WSSQ = w i (y i f(x i, )) 2

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1 Caso 205: Cálculo de V max y K M de la fosfata alcalina E. coli 1 Caso Cálculo de V max y K M para la hidrólisis de p-nitrofenil fosfato por fosfatasa alcalina de E. coli (Regresión no lineal con pesos estadísticos de réplicas)(f.j. Burguillo, USAL) CASO PRÁCTICO La reacción de hidrólisis del p-nitrofenil fosfato está catalizada por la enzima fosfatasa alcalina de Escherichia coli según la reacción siguiente: NO 2 -C 6 H 5 -O-PO 3 H 3 + H 2 O NO 2 -C 6 H 5 -OH + H 3 PO 4 Para el cálculo de sus parámetros cinéticos, se hicieron experiencias a siete concentraciones de sustrato y se midieron las velocidades iniciales de reacción. Se realizaron 5 réplicas para cada una de las siete concentraciones de sustrato (35 datos en total) y se obtuvieron los resultados que figuran en la tabla adjunta. [S] (µm) v (µmol L -1 min -1 ) La cinética de este tipo de reacciones catalizadas por enzimas, se interpretan en muchos casos con la ecuación de Michaelis-Menten: v = V max[s] K M +[S] El objetivo de este ejercicio es ajustar esta ecuación a los datos experimentales y determinar el valor de los parámetros V max y K m. La función a ajustar es no lineal en los parámetros, por lo que habrá que proceder a un ajuste por regresión no lineal. La desviación estándar asociada a cada concentración de sustrato se puede calcular en este caso a partir de las réplicas TEORÍA En general, la regresión de una variable dependiente y frente a una variable independiente x es de la forma: y = f(x, )+ donde θ es un vector de parámetros desconocidos e independientes (θ1, θ2, θ3,... θp ) y ε es el error experimental. Como es sabido, dados n pares de observaciones (x 1,y 1 ), (x 2,y 2 ), (x 3,y 3 ),... (x n,y n ), el método general de los mínimos cuadrados para estimar θ, consiste en calcular el valor θ que minimice la suma de cuadrados de los residuales: WSSQ = w i (y i f(x i, )) 2

2 2 Caso 205: Cálculo de V max y K M de la fosfata alcalina E. coli donde WSSQ es la llamada suma de residuales al cuadrado con pesos estadisticos (weighted sum of squares). Siendo w i el peso estadístico calculado como el inverso de la varianza de la medida ( 2 w i = 1/ i ). En el caso práctico que nos ocupa, hablaríamos de una Regresión no lineal con pesos estadísticos, tomando los pesos como 2 w i = 1/s i, siendo s i la desviación estándar de la muestra de 5 réplicas que tenemos a cada valor de concentración de sustrato Cuando la ecuación es no lineal en los parámetros, hay que utilizar métodos numéricos iterativos para encontrar el valor de los parámetros (θ) que minimizan WSSQ. Estos métodos son de dos tipos: Métodos de búsqueda directa y métodos de gradiente. SIMFIT utiliza una combinación de ambos métodos en secuencia (de búsqueda primero y luego de gradiente). PROCEDIMIENTO PASO A PASO 1.- Crear un archivo con los datos x,y (o abrir el archivo C:\curso\caso205.dat) Seleccionar en el menú principal la opción Archivo > Nuevo archivo tipo ajuste de curvas, para acceder a un cuadro de dialogo que nos ofrece varias posibilidades para introducir los datos. En este caso nos interesa marcar las opciones introducir las x en orden creciente y que las s en lugar de teclearlas las calcule el programa. A continuación aparece un nuevo cuadro de dialogo donde se escribirá el nombre del directorio y del archivo donde se desean guardar los datos (por ej.: C:\curso\caso205.dat). Después de pulsar OK, deberá ir contestando a preguntas sencillas que va haciendo el programa, incluida la del número de pares de datos que se desean introducir, finalmente se desplegará una pantalla donde se teclean solamente los datos x,y. Seguidamente se ofrecen diferentes opciones para calcular las s de los puntos: en este caso debemos elegir la opión de desviación estándar de la muestra. Finalmente, aparece un menú para inspeccionar los datos, elijamos mostrar tabla y aparecerá la tabla con los valores x,y tecleados y sus s ya calculadas (Observe que se adjudica el mismo valor de s a cada una de las réplicas y que no se hace, en

