COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTES (LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO; INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO) EN LA PRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO.

Transcripción

1 COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTES (LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO; INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO) EN LA PRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO. STEFANIA PINEDA GONZÁLEZ SILVIA MARÍA PINILLA ARENAS UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA BOGOTÁ D.C 2007

2 COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTES (LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO; INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO) EN LA PRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO. STEFANIA PINEDA GONZÁLEZ Código SILVIA MARÍA PINILLA ARENAS Código Trabajo para optar al título de MÈDICO VETERINARIO. DIRECTORES Dr. César Augusto Díaz Rojas Docente del área de Reproducción Animal, Universidad de la Salle Dr. David O. Pineda S. Docente del área de Reproducción Animal, Universidad UDCA. UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA BOGOTÁ D.C 2007

3 DIRECTIVOS Rector Hermano Fabio Gallego Arias Vicerrector de promoción Y desarrollo humano Hermano Edgar Figueroa Abrajim Vicerrector Administrativo Dr. Mauricio Fernández Fernández Decano de la facultad Dr. Pedro Pablo Martínez Méndez Secretario Académico Dra. María Teresa Uribe Mallarino. i

4 AGRADECIMIENTOS. Al Programa de Medicina Veterinaria de la Universidad de la Salle. A la Policía Nacional de Colombia en especial al Mayor Bulla, Capitán Bonilla, Teniente Vega, Teniente Rojas, Teniente Carolina y a todo el personal del criadero Mancilla, por facilitarnos las posibilidades para realizar esta investigación. Al Doctor David Pineda, por toda su colaboración, atención, dedicación paciencia y conocimientos brindados, los cuales nos orientaron e hicieron posible el desarrollo de este trabajo. Al Doctor César Díaz, que con su paciencia, colaboración y ayuda nos oriento para sacar adelante este proyecto. Y a todas aquellas personas que de una u otra forma nos ayudaron y nos apoyaron durante la realización de este trabajo. ii

5 COMPROMISO Todo lo escrito y expuesto en este trabajo se encuentra bajo parámetros de responsabilidad y honestidad, y los contenidos que aquí se manejan son de carácter estrictamente educativo y científico; por tanto tampoco incluye ideas que sean contrarias a la doctrina de la iglesia católica en asuntos de dogma y moral. iii

6 RESUMEN El presente trabajo se llevó a cabo en la ciudad de Facatativá Cundinamarca en el criadero Mancilla que pertenece a la Policía Nacional de Colombia, donde contamos con 12 ejemplares de diferentes razas de tiro pesado; con los que realizamos el estudio de la comparación entre el diluyente lactosa-edta-yema de huevo, como control y el nuevo diluyente propuesto INRA-D-Formamida-Yema de huevo. Para tal investigación, se tomaron muestras de semen de cada uno de los doce caballos y se analizó por examen macroscópico y microscópico cada eyaculado, posteriormente realizamos el proceso de congelación del semen con cada uno de los diluyentes, después se realizó el proceso de descongelación; enfatizando en los porcentajes de motilidad, supervivencia, y viabilidad del semen post-descongelación, de esta forma obtenemos los resultados de cada semental expresados en porcentaje, luego se procede a promediar y estandarizar los resultados mediante el método estadístico ANAVA. De esta manera se puede determinar que el diluyente INRA-Dimetil-formamida-yema de huevo, obtuvo mejores resultados en porcentajes de motilidad, cantidad de espermatozoides vivos y presencia de espermatozoides anormales. Sin embargo en cada una de las morfoanomalías, tanto mayores como menores, no hubo diferencia entre los dos diluyentes. Por otra parte no se presentó ninguna diferencia entre las muestras envasadas en pajillas de 0.5 y las envasadas en pajillas de Por lo anterior, este trabajo permite establecer, cual de los dos criopreservantes protege mejor las células de los efectos adversos del proceso de congelación y por lo tanto cual aumenta los porcentajes de fertilidad; además según los resultados obtenidos se puede establecer que tipo de envase es el más conveniente con respecto a la congelación del semen. iv

7 ABSTRACT The present work was developed in Facatativa - Cundinamarca at the Mancilla Breeding Place, owned by the Colombian National Police, where we used 12 heavy work different breed horses; with them, we developed the comparison study between the lactose-edta-egg yolk, as a control and the new proposed diluents INRA-D-Formamida-egg yolk. For such investigation, semen samples where taken from each one of the 12 horses and it was analyzed by macroscopic and microscopic examination of each ejaculation, then, we developed the semen freezing process with each one of the diluents, after, the de-freezing process was developed; taking into account the motility percentages, survival, and post defreezing semen viability. In this manner we obtain the results of each expressed in percentage. Then, the results are averaged and standardized using the ANOVA statistics method. In this manner, It can be determined that the INRA-D-Formamida-egg yolk obtained better results in motility percentage, live spermatozoids and abnormal spermatozoids. Nevertheless, on each one of the major and minor abnormalities, there was no difference between the diluents. By other way, there was no difference between the samples with different size of packing, 0.5 and Because of the above, this work makes possible to establish, which one of the two cryo-preservants is better to protect the cells from the adverse effects of the freezing process and increase the fertility percentages; In addition, in accordance with the obtained results, the most convenient type of packing can be established for the semen freezing process. v

8 TABLA DE CONTENIDO Pag. INTRODUCCIÒN 1 1. MARCO TEÒRICO CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN EN CABALLOS Metabolismo del Espermatozoide SISTEMA DE RECOLECCIÓN DEL SEMEN EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL SEMEN Examen Microscópico Examen Microscópico CHOQUE TÉRMICO CENTRIFUGACIÓN DILUYENTES DEL SEMEN SISTEMA DE CONSERVACIÒN DE SEMEN EQUINO Refrigeración del Semen Criobiología espermática Utilización de Crioprotectores Alternativos Adición del diluyente de congelación Congelación y almacenamiento Descongelación del semen FERTILIDAD DEL SEMEN CONGELADO MATERIALES Y MÉTODOS MARCO GEOGRÁFICO MARCO DEMOGRÁFICO COLECTA DEL SEMEN EVALUACIÓN DEL SEMEN Evaluación Macroscópica Evaluación Microscópica CENTRIFUGACIÓN 43 vi

