empleando Cultivos Celulares MSc.MARIA TERESA IBARZ M. Jefe División n Control Nacional Productos Biológicos

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1 Ensayos de Potencia para Vacunas empleando Cultivos Celulares MSc.MARIA TERESA IBARZ M. Jefe División n Control Nacional Productos Biológicos

2 Cultivos Celulares Se desarrolló a finales del siglo XIX como una continuación n de las técnicas t de Embriología Wilhem Roux mantuvo en el año a o 1885, células de embrión n de pollo en solución n salina durante unos díasd

3 CULTIVOS CELULARES El zoólogo Americano R.G.. Harrison (1907) es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales Establecimiento de las primeras líneas l celulares (HeLa y célulasc lulas-l L de ratón)

4 CULTIVOS CELULARES Rous y Jones, 1916 emplearon por vez primera vez tripsina para disociar las células c de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas para el establecimiento de los cultivos celulares es la aparición n de múltiples m contaminaciones

5 CULTIVOS CELULARES Aplicaciones: - Diagnóstico - Virología y producción de vacunas virales - Investigación del cáncer - Producción de proteínas - Estudios de toxicidad - Producción tejidos, piel para transplantes - Aplicaciones industriales y agrícolas

6 VIROLOGÍA CULTIVOS CELULARES Virus VIH

7 Producción n Vacunas Virales Animal completo O Cultivo Primario Fiebre Amarilla Sarampión

8 Línea Celular Producción Vacunas Virales SUSPENSION VIRAL

9 SUSPENSION VIRAL PURIFICACION Atenuada FORMULACION Inactivada/ Fraccionada

10 CULTIVOS CELULARES DIAGNOSTICO

11 Cuantificación de virus 1) Microscopía Electrónica

12 Cuantificación de virus 2) Efecto sobre la célula hospedadora (Unidad vírica infectiva) Formación de placas de lisis Efecto Citopático Efecto no Visible: Hemaglutinación Inmunoflorescencia Tinción

13 Cuantificación de Virus POTENCIA VACUNA VIRAL ATENUADA

14 LINEA CELULAR SUCEPTIBLE LIBRE DE AGENTES ADVENTICIOS POTENCIA VACUNA VIRAL ATENUADA

15 Determinación del Efecto Citopático Dosis Infectiva Cultivo Celular 50 (DICC50)

16 PRUEBAS EN CULTIVOS CELULARES Ventajas Control del medio ambiente Homogeneidad. Morfología y Composición uniforme. Se pueden hacer réplicas idénticas, superando la heterogeneidad de animales de experimentación.

17 CULTIVOS CELULARES Economía en el uso de reactivos o Vacunas a estudiar. Emplea volúmenes reducidos Motivaciones Eticas

18 Desventajas CULTIVOS CELULARES Técnica sensible Crecimiento células c animales mucho más m lento que los contaminantes más m s habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) Organimos pluricelulares requieren compleja mezcla de nutrientes, que simula el plasma o el fluido intersticial.

19 CULTIVOS CELULARES Condiciones de asepsia en todo momento Instrumental y personal calificado para su manipulación Cantidad y costo: 1 g Cultivo Celular es 10 veces más costoso que el animal.

20 CULTIVOS CELULARES Inestabilidad. Dotación cromosómica aneuploide Diferencias significativas entre generaciones Se emplean por determinado número de generaciones

21 CONTROL ESTADÍSTICO STICO DE PROCESOS GRAFICAS DE CONTROL 5,0 Patron Regional de Vacuna Antiamarilica. Lote: 003 PATRÓN N Comportamiento VACUNA ANTIAMARILICA año 2004 Log 10DL50 / 0,5ml LIMITE SUPERIOR Log 10DL50 / 0,5ml 4,5 4,0 3,5 3,0 LIMITE INFERIOR MEDIA ARITMETICA 2, Nº Determinaciones

22 CONTROL ESTADÍSTICO STICO DE PROCESOS GRAFICAS DE CONTROL Patrón Regional de Vacuna Antipoliomielitica Oral. Lote: SVI/OPV 001 III/96. Comportamiento "Polio Total" año ,8 DICC50 /0,1 ml LSC= 6,35 LIC=5,15 LC=5,75 6,4 6,0 log 10 DICC 50 / 0,1ml 5,6 5,2 4,8 4,4 4, Nº Determinaciones

23 Calificación de Analistas: Guías emitidas por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) documentos Q2A5 y Q2B6

24 RESULTADOS CALIFICACION ANALISTAS PRUEBA POTENCIA VAC. SARAMPION

25 CULTIVOS CELULARES El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo'

26 DESAFÍO O / RESPUESTA INMUNE PROTECCIÓN

27 RESUMEN PRUEBAS POTENCIA Y/O CUANTIFICACIÓN Ag EN VACUNAS POTENCIA VACUNA ATENUADA VACUNA INACTIVADA VIRUS ANIMALES CUANTIFICACION DEL ANTÍGENO CULTIVO ANIMALES CELULAR ELISA OTROS DICC50 DL50 UFP DE50 mcg UI UI UNIDADES INTERNACIONALES UNIDADES INTERNACIONALES

28

turbidez en los medios de cultivo. La duración de la prueba de esterilidad es de 14 días. Las pruebas de toxicidad (específica y general), llamadas

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