11 Número de publicación: Int. Cl.: 74 Agente: Tomás Gil, Tesifonte-Enrique

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 38/24 (06.01) A61K 31/7 (06.01) A61P 1/08 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Método in vitro para la sincronización de la maduración de ovocitos. Prioridad: DK US 1816 P DK Titular/es: NOVO NORDISK A/S Health Care Patents, Novo Alle 2880 Bagsvaerd, DK 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Grondahl, Christian; Hansen, Thomas, Host; Rübig, Alexander y Hegele-Hartung, Christa 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Tomás Gil, Tesifonte-Enrique ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCIÓN Método in vitro para la sincronización de la maduración de ovocitos. Campo de esta invención Esta invención se refiere a medios mejorados para la fertilización in vitro (en adelante denominada FIV) Antecedentes de esta invención Puesto que el primer embarazo por FIV fue realizado en 1978, este procedimiento ha resultado en millares de embarazos y ha abierto una nueva y amplia frontera de investigación y tratamiento para las parejas infertiles. Además, hoy en día hay una necesidad significante de modalidades de tratamientos para la infertilidad mejorados. Se presume que aproximadamente una de siete parejas experimenta problemas de subfertilidad o infertilidad. La FIV de ovocitos humanos se ha vuelto muy usada para el tratamiento de la subfertilidad en mujeres y hombres. El tratamiento por FIV estendar incluye una larga fase de estimulación hormonal de la paciente hembra, p. ej. días, que se inicia suprimiendo la hormona estimulante del foliculo propio de la paciente (en adelante denominada FSH) y la hormona luteinizante (en adelante LH) por la hormona liberadora de la gonadotropina (en adelante denominada GnRH), y esta este seguida de inyecciones de gonadotropinas exogenas, p. ej. FSH y/o LH, para asegurar el desarrollo de folículos preovulatorios múltiples y la aspiración de múltiples ovocitos madurados in vivo inmediatamente antes de la ovulación. El ovocito aspirado es posteriormente fertilizado in vitro y cultivado, normalmente durante tres días antes de ser retransferido al útero en el 4-8 estadio celular. Los esfuerzos continuos han sido hechos para optimizar y simplificar este procedimiento. Sin embargo, el nivel de embarazo global no puede ser aumentado significativamente mas de aproximadamente el % con las modalidades de tratamiento actuales. En una amplia encuesta europea de pacientes de FIV, se descubrió que 7.2 ovocitos de 11. ovocitos aspirados por la paciente han sufrido la reanudación de la meiosis inmediatamente antes de la fertilización, solo 4.3 ovocitos fueron fertilizados y solo 2.2 ovocitos alcanzaron el estadio celular embrionario 8 después de la fertilización y el cultivo in vitro (ESHRE, Edimburgo, 1997). Debido a la calidad muy imprevisible de los embriones del estado de la técnica actualmente, mas de un embrión tiene que ser transferido para dar solo una posibilidad razonable de éxito. En consecuencia, es común transferir 2-3 embriones (hasta embriones en algunos países), lo que conlleva el gran efecto secundario de embarazos múltiples con una gran incomodidad y riesgo tanto para la paciente como para los niños. Además, se ha estimado que los gastos aumentados en asistencia sanitaria debido a un nacimiento múltiple (gemelos, trillizos etc.) esta excediendo los gastos totales de la FIV. Por lo tanto, hay diferentes desventajas con el tratamiento actual, las cuatro mas notables siendo: 1. el riesgo de hiperestimulación ovárica con la inyección de gonadotropinas que es una condición fatídica potencial que requiere hospitalización, 2. embarazos múltiples ( veces la frecuencia normal de gemelos y trillizos, respectivamente), 4 3. la existencia de segmentos de pacientes considerables que no toleran el método actual debido a, p. ej. síndrome ovárico poliquistico y muchos diabéticos, 4. un riesgo potencial de cáncer a largo plazo. 0 Además, el aumento de peso, hinchazón, nauseas, vómitos, humor lábil y otras incomodidades de la paciente junto con la resistencia de la paciente a inyectarse ella misma se presentan como desventajas. Es conocido a partir de WO 96/0023 que algunos derivados de esterol pueden ser usados para regular la meiosis. Un ejemplo de esterol de este tipo es 4,4-dimetil-α-colesta-8,14,24-trieno-3β-ol (en adelante denominado FF-MAS). 