9 2.6 ADICIÓN DE DILUYENTES DE CONGELACIÓN CONGELACIÓN ANÁLISIS ESTADÍSTICO RESULTADOS Y DISCUSIÓN CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN PRE Y POST CONGELACIÓN CON LOS DILUYENTES LACTOSA - GLICEROL- YEMA DE HUEVO E INRA- DIMETIL-FORMAMIDA YEMA DE HUEVO PORCENTAJE DE ANORMALIDADES EN LOS ESPERMATOZOIDES DE SEMEN EQUINO, PRECONGELACIÒN Y POSTCONGELACIÒN CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA EVALUACIÓN DE SEMEN DE EQUINO ENVASADO EN PAJILLAS DE 0.5 Y CANTIDAD DE ANORMALIDADES PRESENTES EN EYACULADOS DE SEMEN EQUINO ENVASADOS EN PAJILLAS DE 0.5 Y CONCLUSIONES 79 RECOMENDACIONES 82 BIBLIOGRAFÌA 84 ANEXOS 90 vii

10 LISTA DE TABLAS Pag. Tabla 1. Medidas de valores seminales equinos, según varios autores 9 Tabla 2. Diluyentes utilizados para centrifugación de semen 17 Tabla 3. Diluyentes a base de leche descremada 17 Tabla 4. Diluyente Glucosa EDTA 18 Tabla 5. Diluyentes empleados comúnmente para la refrigeración del semen. 21 Tabla 6. Morfología Espermática (Eosina Nigrosina) 43 Tabla 7. Porcentaje de Motilidad de semen equino pre y post-congelación. 48 Tabla 8. Espermatozoides vivos en semen equino pre y post-congelación. 50 Tabla 9. Espermatozoides muertos de semen equino pre y post-congelación. 53 Tabla 10. Espermatozoides normales de semen equino pre y post-congelación. 54 Tabla 11. Espermatozoides anormales de semen equino pre y post-congelación. 56 Tabla 12. Anormalidades de cabeza de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 58 Tabla 13. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 59 Tabla 14. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 61 Tabla 15. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino Pre y post congelación. 62 Tabla16. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen de equino pre y post congelación. 64 Tabla 17. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 65 Tabla 18. Resultados de la evaluación de la motilidad de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 19. Evaluación de espermatozoides vivos de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 20. Espermatozoides muertos de semen equino envasado en pajilla de 0.5 y Tabla 21. Evaluación de espermatozoides normales de semen e quino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 22. Evaluación de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 23. Anormalidades de cabeza de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y viii

11 Tabla 24. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 25. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 26. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Tabla 27. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen equino envasado en pajilla de 0.5 y Tabla 28. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y ix

12 LISTA DE GRÀFICAS Pag. Gráfica 1. Porcentaje de Motilidad Espermática de semen equino pre y post-congelación. 48 Gráfica 2. Espermatozoides vivos de semen equino pre y post-congelación. 52 Gráfica 3. Espermatozoides muertos de semen equino pre y post-congelación. 53 Gráfica 4. Espermatozoides normales de semen equino pre y post-congelación. 55 Gráfica 5. Espermatozoides Anormales de semen equino pre y post-congelación. 56 Gráfica 6. Anormalidades de cabeza de espermatozoides en semen equino pre y post- congelación. 58 Gráfica 7. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 59 Gráfica 8. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino pre y post-congelación. 61 Gráfica 9. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino pre y post-congelación. 62 Gráfica 10. Gota Citoplasmática Distal de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 64 Gráfica 11. Anormalidades de Flagelo de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 65 Gráfica 12. Motilidad Progresiva de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica 13. Espermatozoides vivos de semen equino envasados en pajillas de 0.5 y Gráfica 14. Espermatozoides muertos en semen equino envasado en pajilla de 0.5 y Gráfica 15. Espermatozoides Normales en semen de equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica 16. Espermatozoides Anormales de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica 17. Anormalidades de cabeza de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica 18. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica. 19 Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica 20. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y x

13 Gráfica 21. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y Gráfica 22. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y xi

14 LISTA DE ANEXOS Pag. Anexo 1. Preparación de la solución de Formol Citrato 90 Anexo 2. Preparación del diluyente Glucosa-EDTA 90 Anexo 3. Lactosa-Glicerol-Yema de huevo 91 Anexo 4. INRA Dimetil- formamida-yema de huevo 91 Anexo 5. Curva de congelación de semen 92 Anexo 6.Estadística Descriptiva por Tratamiento 93 Anexo 7. Estadística Descriptiva por Pajilla 95 Anexo 8. Estadística Descriptiva por Tratamiento Pajilla 96 Anexo 9. Anava para Tratamiento 99 Anexo 10. Anava para Tratamiento y Pajilla 107 xii

15 INTRODUCCIÓN Como es notorio el crecimiento en los últimos años del interés por el uso de semen congelado en la industria equina, algunas razas importantes como el Cuarto de Milla y el Árabe, recientemente se incluyeron dentro del rol de las que permiten el uso de esta técnica. Hoy el 80% de todas las asociaciones de criaderos de caballos instaladas en los Estados Unidos de América y en muchos otros países, permiten la comercialización y el uso de semen criopreservado, lo que conduce a realizar estudios para evolucionar y hacer más efectivo el proceso de congelación y también obtener mejores porcentajes de supervivencia después de la descongelación. Estos estudios sobre técnicas adecuadas para preservación y almacenamiento del semen son de gran importancia en reproducción animal ya que posibilitan maximizar, el aprovechamiento de animales de alto potencial genético también como permiten la preservación por tiempo indeterminado de patrimonios genéticos de animales que puedan fallecer. 1 Existe sí la limitante en la criopreservación del semen, conocida como el factor diluyente o extender; en la actualidad existen varios protocolos de congelación que requieren estudios comparativos, que nos permiten identificar el diluyente más eficiente. La inseminación artificial equina proviene de tiempos atrás con los árabes en el siglo IVX; a principios del siglo XX empezó a ser empleada para la producción de caballos en masa y de esta forma nace el primer programa de inseminación artificial equina en Rusia. Afortunadamente en la década de los años 80 la inseminación artificial con semen congelado entró en auge y salió de la fase de estancamiento en que se encontraba. Trabajos coinciden en que el principal factor de variación que determina la congelación es propio del individuo, sin embargo el mayor y mas preocupante inconveniente es el choque térmico al cual están 1 Pineda. D. S., Biotecnología de la Reproducción en Animales Domésticos., Universidad de Nariño, Programa de Medicina Veterinaria. Pasto- Nariño p

