Detección de patógenos en alimentos, utilizando la técnica de PCR, reacción en cadena de la polimerasa.

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1 Detección de patógenos en alimentos, utilizando la técnica de PCR, reacción en cadena de la polimerasa. Lic. Esp. Mariano Diego Massari 1er Congreso Bioquímico Córdoba ª Jornada de Actualización en Especialidades Bioquímicas 2ª Jornada: El Rol del Bioquímico y la Formación de los Futuros Profesionales

2 Tendencia en la utilización de la Biología Molecular como herramienta para el diagnóstico. Desarrollo de metodos más rápidos y efectivos, altamente especificos. Los metodos convencionales son laboriosos y llevan demasiado tiempo. El éxito de la implementación de la PCR para la identificación de microorganismos patógenos es la elección correcta de secuencias blanco.

3 Fundamento del PCR La PCR es una metodología que consiste en la amplificación enzimática en ciclos repetidos de un fragmento específico de ADN o ARN utiliza la enzima ADN polimerasa, a partir de pequeñas cantidades de moléculas de ADN o ARN. Dos oligonucleótidos son utilizados como cebadores Primers. Estos son cadenas de nucleótidos que se unen a secuencias complementarias en el extremo 5 de cada hebra de ADN a amplificar.

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5 Pasos a realizar en una PCR Obtener el ADN templado Preparación de la mezcla de la reacción. Agregar el templado a la mezcla de reacción. Ciclado. Electroforesis en gel de agarosa. Visualización / registro de resultados.

6 Obtención de Templados Estandarizar el método de extracción de acuerdo a la matriz. Para el aislamiento bacteriano, solo es necesario el proceso de hervido. En cambio para el aislamiento en muestras mas complejas que pueden llegar a contener inhibidores o poca carga bacteriana, es necesario un enriquecimiento bacteriano previo y en algunos casos la necesidad de eliminar los inhibidores. Para la realización de una simple PCR no es necesario un ADN tan limpio y purificado, pero para realizar una secuenciación si es necesario que este ADN este limpio y purificado.

7 Preparación de la mezcla de reacción Buffer Tris-HCl 20mM y 50nM KCl ph es necesario para la adecuada actividad enzimática. Cloruro de Magnesio: cofactor indispensable (Taq polimerasa) y afecta el annealing de los primers. Los rangos de concentración utilizados son de (1 a 3) mm. Altas concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción. Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de la reacción.

8 Deoxirribonucleotidos: ATP, CTP, GTP Y TTP, (dntps). Agregados en iguales proporciones para minimizar falsas incorporaciones en la polimerización. Se ajusta la concentración para optimizar la especificidad y fidelidad de la reacción. Generalmente 100 um en el ensayo. Primers o cebadores: Preferentemente entre 15 y 30 pb de longitud. No deben ser complementarios entre si. Deben tener similar contenido de (G + C) y en baja conc. en el extremo 3. No deben contener estructuras secundarias. El rango de concentración en el ensayo varía desde (0.3 a 1) um. Altas concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción. Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de amplificación.

9 Enzima ADN polimerasa: Enzima Taq polimerasa. Tienen actividad de polimerasa y exonucleasa 5-3. Debe agregarse al final de la preparación de la máster mix. El rango habitual en cada ensayo es de ( ) U. baja concentración disminuye el rendimiento de la reacción altas concentraciones generan productos inespecíficos. La concentración en la que se utilizan cada uno de los reactivos va a afectar la sensibilidad y especificidad de la reacción. Todos los reactivos deben ser conservados a -20 C.

10 ADN blanco, La secuencia a amplificar debe contener desde menor a 0.1 a unas pocas kilobases. La cantidad total de ADN usado normalmente es de 0.05 a 1.0 ug. No es necesario que la muestra conteniendo la secuencia a amplificar esté altamente purificada. Controles Blanco de Templado: Reactivos solos, sin templado. Control positivo: templado de una cepa patrón que se sabe + (positiva). Control negativo: - templado de una cepa patrón que se sabe (negativa)

11 Pasos del termociclado El ciclado, consiste en una serie de pasos descriptos a continuación: Desnaturalización inicial: (94-96) C, (2-5) min Desnaturalización (94-96) C, 30 seg 1 min Annealing: (variable) C, 30 seg 1 min Extensión: 72 C, 30 seg 1 min. (Temperatura óptima de la polimerasa) Extensión final: 72 C, 10 min. Generalmente pueden ir de 25 a 35 ciclos

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14 Temperatura Melting 94 o C PCR Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Melting 94 o C 30ciclos 3 0 Tiempo 3

15 PCR Temperatura Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Melting 94 o C 30ciclos 3 0 Tiempo 3 Fragmentos de tamaño definido

16 PCR Temperatura Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Melting 94 o C 30ciclos 3 0 Tiempo 3 Calor Calor

17 Producción de productos inespecíficos Altas concentraciones de nucleótidos. Bajas temperaturas de annealing. Bajas temperaturas de extensión.