6 En la presente, los términos compuestos MAS designan compuestos que median la meiosis de los ovocitos. Mas específicamente, los compuestos MAS son compuestos que en la prueba descrita on el ejemplo 1 mas abajo tiene un porcentaje de descomposición de la vesícula germinal (en adelante denominada GVB) que es significativamente superior al control. Los compuestos MAS preferidos son los que tienen un porcentaje de GVB de al menos el 0%, preferiblemente al menos el 80%. Ejemplos de compuestos MAS están mencionados en WO 96/0023; 96/2768; 97/00884; 98/28323; 98/496 y 98/498, mas específicamente on la Reivindicación 1 de estos. En WO 9/00026, algunas sustancias de regulación de la meiosis potenciales fueron evaluadas en ratones hembra inmaduros. 48 horas antes los animales de prueba fueron matados por dislocación cervical, se les dio una única inyección de urogonadotropina que contenía IU de FSH y IU de LH. Los ovarios fueron eliminados, colocados en un medio de hipoxantina y liberados de tejido extrano. Luego, los ovocitos fueron punzados de los folículos, liberados de células del cumulus y cultivados en un medio conteniendo un derivado regulador de la meiosis. 2

3 ES T3 Actualmente, la maduración in vitro en seres humanos ha demostrado no tener mucho éxito a pesar del interés sustancial y los esfuerzos clínicos. Un objeto de la presente invención es la reivindicación 1. Otro objeto de la presente invención es la reivindicación 9. Resumen de esta invención 1 Ahora, se ha encontrado sorprendentemente, que la FIV puede ser mejorada sustancialmente al añadir un compuesto MAS en el estadio en el método usual de realización de la fertilización in vitro donde se podría esperar que la maduración hubiera tenido lugar in vivo. Brevemente, la presente invención se refiere a un método para la maduración o sincronización in vitro de ovocitos humanos y para disminuir la incidencia de preembriones humanos con anomalias cromosómicas (aneuploidía), que han sido aspirados de una mujer que, en un periodo consecutivo de días, ha sido tratada con una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta, cuya maduración o sincronización se realiza contactando dichos ovocitos con un compuesto MAS en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0 µmol por litro. Las formas de realización preferidas de esta invención son las establecidas en las reivindicaciones secundarias mas abajo. Descripción detallada de esta invención 2 En referencia al ciclo femenino, una manera de realizar el tratamiento descrito en la presente es el siguiente: Alrededor del día 21 en un ciclo hasta alrededor del día 1 del ciclo siguiente: los ovarios son estimulados tratando a la mujer con GnRH, p. ej. Synarel (0-0 µg al día). Alrededor de los días 6-1 en el segundo ciclo: los ovarios son estimulados tratando a la mujer con FSH, p. ej. Gonal-F, Puregon o Humegon (-0 IU al día). Alrededor de los días 1-16 del segundo ciclo: los ovarios son estimulados tratando a la mujer con hcg, p. ej. Pregnyl o Profasi ( IU al día) Alrededor del día 18 del segundo ciclo: los ovarios son recuperados de la mujer. Alrededor del día del segundo ciclo: los ovarios son madurados con un compuesto MAS para estimular la meiosis. En esta fase de la maduración adicional, la concentración de compuesto MAS puede estar en la gama de aproximadamente µmol por litro, p. ej. - µmol por litro. El tiempo para esta fase de maduración puede estar en la gama de alrededor 1- horas. Si los folículos preovulatorios están inducidos para lutenizarse con una hormona luteinizante o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o las corion gonadotropinas humanas o un agonista o antagonista de estas o un derivado activo de estas, la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración de aproximadamente 1-1 horas, preferiblemente aproximadamente 6 horas. Si, no obstante, los folículos preovulatorios no son inducidos a lutenizarse con una hormona lutenizante o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o las corion gonadotropinas humanas o un agonista o antagonista de estas o un derivado activo de esas, la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tendrá una duración de aproximadamente 1- horas. Alrededor de los días del segundo ciclo: los ovarios son fertilizados in vitro. A partir de la aspiración del día anterior, la mujer recibirá un estrógeno, p. ej., estrógeno valerato (2 X mg al día). Dos días mas tarde, ella también recibirá un progestogeno, p. ej., Progestane vagetoria, a diario, que volverá la pared del útero mas propensa a recibir los futuros embriones. La duración de este tratamiento sera designada individualmente por paciente. El medico puede elegir entre una variedad de estrógenos y progestogenos. Alrededor del día 21 en el segundo ciclo: Uno