16 expuestos los espermatozoides durante el proceso de congelación y descongelación, reduciendo así en gran medida la capacidad de fertilización y la calidad. Es por esta razón que varios autores y especialistas en el área de reproducción equina coinciden en la necesidad de utilizar un diluyente y un criopreservante que aporte lipoproteínas y energía que protejan al espermatozoide del choque térmico; sin embargo es el crioprotector el que durante el proceso de congelación lleva la mayor responsabilidad, siendo el glicerol un crioprotector penetrante clásico que aún con los avances actuales presenta inconvenientes con el semen equino, motivo por el cual las amidas y especialmente la Dimetil- Formamida se propone como una solución teniendo en cuenta sus características crioprotectoras y su poder de penetración celular. 2 Por otra parte, el uso de crioprotectores ha causado polémica en la comunidad científica, pues, aunque se requieren como constituyentes de los diluyentes para proteger las células espermáticas contra los efectos adversos de la congelación, Amman en 1995 reporta que no se ha logrado encontrar la sustancia más apropiada, así como tampoco la cantidad adecuada para tal fin. Las características fisicoquímicas de los crioprotectores no son suficientes para proveer las condiciones adecuadas ni la protección celular durante el proceso de congelación, en efecto se ha demostrado que el primer factor limitante es la toxicidad que este genera, produciendo lesiones tanto de tipo osmótico como bioquímico. De acuerdo a lo anterior, el presente estudio pretende comparar el efecto de los diluyentes LACTOSA-GLICEROL- YEMA DE HUEVO e INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO como criopreservantes de semen equino por medio de la evaluación de la motilidad y morfología espermática en muestras pre y postdescongelación y con dos tipos de pajillas 0.25 y 0.5 ml. Y así generar un protocolo de congelación novedoso para semen de equinos; con el cual se logre mejorar las tasas de fertilidad que se obtienen actualmente con otros diluyentes. 2 Braun, W.. Determining fertility in stallions.veterinary Medicine (1989).p

17 1. MARCO TEÓRICO 1.1 CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN EN CABALLOS El semen es el producto eliminado a través de la uretra durante la eyaculación; está formado por una fracción celular, compuesta por los espermatozoides, y una porción líquida (plasma seminal) que actúa como vehículo de los espermatozoides y está producida por las glándulas sexuales accesorias y una pequeña porción de fluidos procedentes del testículo, epidídimo y conducto deferente. 3 El espermatozoide del caballo, como el del resto de los mamíferos, está formado por varias porciones: cabeza, cuello, tracto intermedio y flagelo, cada una de las cuales cumple una función definida durante el proceso de fertilización. Todo el espermatozoide está rodeado de una membrana plasmática que a pesar de ser continua, presenta diferencias regionales en composición y función. La membrana plasmática esta formada por una doble capa de lípidos, una interfase de fosfolípidos y agua y un glicocáliz. Los principales lípidos encontrados en la membrana son fosfolípidos y colesterol. Cuanto mayor es la cantidad de fosfolípidos, mas fluida es la membrana. El 50% del peso de la membrana esta compuesto de otras proteínas, dichas proteínas estructurales pueden actuar como canales o poros para permitir el pasaje de pequeñas moléculas. Bajo ciertas circunstancias como el enfriamiento o la congelación, ocurre una transición de fase en la cual una porción líquida de la membrana plasmática se transforma en gel, pudiendo causar alteraciones estructurales irreversibles o disturbios metabólicos y muerte celular. 3 Kenney, R.M.; Hurtgen, J; Pierson, R; Witherspoon, D.; Simons,J. Clinical fertility evaluation of the stallion society for theriogenology Manual

18 En espermatozoides equinos la temperatura en que este cambio de fase ocurre de forma más intensa es 20.7 ºC más baja de la que genera el mismo fenómeno en las especies porcina y bovina, esto puede reflejar una variación en la tolerancia a caídas bruscas en la temperatura Metabolismo del espermatozoide Morel en 1999 afirma que la principal fuente de energía disponible para los espermatozoides eyaculados son los carbohidratos de sustrato extracelular. Y que los espermatozoides equinos metabolizan rápidamente los monosacáridos como la glucosa, pero tienen capacidad muy limitada para utilizar otros azucares o carbohidratos más complejos. La glucosa se liga a proteínas de transporte para atravesar la membrana plasmática. La necesidad energética es suplida en 90% por los sustratos exógenos y el restante 10% por fuentes intracelulares como los fosfolípidos. No hay almacenamiento de glucosa en células espermáticas. La producción endógena de ATP es relativamente constante. A partir de los sustratos exógenos, ella depende del medio y la temperatura. Amann en 1964 sostiene que los espermatozoides equinos dependen principalmente del metabolismo aeróbico para la producción de ATP. Álvarez y Storey en 1984 dicen que este metabolismo produce cantidades significativas de peroxido de hidrógeno en las mitocondrias, que tiene un efecto adverso sobre las membranas por causar la peroxidación de los lípidos, comprometiendo la integridad estructural, la motilidad, y la viabilidad espermática. 4 4 Palma, A. Gustavo, Biotecnología de la Reproducción, Balcarce, Argentina, p

