Control Microbiológico de Alimentos

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1 Control Microbiológico de Alimentos Dpto. Química Orgánica GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

2 CONTROL MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Tema Página Mohos y levaduras 3 Análisis de leche fluida 4 Análisis de leche en polvo 9 Análisis de mantecas y margarinas 17 Análisis de helados 24 Análisis de carnes y productos cárnicos 30 Análisis de conservas 45 Recuento de filamentos de hongos en conservas- Cámara de Howard 49 Análisis de azúcar 51 Análisis de alimentos deshidratados 54 Tablas de NMP 59 Protocolo de informe 62 Anexo Clave para Identificación de Hongos 63 Bibliografía 69 Reglas básicas de higiene y seguridad en laboratorios 70 2

3 MOHOS Y LEVADURAS A- Método de siembra por dilución 1) Preparación de la muestra y las correspondientes diluciones -Pesar asépticamente 10 g del alimento en un Erlenmeyer con 90 ml de agua peptona 0,1% estéril y homogeneizar bien. -Tomar con pipeta estéril 1 ml de esta primera dilución (1/10) y pasar a un tubo con 9 ml de agua peptona 0,1% para obtener la dilución 1/100. De ser necesarias más diluciones, realizar este ultimo procedimiento en tubos conteniendo 9 ml de agua peptona 0,1% hasta llegar a la dilución deseada. 2) Recuento de mohos y levaduras a) Siembra por vertido en placa -Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. -Agregar agar YGC (Cloramfenicol-Glucosa-Extracto de Levadura) o DCPA (Diclorán- Cloramfenicol-Peptona-Agar) fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. -Dejar solidificar. -Incubar sin invertir a 25 ± 1ºC durante 5-7 días. -Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias. -Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilución aún cuando contenga menos de 10 colonias. Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica. -Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras/g de muestra. b) Siembra en superficie -Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de cuatro placas de agar YGC o DCPA perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). -Dejar solidificar. -Incubar sin invertir a 25 ± 1ºC durante 5 días. -Contar el número de colonias en las cuatro placas. Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica. Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras/g de muestra. B- Método de plaqueo directo -Transferir asépticamente los granos o partículas de alimentos a tres placas de Petri con agar DG18 (Diclorán-18% Glicerol), a razón de 5-10 partículas por placa. -Incubar sin invertir a 25 ± 1ºC durante 5-7 días. -Contar el número de partículas infectadas por hongos en las tres placas. -Expresar los resultados como porcentaje de infección. C Observación e identificación de géneros fúngicos -Identificar los diferentes géneros fúngicos presentes en los alimentos analizados. -Realizar observaciones macro y microscópicas e identificar las clases de hongos más comunes en los alimentos mediante la utilización de las correspondientes claves. 3

4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE FLUÍDA 1) Toma de muestra Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras o los tanques móviles de almacenamiento deben mezclarse hasta homogeneizar el contenido. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en condiciones asépticas en los recipientes de muestreo, utilizando para ello un cucharón o tubo de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml de muestra). Estas muestras se enfrían inmediatamente manteniéndolas a una temperatura de 0-4ºC, y se envían al laboratorio. Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfrían y se llevan al laboratorio lo más rápidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 h desde la toma de muestra. Previamente al análisis, se mezcla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el recipiente con el fin de lograr una distribución uniforme de los microorganismos en la muestra. 2) Preparación de la muestra -Colocar 1 ml de leche en un tubo de dilución que contiene 9 ml de agua peptona al 0,1%. -Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes tomando siempre 1 ml y transfiriendo este volumen a 9 ml de diluyente. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias. 3) Metodología de análisis a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas c) Recuento de bacterias psicrotróficas d) Recuento de coliformes totales e) Determinación de coliformes totales f) Recuento de coliformes a 45 C g) Determinación de Escherichia coli a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) Método de Breed-Newman (APHA, 1976) El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos. Preparación de la película -Mezclar bien la muestra por agitación. -Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm de lado. -Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño ángulo recto (ansa en L). -Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45ºC. -Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno durante 5 minutos. -Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos. 4

5 -Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente. -Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua común, el tiempo necesario como para que ésta no tome color. Secar nuevamente al aire. Solución colorante Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro. Examen microscópico La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión. Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstas se cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células. Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal, y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie. Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor de bacterias/ml o g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de bacterias/ml o g a bacterias/ml o g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a bacterias/ml o g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma de todos ellos. Cálculo Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución. Recuento Promedio de Recíproca de la Microscópico = microorganismos X FM X dilución Directo/ml o g por campo Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991) -Verter 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y agregar el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aproximadamente 44-46ºC. 5

