmunización potencialmente fatal en los receptores de transfusiones requiere una evaluación de los sistemas de grupos sanguíneos ABO y RhD. Siendo, los sistemas Kell, Kidd, y Duffy los clínicamente más significativos Dr. Christoph Gassner, investigador principal del estudio publicado en Transfusion y Jefe de Investigación y Desarrollo del Servicio de Transfusión Sanguínea de la Cruz Roja en Zurich, Suiza.

3 Criterios que definen un grupos sanguíneos El antígeno debe ser definido por un aloanticuerpo humano El antígeno debe ser un carácter heredado El gen que codifica debe haber sido identificado y secuenciado Debe conocerse su localización cromosómica El gen debe ser diferente y no un homólogo estrechamente relacionado a los otros genes que codifican antígenos de grupos sanguíneos de los sistemas existentes.

4 Sistemas de grupos sanguíneos Sistema Alelos Ag Sistema Alelos Ag Sistema Alelos Ag 001 ABO Scianna Raph MNS Dombrock John Milton Hagen PPK Colton I Rh 132, LW Glob Lutheran Chido/Rodgers 3, Gil Kell H RhAg Lewis 53,20, Xk FORS Duffy Gerbich Junior Kidd Cromer Langereis Diego Knops Vel Cartwrigth Indian CD Xg Ok V A C A N T E NCBI dbrbc 27 Marzo 2015 Página web The ISBT Working Party for Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology

5 Los grupos sanguíneos humanos Hasta la década de 1990, el diagnóstico y tipificación de sangre dependían enteramente de técnicas serológicas. Durante más de un siglo, la aglutinación ha sido el estándar de oro para la detección de antígenos eritrocitarios (RBC) y se utiliza en todos los servicios de medicina transfusional.

6 Introducción La reacción entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero/plasma de pacientes o reactivos comerciales) es la base de las técnicas en inmunohematología: Determinación de grupo ABO, Rh. Determinación de antígenos de significancia clínica (Kell, MNS, Kidd, Duffy) Detección de anticuerpos irregulares. Pruebas de compatibilidad. Limitaciones: Fenotipo de pacientes politransfundidos. Fenotipo de pacientes con GR recubiertos de Ig. Identificación de variantes. Discrepancias. Falta de reactivos para detección de algunos antígenos. Dificultad para crear paneles de detección e identificación de anticuerpos irregulares.

7 Introducción Las técnicas que involucran al ADN han llevado a entender las bases moleculares de los sistemas sanguíneos. Los eventos moleculares llevan a la formación de antígenos distintos, y por ende, fenotipos distintos. La mayoría son consecuencia de SNPs. Las técnicas moleculares aprovechan esto para la Genotipificación

8 Utilidades Donadores Para posibles transfusiones de concentrados eritrocitarios (búsqueda de unidades antígeno negativos). Para crear paneles de células para búsqueda de anticuerpos irregulares. Resolución de discrepancias D variantes Discrepancias ABO Materno-fetal Para prevención de EHRN (por incompatibilidad Rh). DNA fetal se puede obtener a partir de células amnióticas, muestras de vellosidades coriónicas y de plasma materno.

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10 Rh SC FY CROM KN GE GLOB MNS Sistema ABO primer marcador genético utilizado I CH/RG RHAG CO YT KEL GIL AB0 RAPH IN DO JMH DI JK LE OK LW LU H P1 XG XK

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12 Los antígenos de los grupos sanguíneos.. son productos génicos!!! Los antígenos son proteínas que están codificados directamente por los genes Los carbohidratos de los son antígenos son controlados por los genes que codifican glicosiltransferasas Los polimorfismos de GS son definidos genéticamente Todos los genes ya han sido secuenciados

13 Mecanismos moleculares de diversidad de los grupos sanguíneos Mecanismo molecular Polimorfismo de un solo nucleótido Deleción Inserción Exón alternativo Eventos de conversión o recombinación génica Ausencia o alteración de la interacción requerida entre proteínas. Presencia de genes modificadores Ejemplo La mayoría de los grupos sanguíneos. T>C en GATA del gen FY (Fya-b-). ag>aa en el fenotipo Jka-b-. RhD negativo por este mecanismo. Exón 2 del GYPC en el fenotipo Yus. RhD negativo 711Cdel. RhD negativo por psudogen RHDΨ 37pb. Duplicación del exon 3 del GYPC en Lsa Gins del ABO que produce Ael. Exón 1 en individuos I negativo. Muchos genes híbridos de los sistemas MNS y Rh. RhAg en Rh nulo tipo regulador y tipo mod. In (Lu) en Lua-b- dominante. Storry JR. BJH 2004;759-71, Daniels G Transplant Immunol 2005;14:143-53, Reid MD 2008; Immunohematol 24(4):166-9

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16 Métodos moleculares para la genotipificación de grupos sanguíneos Rendimiento Bajo Mediano Alto PCR punto final. PCR-RFLP. PCR-SSP. PCR multiplex. Tecnología PCR en tiempo real Secuenciación Sanger y sus modificaciones. BeadChip Luminex XMAP MLPA (Multiplex Ligation-depent Probe Amplification) BloodChip Taqman open Arrays. Genome Lab SNP Stream, Minisecuenciación (SNaPshot assays). MALDI-TOF MS. Secuenciación masiva. Monteiro F y cols. 2011, ISBT Sc Ser 6:1-6