19 Sustancias antioxidantes presentes en el plasma seminal reducen este efecto, después de consumido el oxígeno difundido en el plasma seminal o del diluyente, los espermatozoides pasan a depender del metabolismo anaeróbico que tiene como producto final el ácido láctico. 5 Mann en 1964 propone que el aumento de la concentración de ácido láctico en el medio extracelular conduce a una disminución de ph, la cual conduce a una disminución del metabolismo con reducción de la producción de ATP y consecuente disminución de la motilidad. Esto es observado en el enfriamiento lento de semen a 5ºC. El plasma seminal tiene importantes efectos en la motilidad de los espermatozoides, su capacidad de supervivencia y la resistencia de los espermatozoides a los cambios producidos durante los procesos de refrigeración y congelación, aunque su función aún no la comprendemos totalmente. 6 El plasma seminal contiene factores capaces de estimular o deprimir la motilidad del semen; la adición de plasma seminal a los espermatozoides obtenidos del epidídimo (0% plasma seminal) provoca un aumento inmediato de la motilidad. 7 Mientras que otros autores han observado una disminución en la motilidad del semen incubado con plasma seminal tras 24 a 48 horas de mantenimiento en refrigeración. 8 5 Pickett, B.W.; Sullivan, J.J.; Seidel, G.E. Effects of frequency of ejaculation on seminal characteristics and spermatozoal output. Journal Animal Science. 1975, p Amann, R.P.; Pickett, B.W. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science. 1987, p Jasko, D.J.; Moran, D.M.; Farlin, M.E.; Squires, E.L. Effect of seminal plasma dilution or removal on spermatozoal motion characteristics of cooleted stallion semen. Theriogenology. 1991, p Braun, J.; Sakai, M.; Hochi, S.; Oguri,N. Preservation of ejaculated and epididymal stallion spermatozoa by cooling and freezing. Theriogenology. 1994, p

20 Tanto el volumen del eyaculado como su concentración son parámetros muy variables, y presentan una baja repetibilidad incluso dentro de eyaculados de un mismo semental.sin embargo el volumen y la concentración están inversamente relacionados, de suerte que el número total de espermatozoides por eyaculado, que se obtiene como el producto de multiplicar el volumen del eyaculado y la concentración espermática, es un valor altamente repetible en caballos sometidos a un ritmo regular de eyaculación. 9 Los espermatozoides equinos presentan un tipo de movimiento ligeramente circular debido a la implantación paraaxial del flagelo; al menos un 50% o un 60% de los espermatozoides deben tener un movimiento progresivo SISTEMA DE RECOLECCIÓN DEL SEMEN Se han empleado diversos sistemas para la recogida del semen en los équidos. Algunos, como el condón o el dispositivo intracervical, no proporcionan muestras adecuadas y no son empleados normalmente excepto en aquellos sementales que no aceptan la vagina artificial, lo cual ocurre con mayor frecuencia en los caballos acostumbrados a realizar monta natural. La vagina artificial es el sistema óptimo de recogida de semen en los équidos. Existen varios modelos de vaginas artificiales: Nikishawa, Missouri, Hannover o el modelo Colorado; todas ellas están creadas bajo el mismo principio y constan de una doble camisa dentro de la cual se introduce agua caliente y en ocasiones aire con el fin de aportar la temperatura y presión adecuadas para estimular la eyaculación. Tischner desarrolló en Polonia un modelo de vagina artificial "abierta", que es empleada en muchos laboratorios debido a que permite la recogida selectiva de las distintas fracciones del eyaculado 11 9 Clément, F.; Vidament, M.; Magistrini, M. Estimation du pouvoir fècondant de ľ etalon. Special Reproduction des Equidès. 1992, p Malmgren, L. Assessing the quality of raw semen: A review. Theriogenology.1997, p Op cit. Palma A. G. 2001, p.527 6

21 Últimamente se han descrito técnicas alternativas de recolección de semen, Love en 1992 determina que la recolección de semen con Vagina Artificial es sin duda el método más eficaz para la obtención de un eyaculado. Cuando, debido a lesiones músculo-esqueléticas o neurológicas, el padrillo no logra hacer el salto o alcanzar la erección se puede intentar la recolección con Vagina Artificial en estación o utilizando métodos alternativos. 12 La xilacina, un agente alfa-adrenérgico, ha sido utilizado con el fin de inducir la eyaculación ex-copula en sementales incapaces de montar o de eyacular incopula. McDonnell y Love en 1991 emplearon xilacina para inducir la eyaculación en sementales normales obteniendo un eyaculado en el 25% de las pruebas. Otros alfa-adrenérgicos como la detomidina y la romifidina son capaces de inducir también la eyaculación ex-cópula; en la experiencia del autor los eyaculados obtenidos presentan menor volumen y mayor concentración que los eyaculados obtenidos mediante vagina artificial, pero tanto el número total de espermatozoides por eyaculado como la motilidad se encuentran dentro de rangos normales. 13 La temperatura interna de la vagina artificial en el momento de la recogida se sitúa entre 44 y 50ºC, debe procurarse que el eyaculado pase inmediatamente al tubo colector, atemperado a 38ºC, para evitar que los espermatozoides sean dañados por la alta temperatura. Sin embargo otros autores como por ejemplo W. Eduard Allen en 1994 sugiere que la temperatura del agua de la vagina artificial debe ser de 50 a 52ºC para conseguir una temperatura en su luz de unos 44 0 C McDonnell, S.M.; Love, C.C. Xilacine-induced ex copula ejaculation in stallions. Theriogenology. 1991, p Blanco, M.; Serres, C.; Del Río, A.; López, J.; Sánchez, J.; Meikle, A.; Gómez- Cuètara, C.; Mateos, E. Inducción de la eyaculaciòn ex cópula en equidos mediante métodos farmacológicos. I congreso Ibérico de Reproducción Animal. Estoril Portugal Pickett, B.W. Factors affecting sperm production and output. Equine reproduction. Ed. McKinon, Pennsylvania

