INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE MISANTLA

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Milagros Natividad Olivera Ríos
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1 INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE MISANTLA ING. IRMA CASTILLO CARMONA PRESENTA: CLISERIA RENDON DORANTES UNIDAD 3 FECHA: 25 DE ABRIL DEL 2013

2 Micropropagación vegetal

3 Micropropagación vegetal Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis) Cultivo de meristemos Cultivo de suspensiones de células vegetales Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de óvulos y embriones

La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores,

4 La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala. Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperíodo.

5 Sistemas de micropropagación vegetal

6 Alcances de la micropropagación vegetal Propagación vegetativa rápida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin Mayor control sobre la sanidad del material propagado Introducción rápida de nuevos cultivares Conservación de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

Etapas de la micropropagación vegetal Iniciación - Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre - Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo - Desinfección

8 Etapas de la micropropagación vegetal Iniciación - Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre - Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo - Desinfección superficial de los explantes - Establecimiento del cultivo in vitro Multiplicación Enraizamiento Rusticación - Multiplicación del material stock - Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro - Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo

9 Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novo de brotes y/o plantas completas Posibles vías morfogenéticas: - Organogénesis - Embriogénesis Diferencias entre las dos posibles vías: - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas directamente. - La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula del explante se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

10 Etapas implicadas en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal ETAPA 1 Elección de una planta madre selecta Explantes Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado ETAPA 2 Transferencia a un medio de multiplicación Formación de brotes o embrioides ETAPA 3 Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes ETAPA 4 Pasaje a maceta en un invernadero

11 Propagación vegetativa por embriogénesis somática

12 Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato

13 SUSPENSION CELULAR

14 Crecimiento de las células animales en cultivo Importancia Cultivos celulares in vitro han permitido a los científicos estudiar el crecimiento, la diferenciación celular y desarrollar manipulaciones genéticas necesarias para entender la estructura y funciones de los genes. Etapas Dispersión de parte de tejido en una suspensión de sus componentes celulares. Añadir a una placa de cultivo con medio nutritivo. Las células en el cultivo primario se adhieren a la placa y crecen hasta cubrir la superficie de la placa. Las células pueden ser retiradas y reponerse a baja densidad para formar cultivos secundarios.

15 Tomado de: La célula de Coopers.

16 Los primeros estudios de cultivo utilizaban medios que consistían en: suero, plasma, extractos embrionarios. En 1955 Harry Eagle describió el primer medio definido que sustentaba el crecimiento de células animales. Componentes de medio definido Sales Glucosa Aminoácidos Vitaminas Suero-como fuente de factores de crecimientos polipeptídicos necesarios para estimular la división celular. Actúan como reguladores críticos del crecimiento y diferenciación celular en organismos multicelulares. El tiempo de división en condiciones óptimas es del orden de 20 horas- 10 veces más largo que las levaduras.

Cultivo de células vegetales Los reguladores del crecimiento de células vegetales son pequeñas moléculas capaces de atravesar la pared celular vegetal. Tomado de: La célula de Coopers.

17 Cultivo de células vegetales Los reguladores del crecimiento de células vegetales son pequeñas moléculas capaces de atravesar la pared celular vegetal. Tomado de: La célula de Coopers. Al suministras mezclas apropiadas con estas moléculas reguladoras del crecimiento muchos tipos de células proliferan en cultivo, produciendo una masa de células no diferenciadas llamada callo.

18 Una de las características de las células vegetales es fenómeno de totipotencia o pluripotencia. Son capaces de formar cualquiera de los tipos de células diferentes y tejidos necesarios para generar una planta entera. La habilidad de producir una nueva planta desde una sola célula manipulada en cultivo hace posible la introducción de alteraciones genéticas en plantas, abriendo importantes posibilidades para la ingeniería agrícola.

19 Protoplastos vegetales Protoplasto: es una célula vegetal, bacteriana o fúngica que ha perdido su pared celular para lo cual se usan métodos mecánicos o enzimáticos

20 Mantenimiento de Protoplastos Los protoplastos son mantenidos en medio de cultivo celular que permitan nutrir adecuadamente la célula, esto contempla el suministro de macronutrientes y micronutrientes, incluyendo moléculas orgánicas que sean necesarias, como vitaminas.

21 Estas células, al carecer del refuerzo mecánico que otorga la pared celular, quedan más proclives a destruirse por diferencias de presión osmótica con respecto al medio. En el caso de un medio hipertónico respecto al medio intracelular, se puede producir una crenación del protoplasto. A su vez, un medio hipotónico puede producir citólisis del protoplasto. Es por esto que el medio de mantención debe estar ajustado de manera que no hayan diferencias osmóticas significativas con las células mismas.

22 Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas

23 La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo Laboratorio - Area de preparación de medios. - Area de lavado y esterilización. - Cuarto estéril. - Cámara de cultivo. - Area de rusticación. Material vegetal - Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). - Explantes (elección, disección, esterilización, etc.). Condiciones de cultivo - Asepsia. - Recipientes. - Temperatura. - Luz y fotoperíodo.

24 Medios de cultivo: composición general Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO 3-, PO 4 3-, K +, Ca 2+, Mg 2+, SO 4 2- Micronutrientes: Fe 2+, Cu 2+, Zn +, Mn 2+, Mo 2+, Co 2+, I - Carbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite ph 5,6 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave Aminoácidos Glicina

25 Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales Soluciones concentradas de macroelementos (100x) Soluciones concentradas de microelementos (100x) Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) Mio-inositol (100 mg/l) Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/l. Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/l

26 Propiedades físicas de los medios de cultivo Consistencia del medio Semisólido Líquido El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías: - Inducción de embriogénesis*. - Cultivo de protoplastos. - Cultivo de suspensiones celulares. *también en medio semisólido

Propiedades físicas de los medios de cultivo Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite ) para posibilitar el intercambio de gases.

27 Propiedades físicas de los medios de cultivo Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite ) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno. - La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes. ph: - Constituye un factor crítico. - Se ajusta en el rango 5,5 5,8. - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.

28 Composición de medios de cultivo comúnmente usados

29 Composición de medios de cultivo comúnmente usados

30 Reguladores del crecimiento comúnmente usados en los medios de cultivos vegetales

31 BIBLIOGRAFIA db/recursos/r NOLOGIA%20VEGETAL

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