6 -Mezclar para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. -Cuando las placas estén frías invertirlas e incubarlas a 30 ± 1 C durante 72 ± 3 h. -Contar las colonias y calcular el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. -Seleccionar las placas con recuento entre 30 y 300 colonias, multiplicar el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente e informar como UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml o g. c) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992) Este recuento puede realizarse bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo -Proceder de la misma forma que para el recuento de aerobios (b) pero incubando a 7ºC durante 10 días (21 C durante 25 h, o 18 C durante 45 h). Se informa como UFC de bacterias psicrótrofas/ml o g d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o mediante la técnica de número más probable (NMP) en medio líquido. d.1) Recuento en placa: Agar Bilis Rojo Violeta- Lactosa (ABRV-Lactosa) -Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. -Agregar aproximadamente 12 ml de agar ABRV fundido a 44-46ºC. -Mezclar y dejar solidificar completamente. -Agregar entonces 4 ml más de medio fundido. -Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC durante h. -Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. -Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). -Incubar a 30ºC durante h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. -Calcular el resultado en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales/ml o g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. d.2) Técnica del número más probable (NMP). Prueba presuntiva -Inocular por triplicado 1 ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. -Incubar a 30ºC durante 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. -De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. En este caso, se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Confirmación: Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar Agar Eosina Azul de Metileno (EMB). -Incubar a 30ºC durante h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro, rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. -Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml o g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas durante al confirmación. 6

7 e) Determinación de coliformes totales (Metodología descripta por Mossel, 1985) -Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo Triptona Peptona de Soja (CTS). -Incubar a 20-25ºC durante 5-6 h. -Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). -Incubar a 30 ± 1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de coliformes totales en 1 ml -Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar EMB. Incubar a 37 ± 1 C durante 24 horas. Las colonias típicas de coliformes son oscuras, rojas-rosadas o mucosas. Si se verifica crecimiento de estas características, se informa presencia de coliformes en 1 ml f) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) A partir de los tubos positivos de d.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. -Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). -Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/ml o g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. g) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos"; Ed. Acribia, 1985) -Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo Triptona Peptona de Soja (CTS). -Incubar a 20-25ºC durante 5-6 h. -Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). -Incubar a 30 ± 1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de E. coli. -Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. -Incubar a 44 ± 0,1 C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles las siguientes pruebas: 1- Gram 2- Siembra en tubo de fermentación caldo Verde Brillante 2% Sales Biliares con Lactosa. Incubar a 44 C durante 48 h. 3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44 C durante 48 h. 4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30 C durante 48 h. Resultados característicos: 1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas. 2- Fermentación de lactosa a 44 C con formación de gas. 3- Producción de indol a 44 C. 4- No utiliza citrato. Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación 7

8 De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes. En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. -Indicar las pruebas de identificación realizadas. 8

9 ANÁLISIS DE LECHE EN POLVO 1- Toma de muestra Para el muestreo, es preferible tomar como muestra los recipientes o paquetes originales, sin abrir. Cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomará en un punto cerca del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando la capa superficial de polvo con un instrumento esterilizado, y extrayendo después la muestra con una cuchara o varilla esterilizada. ICMSF recomienda para cada producto a granel tomar no menos de 30 g. 2- Preparación de la muestra -Con una cuchara estéril mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. -Pesar asépticamente 10 g de muestra en un Erlenmeyer que contenga 90 ml de agua peptona 0,1% previamente calentada a no más de 45ºC. -Agitar hasta disolución de grumos. -Preparar las siguientes diluciones transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de diluyente. La mayoría de las leches en polvo pueden ser disueltas en agua peptona al 0,1% o en solución salina de fosfatos tamponada. Las muestras más insolubles (por ejemplo leches de alta acidez) se disuelven bien agregando 1,25% de citrato de sodio a la solución de fosfatos. 3- Metodología de análisis a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas c) Recuento de coliformes totales d) Recuento de coliformes a 45 C e) Recuento de Staphylococcus aureus f) Determinación de Salmonella a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) Método de Breed-Newman (APHA, 1976) El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos. Preparación de la película -Mezclar bien la muestra por agitación. -Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm de lado. -Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa en L. -Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45ºC. -Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno durante 5 minutos. -Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos. -Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente. -Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua común el tiempo necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire. 9