o mas embriones son transferidos al útero de la mujer. La descripción anterior se denomina adición de MAS al protocolo de FIV existente para mejorar la eficacia mediando una maduración final o completa o sincronía en el ovocito. De forma alternativa, MAS puede utilizarse para rescatar ovocitos en los ciclos que de lo contrario serian cancelados debido a una hiper respuesta de FSH aparente. En este ejemplo, el responsable clínico considerare la cancelación en base al perfil de estradiol, ultrasonografia (respuesta tipo PCO) evitando así el tratamiento de hcg. Los ovocitos son aspirados al mismo tiempo alrededor del día 1-16 substituyendo el tratamiento de hcg. Aparte de la fase de maduración adicional con un compuesto MAS, la FIV anterior se realiza según la vía usual. Puesto que se espera que por el procedimiento de FIV tradicional los ovarios hayan sido madurados suficientemente, no se espera que haya ningún efecto adicional para añadir esta fase de maduración adicional. 3

4 ES T3 La mayor parte de las fases en el tratamiento anterior y procedimiento se realizan de una manera conocida y las fases restantes son realizadas en cierto modo conocido per se. Mas detalles sobre la eliminación de los ovocitos de folículos en el ovario, cultivo de los ovocitos aislados, el medio de cultivo que se debe usar, la fertilización con esperma, y la transferencia del embrión a la trompa de Falopio pueden ser encontrados en la bibliografía, por ejemplo, en la especificación de patente estadounidense Nº Según esta invención, el compuesto MAS se añade al medio de cultivo usado. En este medio, la cantidad del compuesto MAS este en el rango de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0 µm Una razón preferida para tratar a una mujer, en un periodo consecutivo de días, con una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo es obtener folículos preovulatorios múltiples. Las hormonas hipotalemicas son hormonas presentes en el hipotalamo humano. Las hormonas pituitarias son hormonas presentes en la glándula pituitaria humana. Las hormonas gonadotropicas son hormonas segregadas por el glóbulo anterior de la pituitaria en las vertebras y por la placenta mamífera, que controla la actividad de las gónadas. Químicamente, estas son glicoproteínas. Ejemplos de hormonas gonadotropicas son FSH, LH y corion gonadotropina, p. ej. La corion gonadotropina humana (en adelante designada hcg). La FSH estimula el crecimiento de folículos ováricos y sus ovocitos en el ovario y la formación de espermatozoides en el testículo. La FSH puede ser, p. ej., FSH menopáusica o FSH recombinante. En las mujeres, la LH activa el tejido productor de estrógenos de los ovarios para producir progesterona, probablemente promueve los estadios finales del desarrollo de folículos ováricos, inicia la maduración de ovocitos final, induce a la ovulación y en los mamíferos inicia el desarrollo de cuerpo lúteo. Estas hormonas son conocidas. Es obvio para el operario experto en la técnica que, de forma alternativa, se pueden usar los agonistas o antagonistas de estas. Es también obvio para el operario experto en la técnica que, de forma alternativa, se pueden usar análogos activos de estas hormonas. Algunos de estos agonistas, antagonistas y análogos son conocidos y otros pueden ser preparados por procesos conocidos per se. Ejemplos de tales procesos conocidos son la síntesis química y la ingeniería genética. En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde el periodo consecutivo de días dentro del cual la mujer fue tratada con una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista derivado de esta o un derivado activo de esta, fue de al menos aproximadamente 7 días, preferiblemente de al menos aproximadamente días, mas preferido de al menos aproximadamente 14 días. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde la mujer fue tratada de esterilidad, y/o para mejorar la maduración de sus ovocitos, y/o para mejorar la sincronía de la maduración de ovocitos nuclear, citoplásmica y/o membranosa, y/o para mejorar la fertilidad de sus ovocitos, y/o para mejorar el nivel de implantación por maduración y fertilización in vitro humana. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro cuyo periodo consecutivo fue de un ciclo menstrual. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración de aproximadamente 1 a aproximadamente horas. 4 0 En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde los folículos preovulatorios han sido inducidos para lutenizarse con una hormona luteinizante (LH) o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o la corión gonadotropina humana (hcg) o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 horas, preferiblemente de aproximadamente 6 horas. