Identificación bioquímica de los bacilos Gram-negativos Capítulo 9. Iván Ferrer Rodríguez, PhD Catedrático

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1 Identificación bioquímica de los bacilos Gram-negativos Capítulo 9 Iván Ferrer Rodríguez, PhD Catedrático

2 2 Hoja de Reporte de Desconocidos

3 Bacilos gram negativos Identificación de bacterias: Morfología de colonias Pruebas bioquímicas en tubos Sistema de identificación rápidos Sistema de identificación automatizados Ensayos de biología molecular 3

4 Utilización de hidratos de carbono: Fermentación de lactosa: glucosa + galactosa: galactoside permeasa enzima trasportadora galactosidasa hidrolisa lactosa Se utiliza la glucosa mediante glucólisis (Figura 9.1) Bacterias con galactosidasa solamente son fermentadores lentos. El uso de los carbohidratos puede ser mediante oxidación (aeróbicamente) o fermentación (anaeróbicamente). MacConkey 4

5 Prueba de oxidación fermentación (OF): Se usa para diferenciar la familia Enterobacteriaceae (fermentadores) de los pseudomonads y organismos similares (no fermentadores). Contiene 1% de carbohidratos y 0.2% de peptonas. Indicador azul de bromotimol (Figura 9.2): Verde medio sin inocular Amarillo medio ácido Azul medio alcalino Se inoculan dos tubos: Aeróbico Anaeróbico se cubre con aceite mineral 5

6 Tripple Sugar Iron Agar (TSI) & Kliger s Iron Agar (KIA) Figura 9.3: Útiles en la identificación de patógenos intestinales. TSI contiene: Glucosa 0.1% Lactosa 1.0% Sacarosa 1.0% Sulfato ferroso Tiosulfato de sodio (H 2 S) Peptona Rojo fenol (ph 7.4) indicador amarillo bajo 6.8 KIA sólo tiene glucosa y lactosa. 6 Inoculación, incubación y lectura de resultados página 216:

7 Ortho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG): Se utiliza para diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa lentos, de los NO fermentadores. Se usan discos con ONPG, estructura similar a lactosa. ONPG entra rápidamente al interior de la célula bacteriana, sin la necesidad de utilizar la -galactósido permeasa. Es metabolizado por la galactosidasa y libera galactosa y o-nitro-fenol generando un color amarillo. Bacterias que producen pigmentos amarillos NO se deben probar. 7 Es similar a p-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (PNPG).

8 Ortho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG): Se puede hacer preparando una suspensión de bacterias en salina y añadiendo un disco comercial o tableta de ONPG. Se incuba a 37 C y se examina a las 6 horas. Dado que la galactosidasa es una encima inducible: El gen sólo se expresa si hay lactosa o un sustrato similar La bacteria debe obtenerse de un medio que contenga lactosa 8

9 Methyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC): Se usa para clasificar las Enterobacterias. La glucosa en el medio puede ser metabolizada por los microorganismos a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol). Con la adición de un indicador como rojo de metilo (MR) se puede detectar la presencia de productos ácido (Figura 9.5). Glucosa ácido pirúvico fermentación ácido-mixta (ph 4.4) 9 Color rojo con el indicador rojo metilo

10 Methyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC): Mediante la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio (VP) se puede evidenciar la presencia de productos finales neutros (Figura 9.5). Glucosa ácido pirúvico acetoina Diacetyl + KOH + naftol Algunas bacterias son negativas para ambas pruebas. Color rojo en presencia de 2-3 Butanediol 10

11 Decarboxylation Test: Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de las Enterobacterias. Se usan comúnmente dos aminoácidos: lisina, ornitina y arginina. Cuando los aminoácidos pierden el grupo carboxilo, se convierten en aminas que incrementan el ph del medio y el indicador (bromocresol púrpura) cambia a violeta. Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de ph (bromocresol púrpura). 11

12 Deaminase Test (Figura 9.6): Las desaminasas catalizan la pérdida de NH 3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico. Se inoculan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico al 10%, el cual reacciona con el acido y se torna oscuro. 12

13 Utilización de citrato (IMViC) (Figura 9.7): Se usa para clasificar las Enterobacterias. Se basa en la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía ya que el medio contiene: Citrato de sodio única fuente de carbono. Fosfato monoamónico única fuente de nitrógeno. El azul de bromotimol es el indicador de ph, que cambia a color azul en medio alcalino. El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. 13

14 DNasa: Las DNasas son endonucleasas que rompen los enlaces fosfodiester del DNA generando unidades pequeñas. Algunas bacterias producen DNasas extracelulares: Staphylococcus aureus Serratia marcescens 14

15 DNasa: El medio contiene DNA al 0.2%. Se hace un inóculo pesado en línea recta. Se incuba a 35 C y se examina a las horas. Se añade HCl y se evalúa la formación de un precipitado negro. DNA no hidrolizado es insoluble en HCl y se precipita. Oligonucleótidos se disuelven en el HCl y se ve un área clara. 15

16 DNasa: También se puede utilizar Agar DNasa, el cual es un medio diferencial. Contiene nutrientes, DNA y verde de metilo como indicador, el cual se une al DNA cargado negativamente. Cuando el DNA se rompe, ya no se une al verde de metilo y se aparece un halo claro alrededor del organismo: Staphylococcus aureus negativo Serratia marcescens positivo 16

17 Licuefacción de la gelatina: La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias secretan enzimas extracelulares que hidrolizan los polímeros y transportan los monómeros al interior de la célula. La producción de proteasas, como la gelatinasa, es evaluada incorporando una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada. 17