10 Solución colorante Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro. Examen microscópico La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión. Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstas se cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células. Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal, y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie. Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor de bacterias/ml o g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de a gérmenes/ml o g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a gérmenes/ml o g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma de todos ellos. Cálculo Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución Recuento Promedio de Recíproca de la Microscópico = microorganismos X FM X dilución Directo/ml o g por campo Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991) -Verter 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y agregar el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aproximadamente 44-46ºC. -Mezclar para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. -Cuando las placas estén frías invertirlas e incubar a 30 ± 1 C durante 72 ± 3 h. -Contar las colonias y calcular el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. 10

11 -Seleccionar las placas con recuento entre 30 y 300 colonias, se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente e informar como UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml o g. c) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable). c.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- Lactosa (ABRV-Lactosa) -Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. -Agregar aproximadamente 12 ml de agar ABRV fundido a 44-46ºC. -Mezclar y dejar solidificar completamente -Agregar entonces 4 ml más de medio fundido. -Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC durante h. -Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. -Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). -Incubar a 30ºC durante h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales/ml o g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. c.2) Técnica del número más probable (NMP). Prueba presuntiva -Inocular por triplicado 1 ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC durante 48 h. -Considerar positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. En este caso, se utilizarán tubos doble concentrado de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Confirmación: Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (Agar Eosina Azul de Metileno). Incubar a 30ºC durante h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro, rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. -Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml o g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas durante la confirmación. d) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) -A partir de los tubos positivos de c.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. -Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). -Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/ml o g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. 11

12 e) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145: 1990) Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución. En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma: -Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). -Dejar secar las placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas, incubarlas invertidas a 37 ± 1ºC durante h. -Tomar para enumerar, placas con no más de 150 colonias. -Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión Cerebro-Corazón (BHI). -Incubar a 37 C o 35ºC durante 20 a 24h. Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara. Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de horas, realizar: - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aproximadamente 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a C. Examinar después de 4 a 6 horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+). -Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación. -Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa de Baird Parker. S. aureus coagulasa positiva (3 o 4+) son cocos Gram positivos, catalasa y termonucleasa positivo. -Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/g de muestra. Para realizar el cálculo contar el número total de colonias confirmadas en las tres placas. f) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985) f.1) Preenriquecimiento en medio líquido (enriquecimiento no selectivo) -Preparar un Erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante (0,5 % Verde Brillante en agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos un día para autoesterilizar). -Pesar asépticamente 25 g de muestra en dicho Erlenmeyer. -Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h sin agitar. -Incubar a 37ºC durante h. -Si al cabo de 3 h de incubación todavía no se ha disuelto la leche en polvo, agitar el frasco para mezclar su contenido. f.2) Enriquecimiento en medio líquido (enriquecimiento selectivo) -Transferir 10 ml de enriquecimiento a 100 ml de caldo Tetrationato (Müller Kauffmann). -Incubar a 43 ± 0,5ºC durante h. -Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo Selenito-Cistina. -Incubar a 37 ± 1ºC durante h. 12

13 f.3) Aislamiento en medio sólido -A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). -Incubar las placas invertidas a 37 ± 1ºC durante h. -De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. -Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. -Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito, las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias verdosas. f.4) Identificación y confirmación -De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo (AN) para que desarrollen colonias aisladas. -Incubar a 37 ± 1ºC durante h. -Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. A partir de cada cepa realizar: 1) Tinción de Gram. 2) Prueba de oxidasa. 3) TSI. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. 4) LIA. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. 5) Sembrar un tubo de caldo urea. Incubar a 37ºC, 24 h. 6) Prueba de la β-galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solución salina fisiológica hasta conseguir una suspensión densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37ºC durante 20 minutos. Observar hasta las 4 horas de incubación para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la reacción es positiva. 7) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37 C. 8) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37 C. Resultados típicos de Salmonella spp. 1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas. 2) Oxidasa (-) 3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formación de gas/ superficie inclinada: rojo o sin variación. Salmonella es lactosa (-), la mayoría de las cepas, y sacarosa (-), la mayoría de las cepas. 4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayoría de los casos)/superficie inclinada: violeta. Salmonella es lisina decarboxilasa (+). 5) Ureasa (-), sin cambio de color. 6) β-galactosidasa (-) sin cambio de color. (+) se manifiesta por la aparición de color amarillo. 7) Indol (-) 8) Voges Proskauer (-) De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. 13