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde la dosificación del compuesto MAS usada es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0 µmol por litro, preferiblemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0 µmol por litro. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde el compuesto MAS es uno de los compuestos mencionados en WO 96/0023; 96/2768; 97/00884; 98/28323; 98/496 y 98/498, mas específicamente los compuestos mencionados en la reivindicación 1 de estos. En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método in vitro donde el compuesto MAS es FF-MAS. 6 Adicionalmente, la presente invención se refiere a un kit farmacéutico en forma de dosificación unitaria para el use por la fertilización in vitro que comprende dosificaciones de unidades separadas, dicho kit comprendiendo unidades de dosificación separadas para la administración diaria secuencial de una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta para la administración diaria secuencial 4

5 ES T3 y 1 unidad de dosificación de un compuesto MAS. Este kit puede tener las características preferidas anteriormente descritas La presente invención esta ilustrada con mayor detalle por los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no deben ser construidos como limitadores. Las características descritas en la descripción precedente, en los ejemplos siguientes y en las reivindicaciones pueden ser, tanto por separado como en cualquier combinación de estos sustanciales para realizar la invención de diversas maneras. Ejemplo 1 Método usado para elegir compuestos MAS Los ovocitos fueron obtenidos a partir de ratones hembra inmaduros (C7BL/6JxDBA/2JF1, Bomholtgaard, Dinamarca) con un peso de gramos, que fueron mantenidos bajo temperatura controlada (-22ºC), luz (luces entre ) y humedad relativa (0-70%). Los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 0.2 ml gonadotropinas (Gonal-F, Serono) conteniendo IU de FSH y 48 horas mas tarde los animates fueron matados por dislocación cervical. Los ovarios fueron diseccionados y los ovocitos fueron aislados en un medio Hx (ver mas abajo) bajo un estereomicroscopio por rotura manual de los folículos usando un par de agujas de grosor 27. Los ovocitos esféricos que mostraban una vesícula germinal intacta (en adelante designada GV) fueron divididos en cumulus incluidos los ovocitos (en adelante designados CEO) y los ovocitos desnudos (en adelante designados NO) y colocados en un medio esencial α-mínimo (α-mem sin ribonucleosidos, Gibco BRL, Cat. Nº. 2261) suplementados con 3 mg/ml de albumina de suero bovino (BSA, Cat Sigma. No. A-70), mg/ml de albumina de suero humano (HSA, Statens Seruminstitut, Dinamarca), 0.23 mm de piruvato (Sigma, Cat. Nada S-8636), 2 mm de glutamina (Flow Cat. Nº ), 0 IU/ml de penicilina y 0 µg/ml de estreptomicina (Flow, Cat Nº ). Este medio fue suplementado con 3 mm de hipoxantina (Cat Sigma. No. H-9377) y designado medio Hx. Los ovocitos fueron enjuagados tres veces en un medio Hx y los ovocitos de tamaño uniforme fueron divididos en grupos de CEO y NO. CEO y NO fueron cultivados en multiplacas de 4 pocillos (Nunclon, Dinamarca) en las cuales cada pocillo contenía 0.4 ml de medio Hx y el compuesto por evaluar en una concentración de µm. Un pocillo de control (es decir, 3-4 ovocitos cultivados en un medio idéntico sin adición del compuesto de prueba) fue siempre cultivado simultáneamente con 3 pocillos de prueba (3-4 ovocitos por pocillo suplementados con el compuesto de prueba). Los ovocitos fueron cultivados en una atmósfera humedecida del % de CO 2 en aire durante 24 horas a 37ºC. Hacia el final del periodo de cultivo, el numero de ovocitos con GV, GVB y cuerpos polares (en adelante designados PB), respectivamente, fueron contados usando un estereomicroscopio (Wildt, Leica MZ 12). El porcentaje de GVB, definido como porcentaje de ovocitos sometidos a GVB por numero total de ovocitos en este pocillo, fue calculado como: % GVB = ((numero de GVB + numero de PB)/ número total de ovocitos) x 0 Ejemplo Procedimiento Todos los pacientes de la FIV pueden de forma potencial recibir este tratamiento, gama de edad de a 4 años. El tratamiento hormonal puede ser un tratamiento corto o largo a base de gonadotropina con o sin subregulación pituitaria o con y sin el uso del antagonista de GnRH y con o sin el use de hcg. Las terapias hormonales apropiadas futuras designadas para la FIV pueden también ser usadas. Los folículos de tamaño medio a completo (tamaño a 2 mm, preferencial folículos de 16 a mm) serán aspirados bajo guiado por ultrasonidos. El fluido aspirado sera buscado para complejos de ovocitos-cumulus (COC) y una vez identificado bajo el estereomicroscopio (con o sin el uso de filtros de embriones), el COC sera puesto en cultivo. 