Criopreservación de semen en camélidos sudamericanos

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1 Sistema de Revisiones en Investigación Veterinaria de San Marcos Criopreservación de semen en camélidos sudamericanos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Autor: Katherine Choez Aguilera Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Medicina Veterinaria

2 TABLA DE CONTENIDO 1. PRESENTACIÓN INTRODUCCIÓN PRINCIPIOS GENERALES DE LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN INTENTOS DE CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EN CSA CONCLUSIONES LITERATURA CITADA... 6

3 Criopreservación de semen en camélidos sudamericanos Katherine Choez Aguilera 1. PRESENTACIÓN El objetivo de esta revisión es dar a conocer la técnica, implicancias, alcances y limitaciones inherentes al proceso de criopreservación del semen en camélidos sudamericanos (CSA). La criopreservación permite el mantenimiento de la viabilidad y funcionalidad celular a temperaturas bajas, por lo que es posible detener el proceso que sufre el espermatozoide desde la eyaculación hasta la fecundación y conservarlo en el tiempo potencialmente fértil. El fin de los protocolos de criopreservación es el de obtener mejores resultados en relación a la supervivencia espermática y fertilidad del semen al descongelamiento. Las experiencias en criopreservación de semen en CSA hasta el momento no han sido satisfactorias, lo que conlleva a una mayor investigación tanto de las características del semen, proceso de colección y procesos de conservación de espermatozoides en CSA. 2. INTRODUCCIÓN La criopreservación de semen y la utilización del semen congelado mediante inseminación artificial han causado un gran impacto sobre la reproducción animal y humana, debido a que favorece el comercio nacional e internacional de razas o líneas genéticas, formación de bancos de germoplasma, reserva genética, conservación de especies amenazadas o en peligro de extinción (Aller et al., 2003). En camélidos sudamericanos existe muy poca información sobre inseminación artificial usando semen congelado (Bravo et al., 1996); quizás debido a la falta de una metodología fiable de conservación de semen en CSA. La conservación de las estructuras espermáticas y de su capacidad fertilizante exige la reducción o interrupción reversible

4 del metabolismo celular. Esto se consigue mediante el uso de dilutores y la refrigeración o congelación que deprimen el metabolismo. Durante el proceso de criopreservación los espermatozoides se ven sometidos a diversos tipos de estrés, los cuales pueden inducir, en la célula espermática, daños letales o sub-letales los cuales comprometen su funcionalidad. La optimización de protocolos de criopreservación debe contemplar no solo la obtención de un alto número de espermatozoides sobrevivientes sino también la habilidad funcional de esta población. Para lograr esto, es necesario comprender a que tipo de estrés se ven sometidos los espermatozoides durante los procesos de congelación y descongelación así como la manera en que las células responden a las agresiones fisicoquímicas medioambientales. 3. PRINCIPIOS GENERALES DE LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN La preservación del semen en diversas especies es un importante campo de investigación, tanto para facilitar las posibilidades de reproducción de diversos individuos y así salvaguardar las características genéticas encaminadas a la mejora de las especies, como para la conservación de muchas especies y razas que están en extinción o cuentan con pocos ejemplares. El proceso de refrigeración forma parte del proceso de congelación del semen; sin embargo, también puede utilizarse como método de conservación a corto plazo para lo que necesita medios diluyentes adecuados que deben contener componentes específicos, es decir, una solución tampón, sales, azúcares y sustancias que aporten una cierta protección de la membrana contra el descenso de temperatura, como la yema de huevo. A diferencia de la refrigeración del semen, el proceso de congelación necesita también del empleo de un agente crioprotector que permita un descenso mayor de la temperatura. Desde el descubrimiento del glicerol como agente crioprotector efectivo (Polge et al., 1949) y del establecimiento de las técnicas básicas de criopreservación, el semen de una variedad de especies se congela y utiliza con éxito en la inseminación artificial. Sin embargo y con excepción de los bóvidos, la utilización generalizada de semen congelado no se ha extendido en las otras especies domésticas (Parks y Graham, 1992; Holt, 2000), en parte porque los protocolos de congelación no