18 Producción de indol (IMViC): Detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. La liberación de indol se debe a la degradación del aminoácido triptófano, un aminoácido constituyente de muchas peptonas, mediante la enzima triptofanasa. Su usa un caldo de triptona, NaCl al 0.5% y el reactivo de Kovacs. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir el reactivo de Kovacs al medio, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si da negativo a las 24 horas, se repite a las 48 horas. 18

19 Utilización de malonato: Se hace para determinar la capacidad de utilizar malonato de sodio como fuente de carbono. El caldo de malonato tiene azul de bromotimol como indicador de ph. Las bacterias que usan malonato también sulfato de amonio como fuente de N Positivo por aumento en alcalinidad al usar sulfato de amonio, cambia indicador de verde a azul (Figura 9-10).

20 Motilidad: La motilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento se puede observar en cultivos frescos utilizando un microscopio de luz compuesto. La motilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación. Se puede hacer en medios de cultivo conteniendo agar al <4%. Se inocula el organismo en el centro de forma recta y se incuba a 35 C (y a temperatura ambiente) por horas. 20 Se examina y se compara con en medio sin inocular.

21 Reducción de nitrato y nitrito: Se detecta una respiración anaerobia en la que usa nitrato como aceptor final de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos mediante una reductasa de nitrato y en algunas bacterias, los nitritos se reducen a productos gaseosos (N 2 y N 2 O) mediante reductasa de nitrito. Se inoculan medios conteniendo nitrato potásico y el nitrito se detecta añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rojo. Para saber si el nitrato se redujo a gas: Tubo Durham. Añadir zinc en polvo, color rojo indica presencia de nitrato. 21

22 Oxidasa: La prueba de oxidasa determina la presencia del sistema de citocromo oxidasa. Es una prueba útil en la identificación de No-fermentadores (Pseudomonas spp.) y Neisseria spp., los cuales son positivos. Permite diferenciar entre las Enterobacterias (negativos) y los Nofermentadores (positivos). Hay varios métodos disponibles, incluyendo la prueba de Kovac (0.5-1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina). Se añade una gota a un papel de filtro y se toca la colonia con un palito de madera o algodón y se frota contra el reactivo. 22

23 Oxidasa: El desarrollo de un color lavanda en segundos se considera positivo. Oxidasa positivo - Pseudomonas aeruginosa Oxidasa negativo - Escherichia coli El reactivo también puede añadirse directamente sobre la colonia, pero 23

24 Ureasa: Se usa para determinar la capacidad de un organismo de usar la urea formando dos moléculas de amoniaco por la acción del enzima ureasa. Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona, urea al 2% y rojo fenol como indicador de ph. La enzima hidroliza la urea (H 2 N-CO-NH 2 ) y origina amonio, el cual genera un aumento en el ph, el cual puede detectarse con el indicador. Es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo tardío. 24

25 Lysine Iron Agar (LIA) asignación 25

26 Sulfide-indole-motility (SIM): Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse por la turbidez que producen alrededor de la punción. 26 Las cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato, siempre que el medio se mantenga a un ph mayor a 7.2.

27 Motility-Indole-Ornithine Agar (MIO): Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae. Por su composición, es posible detectar tres reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un turbidez en el medio o por crecimiento que se difunde más allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. La fermentación de glucosa baja el ph y cambia el indicador a amarillo. La acidez provee condiciones óptimas para la actividad de la enzima. La ornitina decarboxilasa decarboxila la ornitina presente. Se alcaliniza el medio y cambia el púrpura de bromocresol a color púrpura. 27

28 Sistemas de identificación manuales Los sistemas de identificación comerciales e basan en: Reacciones basadas en ph Reacciones enzimáticas Utilización de carbono Detección de crecimiento bacteriano Detección de ácidos grasos volátiles y no-volátiles por cromatografía 28

29 Sistemas de identificación manuales Normalmente se incluye una computadora o libros con códigos numéricos basados en el perfil metabólico de los microorganismo. API (Analytical Profile Index) para identificar Enterobacterias en el mercado desde API 20E Se genera un código de 7 dígitos. Requiere oxidasa, no incluida. Pruebas extras: nitrato y motilidad. 20 cápsulas liofilizadas en una tirilla con sustratos basados en ph. 29 Se prepara una suspensión de bacterias, se inocula, se incuba horas y se lee.

30 Sistemas de identificación manuales ID Tri-Panel Paneles para la identificación de organismos Gram-negativos y Gram-positivos usando pruebas bioquímicas. Se pueden probar hasta tres organismos en un panel. El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentes antimicrobianos para determinar susceptibilidad. Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel. Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa. 30

31 Sistemas de identificación manuales ID Tri-Panel Paneles para la identificación de organismos Gram-negativos y Gram-positivos usando pruebas bioquímicas. Se pueden probar hasta tres organismos en un panel. El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentes antimicrobianos para determinar susceptibilidad. Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel. Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa. 31

32 Sistemas de identificación manuales Otros: Crystal E/NF (Becton Dickinson) RapID NS Plus (Remel) Microbact (Oxoid) Enterotube II (Becton Dickinson) Uni-N/F Tek (Remel) GN2 MicroPlate (Biolog) Biolog tiene una de las bases de datos más grandes. 32

33 Sistemas de identificación automatizados MicroScan Sensititre Vitek BD Phoenix 100 Sherlock 33

34 34 Resumen:

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