6 La exposición a FF-MAS puede variar de 1 a horas, preferentemente de 4 a horas, y puede ser antes, entre y hasta 24 horas después de la fertilización. Se puede usar una amplia variedad de medios de cultivo de ovocitos o componentes de medios conocidos por el operario experto. La albumina de suero humano (HSA) puede o no ser añadida al medio. Si se añade, puede hacerse en una concentración de 0.1 a 0 mg/ml, preferentemente de a 1 mg/ml o de 0. a 1. % de volumen/volumen. La formulación de FF-MAS puede ser en forma de una solución madre de etanol, DMSO u otra solución de solvente orgánico o puede ser en forma de pocillos de FF- MAS/HSA revestidos en seco listos para el uso añadiendo el medio de cultivo apropiado. La concentración de FF-MAS puede variar de 0.1 µm a 0 µm, preferentemente de a µm. Después o durante el cultivo in vitro con FF-MAS, los ovocitos pueden ser fertilizados por FIV convencional o por inyección de esperma intracitoplasmatico (ICSI) o por métodos de fertilización apropiados futuros que conducen a zigotos fertilizados. El embrión en desarrollo puede ser transferido en el día 1 hasta el día 6 después de la fertilización, preferentemente en el día 2 hasta el 3, bien como una transferencia ovárica individual o como una transferencia ovárica múltiple.

6 ES T3 La paciente puede recibir una terapia de progesterona y/o de estrógenos antes y después de la transferencia ovárica en protocolos diseñados individuales para cebar y sustentar la pared endométrica receptiva apropiada. En comparación con los procedimientos conocidos, se obtuvieron mejores resultados usando el procedimiento anterior. Ejemplo Uso de FF-MAS como complemento a un tratamiento de F/V estándar a base de FSH La paciente sufrió subregulación con FSH recombinante con una dosis diaria de promedio de 22 IU empezando el Día 1 o 2 del ciclo corriente y se use un antagonista de GnRH, es decir, Cetrorelix (1 mg diario, subcutaneamente, una inyección), en el ciclo corriente. Al menos 3 folículos de 17 mm o mas estaban presentes al administrar hcg, es decir, Profasi (.000 IU, una inyección). Los folículos fueron aspirados y los ovocitos de la metafase II fueron cultivados en sistema de cultivo de ovocitos conteniendo medios de fertilización in vitro (FIV) estándar (IVF (que están disponibles por Scandinavian IVF Science AB, Gothenburg, Suecia)) suplementados con albumina de suero humano (0.8%) y FF-MAS ( µm). Todos los ovocitos fueron cultivados en condiciones normales a 37ºC en la incubadora. Cada ovocito fue cultivado en un pocillo en una placa de cultivo de cuatro cámaras como sistema de medios de cultivo. La duración de la exposición a los medios de cultivo con el tratamiento fue de 4 horas (± minutos) antes de la inyección de esperma intracitoplasmico (en adelante designado ICSI) y horas (±1 hora) después de ICSI en el anterior medio IVF. Los preembriones fueron evaluados para la fase de seccionamiento y fragmentación / morfología en los días 1, 2 y 3 post ICSI. Después de 3 días de cultivo, se sustituyo una selección de los mejores preembriones, normalmente dos preembriones, en la paciente hembra. La paciente hembra recibió un estrógeno, es decir, Estrofem (6 mg/día), y una progesterona, es decir Utrogestan (0 mg/día, supositorio micronizado vaginal), para dejar la pared del endometrio en el útero de la paciente sensible y lista para permitir la implantación de los ovarios transferidos. La continuación de hormonas esteroides de mantenimiento fue dependiente de la paciente y fue reducida después de 3- semanas dependiendo del examen de ultrasonidos y análisis de sangre. En comparación con los procedimientos conocidos, se obtuvieron mejores resultados usando el procedimiento anterior. Ejemplo Uso de FF-MAS como complemento a un tratamiento de FIV estándar a base de FSH La paciente sufrió subregulación con un análogo de GnRH, es decir, Synarel (espray nasal, dos pulsaciones diarias), durante al menos 14 días (empezando en la fase luteal del ciclo precedente o Día 1 o 2 en la fase folicular del ciclo corriente) y estimulación ovárica con FSH recombinante con una dosis diaria de promedio de 22 IU. Al menos 3 folículos de 17 mm o mas estuvieron presentes al administrar hcg, es decir Profase (.000 IU, una inyección). Los