5 proporcionan resultados aceptables de fertilidad (Parks y Graham, 1992). La reducción de la temperatura por debajo de los 37ºC y, principalmente, de los 20ºC induce una serie de alteraciones de naturaleza biofísica en el espermatozoide (Amann y Pickett, 1987). El mayor desafío para las células en el proceso de congelación no es resistir a las bajas temperaturas del nitrógeno líquido, sino mantener la viabilidad en un rango de temperaturas, entre los 15 y 60 o C, que las células experimentan por dos ocasiones, es decir, durante la congelación y durante la descongelación. A 196 o C no se producen reacciones térmicas, puesto que debajo de los 130 o C no existe agua en el estado líquido (Mazur, 1984). Con el enfriamiento de la suspensión celular por debajo de los 0 o C, se producen una serie de procesos nocivos para la célula que comienzan con la formación de hielo en el compartimento extra-celular. La membrana plasmática actúa como barrera, impidiendo la expansión de los cristales de hielo del medio exterior hacia el compartimento intra-celular (Watson, 1979). Las sales no forman parte de los cristales de hielo, de modo que habrá una considerable concentración de sales en la porción remanente del agua no-congelada. El aumento del gradiente osmótico a través de la membrana plasmática provoca la difusión del agua intra-celular hacia el ambiente extra-celular, causando deshidratación de la célula y de la membrana plasmática (Amann y Pickett, 1987). Por tanto la deshidratación osmótica, más que la formación de hielo intra-celular, es la principal causa de las alteraciones ultraestructurales de la membrana y una de sus consecuencias es la pérdida de la selectividad de la membrana (Parks y Graham, 1992). Cuando las células están sujetas a temperaturas inferiores a 0 o C, inicialmente súperrefrigeran. El modo en que recuperan el equilibrio depende del ritmo de refrigeración y de su permeabilidad al agua. Si el ritmo de enfriamiento es lento o si la permeabilidad al agua es elevada, las células se equilibran por la transferencia del agua intra-celular hacia el hielo externo, o sea, se equilibran por deshidratación; pero si son refrigeradas rápidamente o si su permeabilidad al agua es baja, éstas se van equilibrar, en parte, por congelación intracelular (Mazur, 1970). El ritmo de

6 enfriamiento debe, por tanto, tener en cuenta estos fenómenos (Amann y Pickett, 1987). La presencia de hielo extra-celular, aunque puede deformar las células, no causa ruptura de la membrana plasmática ni tampoco daños irreversibles (Watson, 1979). Por el contrario, la formación intra-celular de cristales de hielo provoca lesión y muerte de la célula. Dado que la formación de hielo intra-celular es dependiente del ritmo de congelación y descongelación, el estricto control del ritmo del descenso y del aumento de la temperatura puede minimizar las lesiones celulares causadas por el hielo intracelular. Sin embargo, si el ritmo de congelación es extremamente rápido el hielo intra-celular constituye micro-cristales y los daños derivados son muy reducidos (Amann y Pickett, 1987). El éxito final de un procedimiento de congelación está condicionado por el proceso de descongelación. Si el ritmo de enfriamiento es rápido, el de calentamiento también lo debe ser; alternativamente, si el ritmo de enfriamiento es lento también debe serlo el de calentamiento. Las células que contienen micro-cristales de hielo intracelulares deben ser re-calentadas muy rápidamente a fin de evitar la recristalización de estos pequeños cristales, en grandes cristales que pueden dañar las células (Amann y Pickett, 1987). La refrigeración y la congelación son acontecimientos que pueden conducir a la muerte o bien a alteraciones funcionales del espermatozoide. Las lesiones causadas en la membrana y en los distintos orgánulos del espermatozoide derivan de dos de los principales motivos de estrés de la criopreservación: -las alteraciones de la temperatura y - la formación y disolución de los cristales de hielo (Watson, 1995). Además de la cristalización, también están implicadas alteraciones osmóticas, que conducen a daños celulares evidentes (Hofmo y Berg, 1989). En consecuencia, la motilidad y la integridad acrosómica disminuyen de modo significativo, tras la congelación y la descongelación. 4. INTENTOS DE CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EN CSA Los intentos de criopreservar semen en camélidos sudamericanos han sido hasta la fecha insatisfactorios, debido a las características propias del semen de