17 PCR Alelo Específico Uso de primers de secuencia específica. Permite la amplificación de secuencias específicas para identificar distintos alelos de un gen. Mixes de reacción pre-alicuotados basados en PCR (Sequence Specific Primers: SSP). Genotipificación rápida. Complemento a tipificación serológica. J. of Mol Diag, 12:4 2010

18 Ensayos basados en PCR clásica (bajo rendimiento) PCR-RFLP AS-PCR o PCR-SSP Multiplex PCR

19 Sin embargo... Los ensayos basados en la PCR son propensos a diferentes tipos de errores. Por ejemplo, la contaminación por la amplificación de productos inespecíficos puede dar lugar a resultados falsos positivos. Se menciona que la identificación de un genotipo particular no significa necesariamente que el antígeno se expresa en la membrana de RBC.

20 Ensayos de mediano rendimiento

21 Real time PCR Variante de la PCR convencional en la cual se puede cuantificar el producto simultáneamente a su amplificación (Detección en tiempo real del producto). Se distinguen entre sí por el método de detección: Fluorocromo no específico. SYBR Green (se une a cualquier molécula de ADN). Fluorocromo específico (sonda): Sondas TaqMan Sondas Molecular Beacons Sondas Scorpion Se cuantifica la fluorescencia emitida

22 Secuenciación tipo Sanger Cuándo secuenciar? Serología Genotipificación Secuenciación

23 MLPA

24 Ensayos de alto rendimiento

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26 Ensayos de alto rendimiento Microarray BeadChip array BloodChip Genome Lab SNP stream Fluidic microarray systems (Luminex XMAP) TaqMan OpenArray MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry) Mini-sequencing

27 Microarreglos Un micorarray de ADN permite llevar a cabo un experimento sobre miles de genes al mismo tiempo. Cada punto en un microarray contiene múltiples hebras idénticas de ADN. La secuencia de ADN en cada punto es único. Cada punto representa un gen. Miles de puntos están dispuestos en filas y columnas ordenadas en una superficie sólida (por lo general vidrio). La ubicación exacta y la secuencia de cada punto se registra en una base de datos informática. Los microarrays pueden ser del tamaño de un portaobjetos de microscopio, o incluso más pequeño.

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30 Genotipificación de 29 polimorfismos (37 fenotipos) Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS, Diego, Dombrock, Colton, Cartwright, y Lutheran Detecta 24 polimorfismos, asociados a 38 variantes de antígenos y fenotipos en un único ensayo.

31 Microarrays Chip de DNA: Son una colección de sets de fragmentos de ADN adheridas de forma ordenada a una superficie sólida. Para genotipificar múltiples regiones del genoma simultáneamente. Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de hibridar con su complementario. Detección: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o quimioluminiscencia. Análisis de datos: bioinformática. Softwares especializados para cada chip con bases de datos para generar los genotipos.

32 Microarrays En una misma prueba genera sobre 3000 resultados. Se basa en la detección de SNPs. El DNA genómico target aislado de sangre total se amplifica, se captura y se marca con fluorescencia por elongación en sondas alelo específicas inmovilizadas en micropartículas sintéticas. La fluorescencia de cada perla se analiza en el Array Imaging System (AIS). El software BioArray Solutions Information System (BASIS) calcula y ajusta la intensidad de cada reacción para asignar un genotipo y predecir un fenotipo para cada polimorfismo.

33 ADN array -Chips Gran número de muestras (buena plataforma para los donantes de sangre) PCR multiplex Análisis rápido y automático pós-pcr para numerosos polimorfismos de sangre Sistema cerrado para evitar la contaminación Análisis computarizado de los resultados Realiza las interpretaciones a partir de una base de datos

34 Conclusiones La existencia de las técnicas moleculares facilita la resolución de problemas que no pueden ser resueltos con la hemaglutinación. Reactividad débil de algunos reactivos para ciertos antígenos. Tipificación de pacientes con transfusiones recientes. Identificación de riesgo de EHRN. Aumentar la fiabilidad de unidades antígeno negativos para transfusión. Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el antígeno se va a expresar en el GR. La mayoría de estas técnicas son muy costosas, por lo cual el enfoque que se está dando en los estudios es la creación de algoritmos de identificación para disminuir costos, manteniendo la calidad.

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37 How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Revista Transfusion, volumen Importancia: Prevenir la aloinmunización en receptores. Receptor D parcial Tipificado Rh+ (Sueros clasificadores) Transfusión con Rh+ 54, Abril de Formación de anti-d Donante D débil Tipificado Rh- (Sueros clasificadores) Transfundido a receptor Rh- Formación de anti-d

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39 Free DNA Fetal Kit RhD

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42 SNPs (mutaciones puntuales missenses) AAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGA GACTATGATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG RH: C/c (Ser103Pro); E/e (Pro226Ala) MNS: S/s Kell: K/k, Kpa /Kpb, Jsa/Jsb Diego: Dia /Dib Duffy: Fya/Fyb Kidd: Jka/Jkb Lutheran: Lua/Lub Dombrock: Doa /Dob (FY B) A (Asp42) (FY A) G (Gly42)

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49 Tipos arrays genotipificacion BLOODchip BioArray HEA BeadChip h_america/index.php?option=co m_content&task=view&id=317&i temid=383 l/products/pages/red-cell- Genotyping.aspx