14 f.5) Confirmación serológica -La misma se puede realizar de dos maneras diferentes: a. Aglutinación somática: -Preparación del antígeno: utilizar un cultivo de estrías de 24 h de incubación a 37 C. -Suspender el crecimiento de la estría con 1ml de solución fisiológica. -Reacción: sobre lámina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes somáticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensión antigénica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada. -Lectura: debe ser inmediata y no después de 5 minutos. Las reacciones tardías o dudosas no deben considerarse. b. Aglutinación flagelar: -Preparación del antígeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en caldo. Luego agregar igual volumen de solución formolada al 5%. -Reacción: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensión antigénica. Incubar en baño maría a 50 C. -Lectura: se efectuará al cabo de una hora de incubación. Debe considerarse únicamente la aglutinación de tipo ciliar (flóculos esponjosos, fácilmente disociables). Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinación somática), no reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede: a) Tratarse de una variante inmóvil. b) Presentar otro tipo de antígeno ciliar no incluido en la lista. -Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. -Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis (25 g en nuestro caso). -Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. 14

15 REQUISITOS MICROBIOLÓGICOS DEL CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO - MERCOSUR LECHE Art. 558 (Res. MSyAS N 047 del ): La leche entera pasteurizada, deberá responder a las siguientes exigencias: a) Estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta: 1- Recuento total en placa: > bacterias mesófilas/cm 3 en los meses de abril a septiembre inclusive y > bacterias/cm 3 en los meses de octubre a marzo, inclusive. 2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): >50/cm Escherichia coli: presencia en 1 cm 3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas. 4- Prueba de la fosfatasa positiva. Art. 559 (Res. MSyAS N 047 del ): Leche entera seleccionada pasteurizada. Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, debe presentar un contenido microbiano no mayor de bacterias mesófilas/cm 3. La leche entera seleccionada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta: 1- Recuento total en placa: > bacterias mesófilas/cm 3 de abril a septiembre, inclusive y > bacterias mesófilas/cm 3 de octubre a marzo, inclusive. 2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): >10/cm 3 3- Escherichia coli: presencia en 1 cm 3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas. 4- Prueba de la fosfatasa positiva. Art. 559bis (Res. MSyAS N 047 del ): Leche entera certificada pasteurizada. Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, no debe presentar gérmenes patógenos y su contenido microbiano no debe ser superior a bacterias mesófilas/cm 3. La leche entera certificada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta: 1- Recuento total en placa: >5.000 bacterias mesófilas/cm 3 en el momento de su recepción por el consumidor. 2- Bacterias coliformes presencia en 1 cm Prueba de la fosfatasa positiva. Art. 559tris (Res. MSyAS N 328 del ): Se entiende por leche ultrapasteurizada a la leche, homogeneizada o no, que haya sido sometida durante por lo menos 2 segundos a una temperatura mínima de 138 C mediante un proceso térmico de flujo continuo, inmediatamente enfriada a menos de 5 C y envasada en forma aséptica en envases estériles y herméticamente cerrados. 15

16 Deberá responder a las siguientes exigencias: Categoría ICMSF Valores 1- Recuento de mesófilos totales/cm 3 : 3 n=5 c=2 m=10 2 M= Recuento de coliformes a 30 C/cm 3 : 6 n=5 c=2 m<3 M=10 3- Recuento de coliformes a 45 C/cm 3 : 6 n=5 c=1 m<3 M=10 4- Prueba de la fosfatasa Negativa 5- Prueba de la peroxidasa Negativa Leche UHT Res MS y AS Nº 110 del GMC Res. N 78/94 Microorganismos Criterio De Aceptación Categoria I.C.M.S.F. Método De Ensayo Microorganismos aerobios mesófilos n=5 c=0 m= FIL1008: 1991 viables/ml Resoluciones MS y AS: N 003 del y N 433 del Leche en polvo Criterios microbiológicos y tolerancias Microorganismos Microorganismos aerobios mesófilos viables/g Criterio de Aceptación (Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) Categoría I.C.M.S.F. n=5 c=2 m=30000 M= Método De Ensayo FIL100:A 1987 Coliformes (a 30 C)/g n=5 c=2 m=10 M=100 5 FIL 73A: 1985 Coliformes (a 45 C)/g n=5 c=2 m<3 M=10 5 APHA 1992 Cáp. 24 S. aureus coag.+/g n=5 c=1 m=10 M=100 8 FIL 60A: 1978 Salmonella spp./25 g n=10 c=0 m=0 11 FIL 93A:

