Estudio en vivo de la invasión de células vivas de arroz por el hongo Magnaporthe oryzae, el tizón del arroz

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Eva María Montes Giménez
hace 8 años
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1 Estudio en vivo de la invasión de células vivas de arroz por el hongo Magnaporthe oryzae, el tizón del arroz Martha C. Giraldo Z Barbara Valent Laboratorio Kansas State University CIAT Febrero 18, 2011

2 Teleomorfo: Magnaporthe oryzae Anamorfo: Pyricularia grisea Sacc. Haploide Ascomiceto filamentoso 37.8 Mb genome 7 chromosomes, >11,109 genes Una amenaza emergente : Añublo de trigo es una nueva enfermedad en América del Sur Incrementar la producción en agricultura es la única forma de garantizar suficientes fuentes de alimentos a precios accequibles

8 Mb genome 7 chromosomes, >11,109 genes Una amenaza emergente : Añublo de trigo es una

3 Adhesión de la espora Germinación Formación del apresorio Invasión biotrófica Esporulación Los efectores son secretados y translocados dentro de la célula de arroz Penetración

4 P AVR-Pita SP AVR-Pita CDS EGFP T SUSCEPTIBLE pi-ta - en la planta no reconoce el correspondiente AVR-Pita del hongo Interacción COMPATIBLE RESISTENTE Pi-ta en la planta reconoce el correspondiente AVR-Pita del hongo Interacción INCOMPATIBLE

Interacción COMPATIBLE RESISTENTE Pi-ta en la planta

5 Sakamoto (1949)

6 Cada proteína efectora del añublo del arroz tiene una secuencia única BIC BIC Secreción localizada de estos efectores dentro del Complejo biotrófico interfacial BIC es la única caracteristica en común encontrada entre éstos efectores Khang et al The Plant Cell

Complejo biotrófico interfacial BIC es la única caracteristica en

8 Kankanala et al The Plant Cell FM4-64 (Stains only endocytotic membranes) Invasive hyphae undergo extreme constriction when crossing

9 Live-Cell Imaging Suggested That Cell-to-Cell Movement Involves Plasmodesmata Kankanala P. et.al. Plant Cell 2007:19:

11 Extrainvasive Hyphal Membrane EIHM Biotrophic Interfacial Complex BIC Pathogen-induced in planta structure that accumulates effector proteins secreted from invasive hyphae Khang et al The Plant Cell

structure that accumulates effector proteins

12 Hyphae in liquid medium Invasive hyphae in planta at 36 hpi Validation of microarray data by Reverse Transcriptase-PCR Identified novel in planta-specific secreted proteins Mosquera & Giraldo et al The Plant Cell

Transcriptase-PCR Identified novel in planta-specific

13 Comprobar si las proteínas candidatos-efectoras están específicamente secretadas en la planta Determinar si son secretadas y se localizan en los BIC como los efectores conocidos AVR-Pita, PWL1 y PWL2 Determinar si son translocadas dentro de las células de arroz SECRECIÓN TRANSLOCACIÓN EIHM? Extrainvasive Hyphal Membrane EIHM

efectores conocidos AVR-Pita, PWL1 y PWL2 Determinar si son translocadas dentro

14 Secretion in planta: secreted GFP accumulates within the EIHM P RP27 ::EGFP P RP27 ::AVR-Pita SP::EGFP Cytoplasmic GFP Secreted GFP Secretion studies again confirm that the EIHM encloses a compartment that traps proteins secreted by the fungus

GFP Secreted GFP Secretion studies again confirm that the

15 Fungal transformation expressing candidate effector proteins fused with fluorescent reporter protein to follow secretion in planta by live cell imaging i pbht2 Binary vector Left etborder ode Right Border Hyg R P (1kb) SP-CDS(~400bp) FP - T Exchangeable Candidates mrfp - Monomeric Red EYFP - Enhanced Yellow EGFP - Enhanced Green FP: Fluorescent reporter protein

Left etborder ode Right Border Hyg R P (1kb) SP-CDS(~400bp) FP - T Exchangeable Candidates

16 Biotrophy-Associated Secreted (BAS) Proteins Microscopic visualization of >100 individual rice sheath infection sites per gene at each time point of the invasion

17 Mosquera & Giraldo et al The Plant Cell 100-fold upregulated in invasive hyphae Secreted protein with 115 aa BAS1:EYFP 27hpi BAS1:mRFP in AVRPita:EGFP 27hpi BAS1:mRFP in Cytoplasmic:CFP

18 BAS2:EYFP BIC pattern 84-fold upregulated in invasive hyphae Secreted protein with 102 aa BAS2:mRFP at 37hpi 32hpi Mosquera & Giraldo et al The Plant Cell It is localized at the points where EYFPthe fungus moves to next EYFP cells Unpublished data

19 Mosquera & Giraldo et al The Plant Cell 71-fold upregulated in invasive hyphae Secreted protein with 113 aa At appressorial penetration site, weak BIC pattern & at the points where the fungus moves to next cells BAS3:EYFP BAS3:mRFP in Cytoplasmic:CFP 24hpi 37hpi EYFP 37hpi EYFP

with 113 aa At appressorial penetration site, weak BIC pattern & at the

20 61-fold upregulated in invasive hyphae Secreted protein with 102 aa No pathogenicity phenotype for gene knock-out Mosquera & Giraldo et al The Plant Cell It is secreted and retained inside the EIHM compartment BAS4:EYFP 27hpi 37hpi

21 COMPATIBLE INTERACTION BAS4:EGFP_PWL2:mRFP INCOMPATIBLE INTERACTION Broken EIHM / COMPATIBLE INTERACTION

22 BAS4 is secreted and retained inside the EIHM compartment Gene Strain BAS4:YFP Extrainvasive Hyphal Membrane EIHM BAS1:mRFP BAS2:mRFP EIHM? BAS3:mRFP

23 BAS1 also moves beyond the invaded rice cell BAS1:mRFP in BAS4:YFP is translocated to the cytoplasm of living rice cells Plasmolysis

24 Estas proteínas asociadas a la fase biotrófica (BAS) exhibieron diferentes patrones de secreción: BAS1, localizada en BICs, es un candidato fuerte como un efector citoplásmico. BAS2 y BAS3 son candidatas como proteínas de movimiento del hongo de célula a célula. BAS4 marcado fluorecentemente es un buen control en estudios de traslocación de efectores, como marcador de integridad del EIHM y del éxito de la infección. La expresión de las proteínas BAS se redujo notoriamente, durante las interacciones incompatibles.

25 Determinar si el movimiento de célula a célula del añublo del arroz se produce a través de plasmodesmos usando la co-localización de BAS2 y BAS3 con proteínas marcadoras de plasmodesmos. Determinar la proteína o el complejo de proteínas que interactúan con los efectores conocidos y proteínas BAS en planta.

26 Dale Bumpers Dale Bumpers National Rice Research Center Arkansas

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