22 Como estímulo sexual se emplea una yegua en celo, si no se cuenta con la posibilidad de una yegua en celo este se puede inducir por medio de la aplicación de Prostaglandina F2alfa o sus análogos o también con progestágenos, otra alternativa es el empleo de hembras con quistes ováricos o tumores de la granulosa, porque presentan celo permanente, o el empleo de hembras ovariectomizadas con o sin tratamiento estrogénico en pequeñas dosis de 0.12 a 0.25 mg (Cipionato de estradiol) a intervalos superiores a 4 días EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL SEMEN La evaluación de semen se realiza como parte del examen andrológico para verificar la potencia generandi en la compra y venta de reproductores, antes del inicio de la temporada de monta e inseminación artificial. El análisis clásico comprende la evaluación de la concentración, número total de espermatozoides en el eyaculado, motilidad y morfología. Los valores fisiológicos se muestran en la tabla 1. El análisis aislado de los valores espermáticos no presenta alta correlación con la fertilidad del padrillo. Sin embargo el porcentaje de espermatozoides viables, mótiles presentan alta correlación con la fertilidad del macho. El semen equino presenta grandes diferencias en la calidad entre los eyaculados de un mismo individuo, por ello es necesario realizar el examen de varios eyaculados para determinar la calidad del semen, analizando dos eyaculados obtenidos con una hora de intervalo o estableciendo la media de una serie de eyaculados. 15 En los animales mantenidos en reposo sexual el primer eyaculado contiene más espermatozoides y su motilidad es menor debido a la eliminación de los espermatozoides acumulados en las ampollas y conductos deferentes, los cuales al estar almacenados a temperatura corporal tienen una menor motilidad. 15 Pattie W.A.; Dowset, K.F. The repeatability of seminal characteristics of stallions. Journal Reproduction fertility. 1982, p

23 Para la realización de las determinaciones de calidad seminal se debe eliminar el gel del eyaculado, mediante filtración o aspirado, ya que los espermatozoides se adhieren al gel dificultando las observaciones. 16 Tabla 1. Medidas de valores seminales equinos, según varios autores 17 Autor/es Valores seminales Pickett y col Dowsett y Klug(1982) Mattos y col (2975) Pattie (1982) (1989) Volumen total (ml) Volumen sin gel (ml) Volumen de gel (ml) Concentración (10 6 /ml) Nr. Total de Epz Motilidad total (%) Movimiento Progresivo (%) Epz Vivos (%) Epz sin alteraciones morfológicas (%) Examen Macroscópico Después de retirado el recipiente recolector de la VA, se debe tomar precaución de no someter el semen a cambios bruscos de temperatura. La fracción gel, producida por las vesículas seminales, debe ser separada lo más rápido posible, debido al efecto negativo que tiene sobre los espermatozoides. Algunas vaginas 16 Op cit. Clément, F.; Vidament, M.; Magistrini, M. 1992, p Op cit. Palma A. G. 2001, p

24 artificiales poseen filtros descartables, cuando eso no ocurre es posible adaptarles un filtro. Amann y col en 1983 reportan que los filtros de nylon con poros de 37µm son los más indicados porque retienen un número menor de espermatozoides Volume. El volumen del eyaculado es la suma del volumen del semen y el gel. El volumen del semen sin el gel es determinado a través de la lectura de la probeta graduada, después de la filtración. - Aspecto. Después de la separación del gel el aspecto del semen es evaluado, teniendo en cuenta como base su coloración y consistencia. La coloración del semen varía de gris ceniza a blanco y la consistencia puede variar de acuoso a lechoso. El aspecto del semen da una idea de la concentración espermática. Cuanto más blanco lechoso, mayor es su concentración. Además de eso, la apariencia permite establecer la presencia de urospermia y hemospermia. En caso de urospermia, su presencia puede ser detectada por el olor a orina en el semen. - ph. El ph del semen equino varía entre 6,2 y 7,8 esto es un reporte de Amann y col en Sin embargo otros autores como Kenney y col en 1983; reportan que el ph del semen equino se sitúa entre 7.2 y 7.6. Pickett en 1993, afirma que el ph está inversamente correlacionado con la concentración, de manera que con concentraciones menores el ph tiende a ser mayor. El ph puede ser medido por medio de un potenciómetro o de manera menos exacta, a través de cintas indicadoras de ph. Este debe ser determinado inmediatamente después de la recolección por que el reposo genera la formación de ácido láctico. 18 Op cit. Palma A. G p

25 1.3.2 Examen Microscópico - Pruebas de motilidad Tras la recogida del eyaculado el primer parámetro que debemos analizar es la motilidad, debido a que ésta se altera por los cambios de temperatura y el tiempo de incubación.después de la recolección se inicia una disminución progresiva de la motilidad espermática. Por eso la evaluación de la motilidad debe ser determinada inmediatamente o como máximo, 5 minutos después de la recolección. La motilidad será evaluada tanto en el semen in natura como en el diluido. Para el estudio de la motilidad en este momento se pueden usar soluciones diluyentes como aquellas utilizadas para el enfriamiento del semen preferentemente aquellas con yema de huevo porque esta torna la solución ópticamente opaca; sin embargo, el semen puro tiende a aglutinarse lo que dificulta la estimación. Para una mejor evaluación el semen debe diluirse en un medio adecuado a una concentración constante entre 25 y 50 x 10 6 spz/ml. Generalmente esta evaluación se realiza mediante la estimación subjetiva y se debe estimar el porcentaje de células mótiles o motilidad total (MT) y el porcentaje de células con motilidad progresiva (MP). 19 La estimación visual de la motilidad tiene el inconveniente de ser altamente subjetiva, y sus resultados dependen en gran medida de la experiencia del observador, por lo que se han desarrollado sistemas de análisis de semen asistidos por computador (Computer-Assisted Sperm Analysis, CASA) que permiten una mayor objetividad y la evaluación de un mayor número de parámetros para definir el movimiento de los espermatozoides Op cit. Palma A. G p Op cit. Malmgren, L p