17 ANÁLISIS DE MANTECAS Y MARGARINAS 1- Preparación de la muestra y diluciones: (FIL 73 A: 1985) -Colocar en un tubo estéril con capacidad para 50 ml, la muestra de manteca o margarina, de forma de no superar el 50% de la capacidad del tubo. -Fundir la muestra en baño de agua a 45ºC durante 15 minutos agitando para evitar la separación del suero de la grasa. -Transferir con una pipeta precalentada 10 ml de material fundido a un Erlenmeyer con 90 ml de agua de dilución estéril a 45ºC (dilución 1/10). -Homogeneizar por agitación evitando la separación de las fases. Las diluciones sucesivas se efectúan transfiriendo 1 ml a tubos conteniendo 9 ml de agua de dilución estéril a 45ºC. Alternativamente se puede trabajar solamente con la fase acuosa y sus diluciones. Permitir la separación de las fases (dejar reposar a 45 C por no más de 15 minutos) y tomar de la fase inferior 1 ml (equivale a 1 gramo de manteca). 2- Metodología de análisis a) Recuento de bacterias psicrotróficas b) Recuento de bacterias proteolíticas c) Recuento de bacterias lipolíticas d) Recuento de coliformes totales e) Recuento de coliformes a 45 C (coliformes fecales) f) Determinación de Escherichia coli g) Recuento de hongos y levaduras h) Recuento de Staphylococcus aureus i) Determinación de Salmonella a) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992) Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo. -Proceder de la misma forma que para el recuento de aerobios empleando agar para recuento en placa (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aproximadamente 44-46ºC. -Mezclar para lograr una distribución homogénea. -Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. -Incubar a 7ºC durante 10 días (o 21 C durante 25 h, o 18 C durante 45 h). -Informar el resultado como UFC de bacterias psicrótrofas/ml o g. b) Recuento de bacterias proteolíticas (APHA, 1992) Medio de cultivo: agar para recuento en placa (APC) con leche al 10%. -Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. -Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. -Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que antes. -Dejar solidificar. -Incubar invertidas a 21 ± 2ºC durante 72 horas. -Para revelar, si no se observaran directamente los halos de clarificación, inundar las placas con HCl 1% o ácido acético 10% durante 1 minuto, volcando luego el ácido excedente. -Si el recuento se realizó por duplicado, emplear las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Tener en cuenta la dilución empleada. 17

18 Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas, cuyo recuento corresponde al número de bacterias proteolíticas en 1 g de muestra. -Informar como UFC de bacterias proteolíticas/g. c) Recuento de bacterias lipolíticas (APHA, 1992) Medio de cultivo: agar Tributirina -Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. -Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. -Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que antes. -Dejar solidificar. -Incubar invertidas a temperaturas entre 20 a 30ºC durante 72 horas. La hidrólisis de la Tributirina se evidencia como una zona clara alrededor de las colonias. -Si el recuento se realizó por duplicado, emplear las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Tener en cuenta la dilución empleada. -Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas, cuyo recuento corresponde al número de bacterias lipolíticas en 1 g de muestra. -Informar como UFC de bacterias lipolíticas/g. d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable). d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- Lactosa (ABRV-Lactosa) -Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. -Agregar aproximadamente 12 ml de agar ABRV fundido a 44-46ºC. -Mezclar y dejar solidificar completamente. -Agregar entonces 4 ml más de medio fundido. -Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC durante h. -Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). -Incubar a 30ºC durante h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales/ml o g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. d.2) Técnica del número más probable (NMP). Prueba presuntiva -Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. -Incubar a 30ºC durante 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. -De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. 18

19 Confirmación: Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar Eosina Azul de Metileno). Incubar a 30ºC durante h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro, rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. -Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml o g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. e) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) -A partir de los tubos positivos de d.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. -Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). -Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/ml o g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. f) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos"; Ed. Acribia, 1985) -Inocular 1 g de muestra en 10 ml de caldo Triptona Peptona de Soja (CTS). -Incubar a 20-25ºC durante 5-6 h. -Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). -Incubar a 30 ± 1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de E. coli en 1 gramo. -Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. -Incubar a 44 ± 0,1 C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles 1-Gram 2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa. Incubar a 44 C por 48 horas. 5- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44 C por 48 horas 6- Siembra en agar citrato. Incubar a 30 C por 48 horas. Resultados característicos: 5- Coco bacilo Gram negativo no formador de esporas. 6- Fermentación de lactosa a 44 C con formación de gas. 7- Producción de indol a 44 C 8- No utiliza citrato Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes. En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las pruebas de identificación realizadas. 19

