Biotecnología animal. Métodos de transferencia de genes en animales. Métodos de transferencia de genes en animales

Transcripción

1 Cual es el objetivo realizar Biotecnología animal? Biotecnología animal A. Se puen generar animales modificados ( animales transgénicos ) para muchos propósitos, que sirvan molos a enfermedas humanas o introducir nuevos caracteres a animales importantes en producción como vacas o peces B. Métodos genéticos como selección asistida por marcadores (MAS) ayuda a intificar zonas en el cromosoma con caracteres importantes como crecimiento C. Los genes se puen transferir a través especies, familias e incluso reinos como resultado tecnología l DNA recombinante D. Los principales objetivos la biotecnología animal son razas que sean más nutritivas y animales económicamente más productivos, incrementen el crecimiento y sarrollo, así como anticuerpos y producción vacunas Métodos transferencia genes en animales Para insertar un gen correctamente en un animal, el gen (nominado el transgen) necesita expresarse en el momento acuado y la cantidad y lugar acuado l animal Promoters y secuencias reguladoras son esenciales El gen se be incorporar al cromosoma para una expresión acuada Métodos transferencia genes en animales Microinyección 1. La inyección l gen interés en un huevo fertilizado un animal donador 2. El gen be ser insertado antes que la primera división celular tal modo que todas las células l animal contienen el gen 3. Los pasos en el proceso son: a. Intificación (y a veces modificación n por mutación) ) un gen interés b. Inserción l gen interés en el vector apropiado c. Microinyección l DNA ntro l pronucleo un huevo fertilizado d. Implantación l huevo microinyectado en una madre alquiler e. Permitir el sarrollo l embrión n hasta su nacimiento f. Demostración n que el gen ha sido incorporado manera estable en el genoma huesped y es heredado en la scenncia g. Demostrar que el gen se expresa y es correctamente regulado en el organismo l huesped 1

2 4. Animales fundadores, que son los animales que tienen el nuevo gen en las células germinales (reproductivas) se cruzan para establecer nuevas líneas l genéticas con las características interés 5. Se ha sarrollado la Microscopía a diferencial interferencia manera que el el núcleo los huevos son visibles para insertar en las madres lo antes posible 6. Problemas potenciales: a. Sobreviven pocos huevos inyectados b. El gen se inserta al azar en los cromosomas c. No todas las células l animal reciben el gen d. El gen no se expresa lo suficiente Transferencia génica célula madre embrionaria 1. (ES) Células indiferenciadas que se divin para producir células diferenciadas mientras mantienen sus características indiferenciadas (llamadas células pluripotentes) 2. Células madre embrionarias Embryonic stem (ES) cells se usan para promover reemplazamiento génico dirigido (recombinación homóloga) manera que el gen se inserta en el cromosoma acuado 3. Los pasos son los siguientes: a. Células ES se extraen l embrión b. El gen interés se inserta en las células (llamado transfección ) c. El gen es dirigido por recombinación homóloga y marcadores selección d. Las células ES con el gen acuado se inyectan en embriones parcialmente sarrollados nominados blastocitos, que se implanta en una madre e. La scenncia es cribada por el caracter interés 4. Se pue usar para molos enfermedas humanas como la enfermedad Gehrig, cancer, Alzheimer, fibrosis cistica Problemas con recombinación homóloga Recombinación no-homóloga frecuente Solución: vectores reemplazo La construcción KO contiene 1) Gen neor Flanqueado por 2) 2 segmentos gen objetivo y 3) El gen HSVtk Parte l gen se reemplaza con neor Células ES se seleccionan por la integración NeoR y contra ka integración HSVtk* (NeoR+/ HSVtk-) en ganciclovir 2

3 Vectores reemplazo Recombinación homóloga Neo R Neo R+ / HSVtk - Neo R segmento l gen 1 HSVtk segmento l gen 2 Integración al azar Plásmido reemplazo linearizado Neo R+ / HSVtk + HSVtk convierte ganciclovir en una droga tóxida y mata células HSVtk+ 5. Pue inactivar gene para monitorizar el efecto en crecimiento o para sarrollar tratamientos 6. Mutagénesis dirigida en ratón a. Inserción DNA en un lugar específico l cromosoma b. Genes se puen también n inactivar (llamado KO) c. Los pasos en crear ratones KOs son: 1) Un gen se inactiva al eliminar una parte l gen e insertar un gene resistencia a antibiótico tico en su lugar. DNA homólogo don la recombinación va a ocurrir flanquea ambos lados l marcador.. El DNA insertado también n lleva un gen que produce la piel negra 2) El gen se transfiere a células madres embrionarias.. La células contendrán dos copias l gen interés y dos copias l l gen piel negra (en homozigosis) 3) Las células se criban con antibióticos ticos para terminar la correcta inserción l DNA 4) Las células madre embrionarias se transfieren a embriones ratón tempranos 5) Los embriones se implantas en madres se permite su nacimiento 6) La scenncia tendrán n piel blanca y negra, siendo la piel negra un marcador para el gen eliminado. Esto se llama una quimera, osea un ratón n con células normales y células modificadas 7) La scenncia se cruzan con un ratón blaco y cualquier ratón completamente negro será un ratón n KO, conteniendo el gen inactivado en cada célulac lula. Esto muestra que el gen inactivado está presente en todas las células d. El maíz z KO se confirma para el gen diana por PCR Retrovirus y transferencia génicag 1. Pue infectar a un animal manera muy eficiente e integrar DNA en genomas 2. Usa RNA como genoma e infecta célulasc sin matarlas 3. Durante al infección el RNA se convierte en DNA por la enzima transcriptasa reversa.. El DNA se integra en el genoma la célula huesped expresándose los genes víricos y formando el virus 4. Pue infectar diferentes tipos celulares con una sola copia DNA, pero solo pue llevar pequeas candidas DNA 5. Si el virus se usa como vector, el virus es inactivado eliminando los genes necesarios para el empaquetamiento y transcripción n reversa 3