26 La motilidad del semen presenta una correlación escasa con la fertilidad, tanto con el empleo de semen fresco como descongelado reporta Samper y col en 1991; En un estudio reciente Bedford y col en 1995 compararon la motilidad y fertilidad del semen refrigerado a 4 C en un diluyente de leche desnatada con o sin yema de huevo, a pesar de que la motilidad fue significativamente mejor en el diluyente conteniendo yema de huevo la fertilidad obtenida con este diluyente (17%) fue inferior a la obtenida con el diluyente sin yema (58%). Sin embargo la estimación de la motilidad continúa siendo el parámetro más empleado para la predicción de la capacidad fecundante del semen Número de espermatozoides El volumen de eyaculado, una vez filtrado y libre de gel, se determina mediante el uso de una probeta graduada, esta es una manera práctica de medir el volumen implementada por Pickett en Kenney y col en 1983 y Graham en 1996 proponen que la concentración de espermatozoides se calcula en millones de espermatozoides por mililitro (spz/ml), este parámetro es extremadamente importante para calcular el número de espermatozoides por eyaculado o el volumen de semen más diluyente necesario para preparar cada dosis de inseminación. La concentración de semen se calcula generalmente como lo reportan Pickett en 1993 y Graham en 1996 que es mediante espectrofotometría, este método determina la cantidad de luz dispersada al atravesar una muestra y la concentración se determina por comparación con una curva Standard. La medida de la concentración mediante espectrofotometría tiene un alto costo cuando se analizan pocas muestras y pierde precisión en eyaculados poco concentrados o contaminados, en estos casos es preferible el uso de una cámara hemocitométrica, afirman Pickett, en 1993 y Graham en Boyle, M.S. Artificial insemination: assessing stallion seminal quality after freezing. Equine Veterinary Journal. p

27 Para el recuento en la cámara de Neubauer puede ser utilizada una dilución de 1:20 o 1:40 en una solución fijadora de formol salina o hayem. El número total de espermatozoides se obtiene multiplicando la concentración por el volumen del semen ajustándose la unidad de medida a cm³ o mm³ Coloración supravital La coloración supravital realizada con eosina amarillada al 2% reportada por Krause en 1966; determina de forma mas objetiva las células viables para determinar la integridad de la membrana plasmática. Cuando las células sufren una lesión de la membrana, absorben el colorante. Los espermatozoides coloreados y sin colorearse se cuentan con un aumento de 400x hasta un total de 200 células. El resultado es expresado en porcentaje. Los espermatozoides no coloreados representan a las células viables y los coloreados a las células muertas. La determinación de las morfoanomalías puede realizarse en preparaciones húmedas o fijadas sobre un portaobjetos. Existen diversas clasificaciones para las alteraciones morfológicas, sin embargo la suma de las alteraciones de acrosoma y cabeza no deben pasar 5% y 10% respectivamente y el número total de las alteraciones no debe ser superior a 30%. Las anormalidades morfológicas de los espermatozoides se clasifican atendiendo a su origen como primarias, aquellas que se producen durante la espermatogénesis, o secundarias, cuando su origen se encuentra en la maduración y el paso a través del epidídimo o posteriormente. Este origen no ha sido comprobado en caballos por lo que se utiliza otra clasificación que divide las morfoanomalías en función de su efecto en la fertilidad como mayores (cabeza anormal, gota citoplasmática proximal, anormalidades de la pieza intermedia) y menores (cabeza suelta, gota citoplasmática distal y anomalías del flagelo) Op cit. Palma A. G p Opcit. Palma A. G. 2001,.p

28 1.4 CHOQUE TÉRMICO El enfriamiento del semen disminuye la actividad metabólica de los espermatozoides, reduce el crecimiento bacteriano y de esa manera, prolonga la viabilidad de los espermatozoides afirma Katila en El choque térmico, en equinos es el conjunto de alteraciones que los espermatozoides sufren cuando son sometidos a un enfriamiento rápido de 20 C a 5 C. Esas alteraciones están representadas por la pérdida rápida de motilidad, la alteración del tipo de motilidad con un movimiento retrogrado y circular, reducción del metabolismo, lesión del acrosoma y de la membrana plasmática, acompañada de pérdida de los componentes intracelulares. Estas alteraciones son en parte irreversibles. Con el enfriamiento, los lípidos sufren una transición a la fase líquida cristalina y posteriormente a una de gel. Una vez que se encuentran en estado de gel, los lípidos tienden a agregarse, además de volverse más permeables a los iones. Cuando los espermatozoides están alterados, los iones Na + y Ca ++ que entran a las células espermáticas son retirados por medio de transporte activo. A 5 C la permeabilidad al Ca ++ crece significativamente, superando la capacidad de eliminación de los iones por medio de las bombas de Ca ++. Así el Ca ++ se acumula en el espermatozoide alcanzando niveles tóxicos. 24 Es posible que el acrosoma sufra más, con estas alteraciones, una pérdida mayor de capacidad fecundante de la que sería esperado de la reducción de la motilidad. Los efectos del choque térmico son más evidentes en el congelamiento de semen, cuando los espermatozoides sufren alteraciones más semejantes a la capacitación y al envejecimiento. La severidad del efecto del choque térmico depende del grado de enfriamiento, intervalo entre temperaturas y la variación de la temperatura. Estos efectos pueden ser reducidos a través del enfriamiento controlando los 24 Hammerstedt, R.H.; Graham, J.K.; Nolan, J.P. Cryopreservation of mammalian sperm: What we ask them to survive. Journal of Andrology. 1990, p

29 intervalos críticos de temperatura entre 19 C y 8 C y por medio de la adición de lípidos (yema de huevo) o proteína (leche) en el diluyente del semen. También fue sugerido que la variaciones de la composición y la concentración de NaCl es responsable de la variación de la tolerancia del semen de diferentes padrillos al enfriamiento y la congelación. 25 Los espermatozoides de algunos padrillos parecen ser más sensibles que otros a la presencia de plasma seminal, en estos animales más sensibles, disminuye el mantenimiento de la motilidad. La centrifugación y eliminación parcial del plasma seminal beneficia a los machos cuyos eyaculados presentan baja tolerancia al enfriamiento, almacenamiento, dilución del semen y acondicionamiento de rutina. 26 Esto es válido en particular para semen almacenado por más de 24h. Este procedimiento, sin embargo, no se justifica para el semen de padrillos, cuyos eyaculados toleran el enfriamiento y almacenaje usando procedimientos de rutina CENTRIFUGACIÓN El método más utilizado para la separación del plasma seminal de la fase rica en espermatozoides es la centrifugación. La misma permite la separación del plasma, aumenta la concentración espermática y también ofrece un mayor control de la dilución utilizada en el semen enfriado o congelado. Sin embargo la centrifugación no es inocua. Además de una pérdida de 10% a 20% de los espermatozoides en el sobrenadante, puede reducir la motilidad o aumentar el número de alteraciones morfológicas de las células espermáticas. Para reducir 25 Amann, R.O.; Graham, J.K.Spermatozoal function.equine Reproduction. Ed. McKinnon, Febiger, Pennsylvania Aurich, J.E.; Kühne, A.; Hoppe, H.; Aurich, C. Seminal plasma affects membrane integrity and motility of equine spermatozoa after cryopreservation. Theriogenology, 1996, p Nishikawa, Y. Studies on the preservation of raw and frozen equine semen. Journal Reproduction Fertility, 1975, p