folículos fueron aspirados y los ovocitos de la metafase II fueron cultivados en un sistema de cultivo de ovocitos conteniendo medios de fertilización in vitro (FIV) estándar (IVF (que están disponibles por Scandinavian IVF Science AB, Gothenburg, Suecia)) suplementados con albumina de suero humano (0.8%) y FF-MAS ( µm). Todos los ovocitos fueron cultivados en condiciones normales a 37ºC en la incubadora. Cada ovocito fue cultivado en un pocillo en una placa de cultivo de cuatro cámaras como sistema de medios de cultivo. La duración de la exposición a los medios de cultivo con el tratamiento fue de 4 horas (± minutos) antes de la inyección de esperma intracitoplasmico (ICSI) y horas (±1 hora) después de ICSI en el medio FIV anterior. Los preembriones fueron evaluados para fase de seccionamiento y fragmentación / morfología en los días 1, 2 y 3 post ICSI. Después de 3 días de cultivo, una selección de los mejores preembriones, normalmente dos preembriones, fueron sustituidos en la paciente hembra. La paciente hembra recibió un estrógeno, es decir, Estrofem (6 mg/día), y una progesterone, es decir, Utrogestan (0 mg/día, supositorio micronizado vaginal), a diario para dejar la pared endometrial en el útero de la paciente sensible y lista para permitir la implantación de los ovarios transferidos. La continuación de hormonas esteroides de mantenimiento fue dependiente de la paciente y fue reducida después de 3- semanas dependiendo del examen de ultrasonidos y análisis de sangre. En comparación con los procedimientos conocidos, se obtuvieron mejores resultados usando el procedimiento anterior. Ejemplo 6 Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3 con la condición de que en vez de usar FF-MAS en una concentración de µm, se usó FF-MAS en una concentración de µm, se obtuvieron mejores resultados que con los procedimientos conocidos. Ejemplo 6 Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 4 con la condición de que en vez de usar FF-MAS en una concentración de µm, se use FF-MAS en una concentración de µm, se obtuvieron mejores resultados que con los procedimientos conocidos. 6

7 ES T3 REIVINDICACIONES Método in vitro para la sincronización de la maduración de ovocitos nuclear, citoplasmatica y/o membranosa y para disminuir la incidencia de preembriones humanos con anomalias de los cromosomas (aneuploidía), donde los ovocitos humanos que han sido aspirados de una mujer, en un periodo consecutivo de días, cuyo periodo temporal es de al menos aproximadamente 7 días, preferiblemente de al menos aproximadamente días, mas preferido de al menos aproximadamente 14 días, han sido tratados con una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta, son puestos en contacto con un compuesto MAS en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0 µmol por litro. 2. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la mujer ha sido tratada de infertilidad, y/o para mejorar la maduración de sus ovocitos, y/o para mejorar la fertilidad de sus ovocitos, y/o para mejorar el nivel de implantación por maduración y fertilización humana in vitro. 3. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el periodo consecutivo consistía en un ciclo menstrual. 4. Método in vitro según la reivindicación precedente donde la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración de aproximadamente 1 a aproximadamente horas.. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los folículos preovulatorios fueron inducidos a lutenizarse con una hormona luteinizante (LH) o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o corion gonadotropina humana (hcg) o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta. 6. Método in vitro según la reivindicación precedente donde la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 horas, preferiblemente de aproximadamente 6 horas. 7. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la dosificación del compuesto MAS es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0 µmol por litro, preferiblemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0 µmol por litro. 8. Método in vitro según la precedente reivindicación donde el compuesto MAS es FF-MAS Kit farmacéutico en forma de dosificación unitaria para el use por la fertilización in vitro que comprende dosificaciones de unidades separadas, dicho kit comprendiendo unidades de dosificación separadas para la administración diaria secuencial de una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista suyo o un derivado activo para la administración diaria secuencial y 1 unidad de dosificación de un compuesto MAS