4 Animales transgénicos nicos y sus aplicaciones A. Animales transgénicos nicos tiene genes eliminados (Knockout, KO) o genes añadidosadidos (Knockin,, KI) pendiendo la aplicación l animal B. Ratones 1. Se usa como molo para enfermedas humanas bien por KO l gen or reemplazando el gen normal con un gen mutado 2. Es posible usarlos como factorías as vivas: a. Productos transgénicos nicos como factor IX coagulación en leche animal b. El gen interés se be expresar bajo un promotor específico mamas c. Las proteínas que se secretan en la leche son más m fáciles aislar porque se puen unir a la membrana plasmática células grasa producida en la leche C. Vacas 1. Producidas por microinyección huevos siguiendo los pasos siguientes: a. Coleccionar óvulos terneras sacrificadas b. Maduración l óvulo in vitro c. Fertilización l óvulo in vitro d. Microinyección DNA en el pronúcleo masculino e. Desarrollar los embriones hasta el estadío blástula f. Cribar célulasc embriones es estadod blástula por el gen insertado (transgen) usando PCR g. Implantar los embriones en vacas recién fertilizada h. Nacimento terneros 2. Ingeniería a genética se usa en alterar composición la leche para producir proteínas humanas,, como insulina, eritropoietina (EPO), y anticuerpos monoclonales 3. Se puen generar vacas con una mayor resistencia a enfermedas, reduciendo la cantidad vacunas, antibióticos ticos y visitas veterinarios 4. Somatotropina bovina recombinante (rbst)) ha sido aprovada como droga animal y permite a las vacas incrementar la producción leche hasta un 25%. La controversia es que aunque se ha probado que la rbst no es tóxica en humanos y las vacas no tienen mayor cantidad proteínas en su cuerpo D. Cerdos, Ovejas y Cabras 1. Modificadas por ingeniería a genética como bioreactores para producir proteínas como factores VIII y IX coagulación, hormona l crecimiento e interleukinas 2. Las proteínas se puen secretar en leche ovejas y cabras sin efecto en los animales 3. Cerdos transgénicos nicos tienen problemas como letargo, piel más gruesa, problemas hígado, úlceras y artritis 4. El único éxito con cerdos ha sido con somatotropina cerdo producida en E. coli y usado para tratar cerdos 5. Xenotransplante a. El uso órganos animales en pacientes humanos b. Cerdos es el ánimal elegido puesto que son fácil crecer y cruzar, tiene órganos tamaño similar al humano y puen ser modificados genéticamente ticamente. c. Preocupaciones sobre la tecnología a incluye aspectos éticos, uso órganos animales en humanos,, y enfermes como retrovirus endógenos porcinos (PERV), similar a HIV, que se pue transmitir a humanos d. El mayor obstáculo es impedir la respuesta inmune por el cuerpo humano. Cerdos alterados genéticamente con antígenos superficie modificados,, y la producción cerdos sin una copia l gen implicada en respuesta inmune e. La primera aplicación será más probablemente el transplante isletas celulares porcinas productoras insulina cersos KO (que( no producen insulina cerdo) ) para tratar diabetes. Corazón n e hígado serán los primeros órganos transplantados E. Revolución n biotecnológica gica: Humanizacíon tejidos y órganos cerdos 1. PPL Therapeutics ha producido el primer cerdo clonado con un gen inactivado que codifica la enzima 1,3 galactosil transferasa (GT), que cataliza el movimiento galactosa a la superficie las células l cerdo 2. El sistema inmune humano, que reconoce la galactosa en células extrañas as ataca célulasc o tejidos con el azúcar car, causando el rechazo órganos 3. Cerdos con KO en los dos genes GT se están n investigado, junto con cerdos enanos que con tienen PERV y son seables para xenotransplantes 4. Los receptores usados por el PERV para entrar célulasc se han caracterizado,, y un método cribado se ha sarrollado para intificar si el PERV está en células animales, asegurando la inocuidad l xenotransplante 4