7 camélidos, la técnica de colección (Ferré y Werkmeister, 1996), falta de conocimiento sobre su composición, viscosidad y uso de dilutores (Bustinza, 2001). Entre los mas estudios mas importantes realizados en criopreservación de semen de camelidos sudamericanos esta el trabajo de Bravo et al., (1996) usando semen de alpaca obtuvo un porcentaje de motilidad post descongelamiento de 46.7% y en llama de 45%, siendo estos los mayores obtenidos hasta la fecha, sin embargo no ha sido posible reproducir la metodología. Estudios posteriores reportaron tasas inferiores de motilidad post descongelamiento tales como las mencionadas por Vaughan et al. (2003) que obtuvo porcentajes de 17.4%; Pérez, (2005), usando diferentes concentraciones de crioprotectores, reportó motilidades de 22.5 a 41%; Santiani et al., (2005), reportó la obtención de motilidades que iban desde 4 a 20%, Burgel et al., (2001), obtuvo una motilidad post descongelamiento menor a 10% y Aller et al., (2003), obtuvo un 20% de motilidad postdescongelamiento. 5. CONCLUSIONES El semen congelado ofrece distintas posibilidades para el avance tecnológico en la explotación de los CSA y brindaría una mayor rapidez al progreso genético en estas especies. Debido a la poca información existente sobre colección y manejo del semen en CSA, es necesario centrar esfuerzos en la realización de estudios al respecto, e iniciar una investigación sistemática de los efectos de la congelación y los diversos procesos de descongelación que experimentan los espermatozoides de los CSA para el desarrollo de procedimientos eficaces para la preservación de semen. 6. LITERATURA CITADA 1. Aller J, Rebuffi G, Cancino K, Alberio R Influencia de la criopreservación sobre la motilidad, Viabilidad y fertilidad de espermatozoides de llama (Lama glama) Arch Zootec 52: Amann R, Pickett B Principles of cryopreservation and a review of

8 cryopreservation of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science 7: Bravo PW, Ordoñez C, Alarcón V Processing and freezing of semen of alpacas and llamas. In Proceedings of the 13th International Congress on Animal Reproduction, Sydney, Australia. Pp. P2 3 [Abstract]. International Congress on Animal Reproduction: Sydney. 4. Burgel H, Erhardt G, Gauly M Cryopreservation of llama (Lama glama) spermatozoa with an egg yolk free extender, in Gerken M., Renieri C. (eds), Progress in South American Camelids Research Wageningen Pers, Wageningen Netherlands. 5. Hofmo P, Berg K Electron microscopical studies of membrane injuries in blue fox spermatozoa subjected to the process of freezing and thawing. Cryobiology 26: Holt W Basic aspects of frozen storage of semen. Anim Reprod Sci 62: Mazur P Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol 247: Parks J, Graham J Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology 38: Pérez Durand M, García W, Capcha A, Pacheco J Evaluación de la capacidad fecundante de los espermatozoides (conducto deferente) conservado en alpacas. Proceedings of the IV Congreso Mundial sobre Camélidos, Santa María, Argentina. 10. Polge C, Smith A, Parks A Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 164: Santiani A, Huanca W, Sapana R, Huanca T, Sepúlveda N, Sanchez R Effects on the quality of frozenthawed alpaca (Lama pacos) semen using two different cryoprotectants and extenders. Asian J. Androl. vol. 7, pp Watson P The preservation of semen in mammals. In: Oxford Reviews of Reproductive Biology, Finn, C.A. (ed), Oxford University Press, Oxford, pp Vaughan J, Galloway D, Hopkins D Artificial insemination in alpacas (Lama pacos). Rural Industries Research and Development Corporation, Kingston, ACT, Australia.

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