AVANCES EN TRANSGÉNESIS ANIMAL

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1 AVANCES EN TRANSGÉNESIS ANIMAL Dr. Pablo Bosch Laboratorio de Reprogramación Celular e Ingeniería Genética Departamento de Biología Molecular FCEFQyN, UNRC 1 de 33

2 Estructura de la presentación Definición de transgénesis animal Aplicaciones de los animales transgénicos Métodos transgénicos Clonación por transferencia nuclear de células somáticas (TNCS) Uso de la clonación por TNCS para generar animales transgénicos Conclusiones 2 de 33

3 Transgénesis Modificación genética Introducción, eliminación o modificación deliberada de información genética en la línea germinal de un animal Edición de genomas 3 de 33

4 Modificación del genoma Para qué? TERAPIA GÉNICA ANIMAL TRANSGÉNICO Modificación del genoma en células somáticas Modificación del genoma de todas las células incluyendo las gametas Corrección de defecto genético Investigación Biotecnología Biomedicina 4 de 33

5 Transgénesis Modificación genética Farmacéuticos Producción animal Modelos animales Xenotransplante 5 de 33

6 El método transgénico ideal Alta precisión Versátil Alta eficiencia Alta especificidad 6 de 33

7 Línea de tiempo de la transgénesis en animales domésticos Microinyección pronuclear Transgénesis Activa Transferencia Nuclear de Células Somáticas Nucleasas Sitio específicas 7 de 33

8 Métodos Transgénicos Micronyección de embriones Transgénesis mediada por Virus Células madre embrionarias Transferencia Nuclear de Células Somáticas (TNCS, clonado) Transferencia génica mediada por espermatozoides 8 de 33

9 Métodos Transgénicos TRANSGÉN (ADN) Modificación genética de células in vitro Microinyección del embrión Creación de embrión por transferencia nuclear (CLONADO) 9 de 33 Transferencia a hembra receptora ANIMAL TRANSGÉNICO

10 Métodos Transgénicos 10 de 33

11 Cómo ingresa el ADN (transgén)? 11 de 33

12 Cómo ingresa el ADN (transgén)? Métodos: Químicos: Liposomas Moléculas Policatiónicas Físicos: Electroporación Microinyección 12 de 33

13 Integración no facilitada (PASIVA) Integración facilitada (ACTIVA) Mutágeno químico o físico Luz UV, radicales libres, irradiación Ruptura en la doble hebra (DSB) Cómo se integra el ADN Proteína exógena: Transposasa, ZFNs, TALEN, integrasa viral (transgén) al genoma huésped? ADN foráneo Reparación celular y Recombinació n ilegítima ADN foráneo Integración mediada por enzima/s Concatémeros, silenciamiento Copias monoméricas del transgén 13 de 33

14 Cómo se integra el ADN (transgén) al genoma huésped? Integración no facilitada (PASIVA) Al azar Expresión variable Solo permite adición Baja eficiencia Nucleasas Recombinantes (ACTIVA) Dirigida Expresión predecible Adición y eliminación Alta eficiencia 14 de 33

15 Nucleasas Recombinantes CORTE de ADN EDICIÓN del GENOMA 15 de 33

16 Métodos transgénicos: Inyección Pronuclear Desventajas: Expresión transgén variable Baja eficiencia Solo permite adición génica 16 de 33

17 Métodos transgénicos: Inyección Pronuclear 17 de 33

18 Qué se entiende por clon? Producción de múltiples copias IDENTICAS de una molécula u organismo unicelular Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originado por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo 18 de 33

19 Toro Gran Campeón Aberdeen Angus 19 de 33

20 Clonación: Obtención del material genético Toro a clonar Células en cultivo N 2 Líquido -192 C 20 de 33 Estufa de cultivo

21 Obtención de los ovocitos Ovocito DNA materno Ovario Maduración de ovocitos in vitro CLONADO 21 de 33

22 Equipamiento específico Microscopio Micromanipuladores Microinyectores Electrofusor 22 de 33

23 Transferencia Nuclear: Técnica Ovocito Célula donante de núcleo Enucleación del ovocito 23 de 33 Transferencia de la célula donante

24 Transferencia Nuclear: Técnica (Cont.) Ovocito Activación química Fusión Célula del animal a clonar Cultivo in vitro de embriones (7 días) 24 de 33

25 Transferencia de embriones Embriones clonados Hembras receptoras Toros clonados 25 de 33

26 Métodos transgénicos: Clonado por Transferencia Nuclear Fibroblastos Enucleación Animal Donante Transgén Transferencia Nuclear N 2 Líquido -192 C Células genéticamente modificadas Embriones 26 de 33 Clones transgénico

27 Embriones bovinos transgénicos generados por SCNT Sitio Argentino de Producción Animal TRANSPOSONES 27 de 33

28 Conclusiones Métodos transgénicos están en constante evolución Modificación del genoma de células en cultivo asociado a TNCS representa un método transgénico con mucha potencialidad en grandes animales Los animales transgénicos ocuparán un lugar muy importante como modelo de enfermedades humanas y como biorreactores 28 de 33

29 Conclusiones Producción animal: Complemento de programas de selección por apareamiento Introducción de nuevas características (ej. carácter mocho) Incorporación de genes de resistencia a enfermedades Mejoras en la producción (mutación del gen de la miostatina) 29 de 33

30 Laboratorio de Reprogramación Celular e Ingeniería Genética, UNRC INTEGANTES Dr. Pablo Bosch Dra. Nancy Rodríguez Dr. Diego Forcato Dr. Fabrisio Alustiza Dr. Cecilia Liaudat Lic. Florencia Olmos Mic. Ana Alessio Mic. Alejandro Fili Est. Virginia Capella Sitio Argentino de Producción Animal COLABORADORES Dr. Wilfried Kues, GERMANY Dr. Stefan Moisyadi USA Dr. Daniel Salamone Bs.As. 30 de 33 SUBSIDIOS MINCyT CONICET UNRC MINCyT, Córdoba

31 Genoma animal Tamaño del genoma bovino: pb genes 31 de 33

32 Tipo de modificación Adicionar CAG GEN CAG Suprimir GEN Modificar GEN 32 de 33

33 Green Fluorescent Protein Luz UV ADN GFP 33 de 33

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