30 ese efecto se puede disminuir la fuerza centrífuga, acortar el tiempo de centrifugación, usar diluyentes en la centrifugación (Tabla 2) y usar líquido isotónico denso sobre los espermatozoides. Para congelar el semen se agrega, comúnmente un diluyente a base de glucosa- EDTA o citrato-edta. 28 Después el botón de semen se resuspende con un segundo diluyente para el almacenamiento o criopreservación. Cuando el semen esta destinado a ser utilizado fresco o enfriado se emplea solo un diluyente para la centrifugación y resuspensión ya que no se lleva a cabo la criopreservación. El diluyente puede ser mezclado con el semen y colocado en fracciones. Importante es que sea preenriquecido para estar a la misma temperatura que el semen. La proporción semen /diluyente normalmente utilizada es de 1:1 o 1:2. Existe una gran variación en la fuerza centrífuga y la velocidad utilizada por los autores. Martin y col, en 1979 usaron 1000 gravedades durante 5min y Klug en gravedades durante 10 min. Otros autores como Brinsko y col en el 2000, emplearon una fuerza centrífuga menor durante un periodo mayor: 200 gravedades en 12 min o 400 gravedades en 15 min. 29 Tabla 2. Diluyentes utilizados para centrifugación de semen Diluyentes Glucosa-EDTA (Martín y col.,1997) Citrato-EDTA (Cochran y col.,1984) 28 Op cit. Pickett, B.W.; Sullivan, J.J.; Seidel, G.E.1975.p Op cit. Palma A. G. 2001,p

31 Tabla 3. Diluyentes a base de leche descremada 30. Leche descremada en polvo-glucosa de Kenney I (Kenney y col., 1975) INRA 82 (Magistrini y col., 1992; ljaz y Ducharme, 1995) Leche descremada en polvo-glucosa de Kenney II. (Kenney y col., 1975) Tyrode modificado por Kenney( ljaz y Ducharme, 1995) E-Z Mixin (Province y col., 1984, 1985) Medio Tyrode Tabla 4. Diluyente Glucosa -EDTA 31 Glucosa EDTA Bicarbonato Sódico Citrato sódico dihidrato Penicilina G. sódica Estreptomicina Agua Destilada 6gr. 0.37gr. 0.12gr. 0.37gr UI 50mg 100ml ph Osmolaridad 450mOsm 30 Op cit. Palma A. G. 2001,p Heitland, A.V.; Jascko, D.J.; Graham, J.K.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W. Mortility and fertility of stallion spermatozoa cooled and frozen in a modified skim milk extender containing egg yolk and liposome. Biology of reproduction. P

32 1.6. DILUYENTES DEL SEMEN Los diluyentes de semen contienen componentes protectores que permiten la sobrevivencia espermática fuera de tracto reproductivo. Además de esto aumentan el volumen de la dosis inseminante. Yema de huevo, leche y glicerol son los componentes más adicionados para la protección de los espermatozoides frente al descenso de temperatura. Las lipoproteínas presentes en la leche y la yema de huevo protegen a los espermatozoides del choque térmico. Substratos metabolizables como glucosa constituyen la fuente de energía para las células espermáticas. Los diluyentes deben contener sustancias con alta capacidad tampón para neutralizarlos. Los antibióticos son adicionados en forma rutinaria a los diluyentes para retardar o eliminar el crecimiento de bacterias que invariablemente contaminan el semen como consecuencia de la recolección. Como se muestra en la (tabla 4), los antibióticos más empleados son la penicilina G-potásica o sódica cristalina, la gentamicina o amikacina, la estreptomicina o penicilina G-potásica cristalina. La combinación de penicilina G-potásica cristalina con amikacina fue más eficaz en el control de bacterias anaerobias. La presión osmótica y el ph del diluyente deben ajustarse para favorecer la sobrevivencia espermática. La osmolaridad del plasma seminal es de 300 mosm/l aproximadamente. Mantener la osmolaridad del diluyente próxima a la isotonicidad (entre 277 y 322 mosm/kg.) favorece la motilidad espermática in Vitro afirman Mairellies y col en La osmolaridad de los diluyentes a base de leche puede variar entre 300 y 400 mosml/l, el valor ideal es 350mOsm/l. El ph de los diluyentes puede variar entre 6,7 y 7,2 sin afectar la calidad espermática durante el almacenamiento Brinsko, S.P.; Varner, D.D.Artificial insemination. Equine Reproduction. Ed. McKinnon. Pennsylvania

33 Por este motivo, cuando la gentamicina o amikacina, que reducen el ph del medio, son incluidos en el diluyente, debe ser adicionado bicarbonato de Na para ajustar el ph SISTEMAS DE CONSERVACIÓN DE SEMEN EQUINO Refrigeración del semen. El semen equino es refrigerado con el fin de alargar la vida de los espermatozoides equinos y mantener su capacidad fecundante, de esta manera el semen puede ser almacenado y transportado antes de su uso. La refrigeración del semen alarga la vida del espermatozoide al disminuir el metabolismo basal de la célula, esta disminución de la temperatura provoca una serie de daños en la célula que se conocen como choque frío o cold shock y que se traducen en un patrón irregular de movimiento, pérdida de la motilidad, alteración de la membrana acrosomal y plasmática, disminución del metabolismo y pérdida de componentes intracelulares. 34 Las alteraciones inducidas por el choque frío en los espermatozoides dependen de una serie de factores, entre los que se destacan la especie animal, la temperatura final alcanzada, la velocidad de refrigeración, la dilución y el tiempo de exposición a la temperatura final. 35 De una forma general, la refrigeración del semen diluido a temperaturas de 5 C a 6 C mantienen mejor la viabilidad espermática durante el almacenamiento en comparación con el mantenimiento a temperatura ambiente (15 C-25 C) Op cit. Palma A. G. 2001, p Watson, P.F. Artificial insemination and the preservation of semen. Marshall`s physiology of reproduction. Male reproduction. Lamming. Londres Amann, R.P.; Pickett, B.W. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science 1987, p