3 Caso 205: Cálculo de V max y K M de la fosfata alcalina E. coli 3 modo alguno, un archivo comprimido con medias, ya que en ese caso se perdería la información del número de puntos realizados y el número de grados de libertad en las pruebas estadísticas posteriores sería incorrecto). 2.- Ajuste de los datos a la ecuación de Michaelis-Menten Seleccionar en el menú principal la opción Ajustes y en el submenú que se despliega a continuación pulsar en la opción Suma de 1 a n ecuaciones de Michaelis-Menten. A continuación aparece una pantalla con tres opciones: Teoría, Uso normal, Modo despl. isotopico y Salir. Lo recomendable sería echar primero una ojeada rápida al tutorial de Teoría para entender las características de los posibles modelos a ajustar. Al finalizar, se pulsa en Uso normal y da comienzo el ajuste. En este modo normal, la ecuación general o modelo a ajustar sería: v = n 1 V max(i)[s] K m (i)+[s] donde n se llama grado del modelo (cuando n=1 tendremos la ecuación de Michaelis-Menten habitual, cuando n=2 tendremos la suma de 2 ecuaciones de Michaelis-Menten (2 isoenzimas)...etc). El programa nos pregunta primero el nombre del archivo con los datos a ajustar, contestaremos: C:\curso\caso205.dat. A continuación se pregunta el orden mas bajo del modelo a ajustar, en nuestro caso aceptaremos el 1 que viene por defecto. Luego el programa pregunta el orden mas alto del modelo a ajustar, a lo que contestaremos 1 (por defecto viene 2), ya que ahora deseamos ajustar la ecuación (1) con sólo 1 término de Michaelis-Menten (no queremos en esta ocasión comparar el ajuste a la ecuación (1) con 1 término con el ajuste a la ecuación (1) con 2 términos (eso lo haremos en el caso 7)). La pantalla siguiente nos ofrece diferentes métodos para elegir las estimas iniciales, seleccionaremos la que viene por defecto ( Busqueda al azar corta ). A continuación aparece un submenú para elegir los resultados del análisis que uno desea, dejaremos seleccionados los que vienen por defecto. Realizado el ajuste, el programa presenta en pantalla los parámetros encontrados: (1)

4 4 Caso 205: Cálculo de V max y K M de la fosfata alcalina E. coli En esta tabla aparece, junto con el valor de cada parámetro, el error estándar (desviación estándar) asociado a ese parámetro, así como los límites de confianza al 95 % para dicho parámetro (horquilla de confianza). La tabla muestra también, en la última columna de la derecha, la probabilidad p de que el parámetro sea redundante, es decir que sea tan próximo a cero que no esté justificada su inclusión en la ecuación, cuando p< 0.05 se considera que el parámetro es significativamente distinto de cero (esta prueba se realiza con el test t de Student). En este caso ninguno de los 2 parámetros es redundante y los límites de confianza al 95 % son buenos. A continuación el programa muestra la matriz de correlación de los parámetros, seguida de la tabla que muestra los datos experimentales junto a los valores teóricos ajustados. Por último, aparece una tabla con toda la estadística asociada al ajuste: Como puede observarse, todos los estadísticos son bastante buenos y no se despliega a la derecha ninguna bandera de alerta que indique que algún test no se ha superado. Seguidamente el programa muestra diferentes opciones para representar los datos, elegiremos Gráfica de ejes originales. Vista la gráfica anterior sería interesante pulsar cancel y, al regresar al menú de tipos de representación, podríamos elegir ahora la ópción Lineweaver-Burk. El programa

5 Caso 205: Cálculo de V max y K M de la fosfata alcalina E. coli 5 preguntará primero si queremos extrapolar hasta los ejes los símbolos o la línea, seleccionaremos la línea. Se obtendrá la conocida representación doble inversa de 1/v frente a 1/[S], que es lineal en este caso como es sabido. A continuación deberiamos pulsar cancel y, al regresar al menú de tipos de representación, podríamos elegir ahora la ópción Eadie-Hofstee. El programa preguntará de nuevo si queremos extrapolar hasta los ejes los símbolos o la linea, seleccionaremos la linea. Se obtendrá la conocida representación de v frente a v/[s], que es también lineal en este caso como es conocido. No es nuestro interés ahora, pero si se desea, estas gráficas se podrían editar a un nivel básico pulsando el botón Editar, o a un nivel avanzado (por ejemplo para dibujar barras de error, introducir texto...etc) pulsando el botón Avanzado que transfiere el control al programa SIMPLOT. Para terminar la sesión, pulsar Cancelar > Cancelar > Salir y se devolverá el control al menú principal. Un buen ejercicio sería volver a realizar el ajuste, pero seleccionando ahora un mayor número de opciones de visualización: Número de iteraciones, estimas iniciales, representaciones de los residuales...etc.