5 Aves 1. Productos granja como el pollo se pue mejorar disminuyendo el contenido grasa y colesterol los huevos 2. Los huevos puen servir como bioreatores para producir proteínas valiosas a través conseguir que secreten proteínas valiosas ntro l huevo 3. Los retrovirus son candidatos para la transfección embriones en estado blatormos.. Los problemas mayores es la inestabilidad l gen introducido y el pequeño o tamaño.. La estructura l óvulo hace dificil la penetración n por microinyección 4. El uso liposomas en un posible sistema transformación células l blastormo. Células transformadas se insertan en embriones l huesped bajo l espacio subgerminal para producir un animal quiméricol Propagación animal A. Inseminación artificial 1. Permite animales interés s genético ser cruzados má eficientemente, permitiendo el esperma diluido un un toro ser inseminado entre 500 y 1000 vacas 2. Usado en ternero para incrementar la frecuencia caracteres interés 3. Ha incrementado la diversidad genética animales en extinción entre zoológicos B. Clones animales 1. Clonación germoplamas vivos (lifestocks)) ha sido común durante los últimos 20 años 2. Las células se puen separar spués fertilizar (entre 8 y 19 células), y los embriones se puen sarrollar como gemelos. Esto se ha intentado en humanos pero producen embriones fectivos y no se implantaron 3. Métodos transferencia nuclear incrementa el número scendientes una hembra a cientos o miles a. La primera clonación animal con éxito fué el una oveja en 1986, pero los estudios se iniciaron en los 1950s, don núcleos células en diferentes estados sarrollo se transfirieron a óvulos enucleados (sin núcleo) ) para estudiar el sarrollo una rana leopardo b. La comercialización n permite caracteres interés ser propagados y mantenidos en organismos vivos,, para aplicaciones en agricultura y medicina 5

6 4. Electrofusión La clonació clonación Dolly a. Se realizó realizó en 1996 en el instituto Roslyn en Escocia y fue la primera vez que un animal fue clonado usando ccé élulas somá somáticas b. El m mé étodo usado fue: fue: 1) A ccé élulas ovulo en metafase se les eliminó eliminó el n nú ú cleo 2) Una ccé é lula mamaria oveja en cultivo se le eliminó eliminó los nutrientes para que entre en el ciclo estacionario G0 3) Las dos ccé élulas se fusionaron por choque el elé éctrico ((electrofusi electrofusió ón) 4) Las cé células que se sarrollaron en cultivo para formar un embri embrió ón se introdujeron en una madre preparada hormonalmente para implantació implantaci ón 5) El embri embrió ón se sarrolló sarrolló totalmente y el genotipado DNA confirmó confirm ó que Dolly era un clon c. Dolly muri murió ó en 2003 un cá cáncer pulmó pulmón normalmente encontrado en ovejas m má ás edad; edad; aná análisis DNA mostró mostró que los tel teló ómeros eran m má á s cortos lo normal d. La controversia permanece, permanece, no está está claro si Dolly fue clonada una célula mamaria o una ccé élula madre embrionaria. Se necesitaron 277 para clonar Dolly, lo que lo hace muy ineficiente Pulso fusión Células se ponen juntas Fase Heterokaryon: Producto fusión núcleos distintos Fusión inducida por un pulso eléctrico 5. por que armó armó tanto revuelo? revuelo? Porque clonar pue producir sarrollos importantes: importantes: a. Se pue estudiar los efectos ambientales en animales idé idé nticos b. La gené genética las enfermedas pue estudiarse en má má s talle c. Se pue estudiar la gené gené tica l sarrollo en má más talle d. Animales modificados gené gené ticamente y clonados posteriormente puen producir grans cantidas proteí proteínas terapé terapé uticas humanas en la leche 6. Ratones se clonaron en 1998 usando una inyecció inyecció n nú cleo en óvulos enucleados, enucleados, y se han clonado cabras, cabras, conejos y gatos 6

7 Regulación animales transgénicos nicos A. Mucho más m preocupación n pública p animales que plantas transgéncias ncias, bido a su efecto potencial en el medio ambiente,, el riesgo a la salud consumir alimientos modificados genéticamente B. La crítica tiene preocupación n porque la FDA quiere regular animales modificados genéticamente la misma manera que drogas animales, animales transgénicos nicos puen ser aprovados masiado rápido r y sin la revisión n l gobierno Patente animales modificados genéticamente A. En 1930 el congreso los EEUU aprobó el Acto patentes, pero plantas no se patentaron hasta En 1987, la oficina patentes EEUU claró que organismos multicelulares no humanos que no ocurren normalmente, incluyendo animales se puen patentar B. Patentes,, tramarks, copyrights, y andtra secrets se consiran propiedad intelectual y hay un gran bate por sarrollos en biotecnología en los últimos 15 años.. Mucho bate se ha generado en patentes animales C. Se incluye interrogantes sobre posibles consecuencias los usos comerciales organismos patentados, incluyendo implicaciones medioambientales,, la salud l animal modificado y efectos potenciales l proceso evolutivo D. Agricultores están n preocupados patentes animales, puesto que animales patentados puen generar un menor número n granjas y más potentes y pequeños granjeros no puen tener la nueva tecnología o animales E. Discusiónes abiertas sobre aspectos éticos, sociales,, y legales osn importatnes para asegura el progreso acuado la biotecnología 7