34 Este aumento de la viabilidad espermática es favorecido por la mayor reducción de la actividad metabólica a temperaturas bajas. Durante el enfriando, sin embargo, los espermatozoides están expuestos a los efectos negativos del choque térmico. La extensión de ese efecto adverso sobre los espermatozoides no depende tanto de la temperatura sino más de la velocidad con que desciende. Mattos y col en 1997 no observaron, sin embargo, una disminución significativa del semen enfriado 1 C/min hasta 4 C. La mayoría de los autores concuerdan que el enfriamiento lento (<0,03 C a 0,1-0,05 C/min) mantiene mejor la motilidad y la fertilidad de los espermatozoides equinos. 36 El semen diluido puede ser enfriado rápidamente de 37 0 a 20 C. La fase crítica, de mayor susceptibilidad de los espermatozoides al choque térmico, se encuentra en el intervalo entre 19 C y 8 C. El enfriamiento rápido puede ser retomado a partir de 8 C hasta la temperatura de almacenamiento, que varía entre 6 C y 4 C. Para minimizar los efectos del choque frío y el almacenamiento a bajas temperaturas es necesario en primer lugar diluir el semen en un medio adecuado, en segundo lugar refrigerar las células a ritmo inferior a 0.05 C/ minuto y por ultimo incubar el semen el menor tiempo posible. 37 Tabla 5. Diluyentes empleados comúnmente para la refrigeración del semen 38. Diluyente de leche desnatada (Kenney et al,1975) Diluyente glicina yema de huevo (H. merkt) 36 Pickett, B.W.; Komarek, R.J. Effect of cold shock and freezing on loss of lipid from spermatozoa. Journal Dairy Science.1996,p Ibid.1996,p Pickett, B.W.; Amann, R.P. Extension and storage of stallion spermatozoa. A review Equine Veterinary Science. 1987, p

35 Los diluyentes a base de leche descremada en polvo como Kenney o E-Z-Mixin son usados comúnmente para la dilución de semen para la Inseminación Artificial, tanto con semen fresco como refrigerado, por mantener bien la motilidad espermática y la fertilidad. La leche descremada UHT o la leche descremada en polvo reconstituida (10 g de leche en polvo con 0,1% de grasa en c.s.p 100ml de agua destilada; reportados por Meirelles y col en 1999), pueden ser utilizados como diluyentes para la preservación de semen equino refrigerado. Mattos en el 2000 sugiere que sean evaluadas diversas marcas, tanto de leche descremada en polvo como UHT, porque existen variaciones en los resultados obtenidos entre marcas. 39 Esto es atribuido a diferencias en la composición de estos productos, debido a la presencia de aditivos. Province y col en 1985 obtuvieron mejor mantenimiento de la motilidad espermática con diluyente a base de leche descremada en polvoglucosa que con el empleo de leche descremada. El uso de glucosa, una fuente extra de energía y bicarbonato, un tampón en los diluyentes Kenney y E-Z Mixin pueden ser los factores responsables de la mejor conservación de la motilidad rectilínea progresiva y de mejores índices de concepción obtenidos con estos diluyentes, frente a la leche descremada. El diluyente INRA 82 es comúnmente usado en Francia. Según ljaz y Ducharme en 1995, mantiene mejor la motilidad que el Kenney y E-Z Mixin. El Semen equino diluido con INRA82 refrigerado a 5 C durante 96h mantiene la motilidad total de 56%.Se cree que la gelatina presente en algunos diluyentes, puede tener una función estabilizadora de la membrana Martin, J.C.; Klug, E.; Günzel, A.R. Centrifugation of stallion semen and its storage in large volume straws. En: Journal Reproduction and Fertility. (1979) Vol 27 p Pickett, B.W.; Amann, R.P. Extension and storage of stallion spermatozoa. A review Equine Veterinary Science. 1987, p

36 A pesar que la obtención de buenos resultados de preñez, diluyentes a base de gelatina, por ejemplo el diluyente a base de crema de leche y gelatina, no son utilizados comercialmente debido a que su preparación es más trabajosa y la presencia de partículas de grasa no permite la evaluación microscópica del semen. 41 El diluyente INRA 96, es un diluyente químicamente definido que incluye componentes de la leche. Mantiene la viabilidad espermática a 15 C por un periodo mayor que el diluyente INRA 82. Semen diluido con INRA 96, mantenido a 15 C durante 72h resultó en 48% fertilidad/ciclo. Este diluyente es una alternativa para ser empleada en padrillos con espermatozoides sensibles al choque térmico afirma Batallier y col en Los diluyentes a base de yema de huevo son usados principalmente para la conservación de semen debido a su acción protectora la cual es atribuida a la fracción lipoproteína de baja densidad, los fosfolípidos que se ligan a la membrana plasmática. ljaz y Ducharme en 1995 observaron que semen diluido en diluyente Dimitropulos, alcanzó 56% y 41% de motilidad, después de la conservación a 5 C durante 24h y 48h respectivamente. 42 Está indicada la eliminación del plasma seminal, porque ocurre una interacción adversa entre el plasma seminal y la yema de huevo. Este efecto se manifiesta después de 6h de refrigeración como una detención de la motilidad espermática y después de 24h también, como una falta de la motilidad total, como lo reporta Bedford y col en Amann y Pickett en 1987 observaron que este efecto no se presentó, cuando la yema de huevo fué utilizada en una cantidad de 2%. Numerosos autores han ensayado el empleo de diversos aditivos para la dilución del semen equino con el fin de disminuir los efectos del choque frío, como la lactosa o la rafinosa y los liposomas de fosfatidilserina y colesterol o con el fin de 41 Op cit. Palma A. G. 2001, p Ibid,