18 Electroforesis en gel de agarosa Se utilizan soluciones de agarosa a variadas concentraciones % P/V utilizando como solvente Buffer Tris Acético EDTA (TAE) 1X o Tris Borato EDTA (TBE) 0.5X. La concentración de la solución de agarosa a preparar va a depender del tamaño de los fragmentos a separar en la electroforesis Agarosa % (P/V) Rango de separación de fragmentos de ADN (kb)

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20 Condiciones de corrida electroforética Dependiendo del número y tamaño de los fragmentos a separar, se ajusta el voltaje y tiempo aplicado a la cuba electroforética en donde se realizará la corrida. Generalmente en varias aplicaciones se utiliza un fuente con voltaje de 100V durante un tiempo aproximado de 30 minutos.

21 Visualización del gel de agarosa Posterior a la corrida electroforética el gel puede teñirse, sumergiéndolo en una solución de Bromuro de Etidio por el transcurso de un tiempo. Luego este es observado bajo una lámpara ultravioleta, en donde se notaran las diferentes bandas separadas mediante la corrida electroforética. Para un posterior análisis y una documentación del ensayo realizado puede tomarse una fotografía del gel.

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23 PCR simple Tipos de PCR Sensibilidad analítica alta (100 a 1000 copias de genoma, detectable). PCR Anidado - Nested PCR Consta de dos ciclos de amplificación (2 PCR) con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e internos La primera amplificación da 2 fragmentos resultantes. La segunda reacción trabaja sobre los fragmentos obtenidos en la 1ra reacción. Sensibilidad analítica: menor a 10 copias de genoma. Muy sensible. Este modo es mas especifico, ya que cuando la Taq trabaja con grandes cantidades de DNA, su fidelidad disminuye. En cambio con este método, se trabaja con fragmentos cortos desde la segunda reacción, lo que hace mas efectivo el proceso. La especificidad también aumenta porque cuatro oligonucleótidos tienen que unirse específicamente

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25 PCR Multiple ( Chamberlain 1988) Se lleva a cabo la reacción de PCR tradicional, pero con mas de un par de primers, para amplificar varias regiones al mismo tiempo.

26 PCR Invertido o PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería: 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN. 2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estándar.

27 Real Time PCR (r t PCR) Los productos de amplificación se detectan de forma directa durante los ciclos de amplificación, utilizando sondas marcadas con fluorescencia, TaqMan o Molecular Beacon. La fluorescencia se mide a través de la tapa o del lado del recipiente de reacción

28 Se puede dividir en las técnicas basadas: 1- En fluorocromos no específicos. 2- En sondas específicas. 1- Utiliza el SYBR Green, que es un fluoróforo que se intercala en el DNA de doble hebra. Por ende, mientras mas DNA amplificado exista en el medio, mas SYBR green se intercalara y la luminiscencia aumentara proporcionalmente a los fragmentos amplificados. -Ventaja : Utilizar cebadores normales. Más económica que la que usa sondas específicas. - Desventaja: Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción.

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31 2- Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo (forward) y el inverso (reverse). Esto permite monitorizar el cambio de patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen. - Ventaja: Muy Precisos y evita posibles secuencias inespecíficas. Permite cuantificar el ADN amplificado. - Desventaja: Mas laborioso y costoso (diseño de secuencias específicas como sondas).

32 Hairpin Probes (Molecular Beacons) Sondas con secuencias repetidas invertidas en sus extremos Permitiendo forme una estructura de horquilla. Ventaja: Mas específica que las sondas TaqMan. Puede combinar varias Molecular Beacons en una única reacción. (Multiplex PCR). Desventaja: Diseño riguroso de las regiones tallo y asa de la horquilla.

33 Sondas Hidrolizadas (TaqMan) reportero quencher Actividad exonucleasa

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35 Hybridization Probes :

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