20 g) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990) -Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. -Agregar agar YGC (cloramfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. -Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma que antes. -Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25 ± 1ºC durante 5 días. -Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias. -Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilución aún cuando contenga menos de 10 colonias. -Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas cuyo número corresponde al número de hongos y levaduras en 1 g de muestra. Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica. Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras/g de muestra. h) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145: 1990) h.1) Aislamiento y recuento Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución. -En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma: -Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). -Dejar secar las placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas, incubarlas invertidas a 37 ± 1ºC durante h. -Tomar para enumerar, placas con no más de 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión Cerebro- Corazón. -Incubar a 37 C o 35ºC durante 20 a 24 h. Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara. h.2) Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de horas, realizar: - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aproximadamente 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a C. Examinar después de 4 a 6 horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+). Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación. -Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa de Baird Parker. S. aureus coagulasa positiva (3 o 4+) son cocos Gram positivos, catalasa y termonucleasa positivo. -Informar UFC /g de muestra. Para realizar el cálculo contar el número total de S. aureus coagulasa positivo de colonias confirmadas en las tres placas. 20

21 i) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985) i.1) Preenriquecimiento en medio líquido (enriquecimiento no selectivo) -Preparar un Erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante (0,5% Verde Brillante en agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos un día para autoesterilizar). -Pesar asépticamente 25g de muestra en dicho Erlenmeyer. -Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h sin agitar. -Incubar a 37 ± 1ºC durante h. i.2) Enriquecimiento en medio líquido (enriquecimiento selectivo) -Transferir 10 ml de enriquecimiento a 100 ml de caldo Tetrationato (Müller Kauffmann). -Incubar a 43 ± 0,5ºC durante h. -Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo Selenito-Cistina. -Incubar a 37 ± 1ºC durante h. i.3) Aislamiento en medio sólido -A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). -Incubar las placas invertidas a 37 ± 1ºC durante h. -De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. -Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. -Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito, las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias verdosas. i.4) Identificación y confirmación -De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. -Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. -Incubar a 37 ± 1ºC durante h. -Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. A partir de cada cepa realizar: 1) Tinción de Gram. 2) Prueba de oxidasa. 3) TSI. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. 4) LIA. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. 5) Sembrar un tubo de caldo urea. Incubar a 37ºC, 24 h. 6) Prueba de la β-galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solución salina fisiológica hasta conseguir una suspensión densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37ºC durante 20 minutos. Observar hasta las 4 horas de incubación para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la reacción es positiva. 7) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37 C. 8) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37 C. 21

22 Resultados típicos de Salmonella spp. 1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas 2) Oxidasa (-) 3) TSI: profundidad amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formación de gas/ superficie inclinada rojo o sin variación. Salmonella es lactosa (-), la mayoría de las cepas, y sacarosa (-), la mayoría de las cepas. 4) LIA: profundidad violeta o negro (negro en la mayoría de los casos)/superficie inclinada: violeta. Salmonella es lisina decarboxilasa (+). 5) Ureasa (-), sin cambio de color. 6) β-galactosidasa (-) sin cambio de color. (+) se manifiesta por la aparición de color amarillo. 7) Indol (-) 8) Voges Proskauer (-) De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. i.5) Confirmación serológica -La misma se puede realizar de dos maneras diferentes: a. Aglutinación somática: -Preparación del antígeno: utilizar un cultivo de estrías de 24 h de incubación a 37 C. Suspender el crecimiento de la estría con 1ml de solución fisiológica. -Reacción: sobre lámina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes somáticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensión antigénica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada. -Lectura: debe ser inmediata y no después de 5 minutos. Las reacciones tardías o dudosas no deben considerarse. b. Aglutinación flagelar: -Preparación del antígeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en caldo. Luego agregar igual volumen de solución formolada al 5%. -Reacción: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensión antigénica. Incubar en baño maría a 50 C. -Lectura: se efectuará al cabo de una hora de incubación. Debe considerarse únicamente la aglutinación de tipo ciliar (flóculos esponjosos, fácilmente disociables) Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinación somática), no reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede: a) Tratarse de una variante inmóvil. b) Presentar otro tipo de antígeno ciliar no incluido en la lista. -Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. -Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis (25 g en nuestro caso). -Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. 22