Revisores: Dr. Jaime Molina Ochoa Dr. Marco Tulio Buen Rostro Nava Tecomán, Col. a 13 de noviembre del INTRODUCCIÓN

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1 UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS SEMINARIO DE INVESTIGACIÓN I EFECTIVIDAD DE LA LIBERACIÓN DE Rhynchophorus palmarum (Coleoptera: Curculionidae) INOCULADOS CON Metarhizium anisopliae Y Cordyceps bassiana (Ascomycetes) SOBRE SU DENSIDAD Y DAÑO EN Cocos nucifera EN CAMPO Estudiante: Jorge García Ramos Asesores: Dr. Roberto Lezama Gutiérrez Dr. Oscar Rebolledo Domínguez Dr. Francisco Radillo Juárez Revisores: Dr. Jaime Molina Ochoa Dr. Marco Tulio Buen Rostro Nava Tecomán, Col. a 13 de noviembre del INTRODUCCIÓN La palma de coco (Cocos nucifera L.) (Arecaceae) es un cultivo representativo de las zonas costeras tropicales; en el mundo se producen anualmente 5 millones de toneladas de copra, concentrándose más del 80% en cinco países, que en orden de importancia son Filipinas, Indonesia, India, Vietnam y México (Ramos, 2005). Este último con una superficie de 153, 000 ha que representan el 1.4 % de la superficie mundial plantada (FAO, 1999). A nivel nacional, Guerrero es el principal estado productor de coco, seguido de los estados de Colima y Tabasco, de las cuales dependen directamente 70, 000 familias (Domínguez et al., 1999). El cultivo del cocotero en el estado de Colima ocupa el segundo lugar nacional, con una superficie sembrada 21,044.8 ha y cosechada de 19,921.0 ha, con una producción de 8,405.0 ton (1.416 ton/ha de copra) Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA, 2006). Zizumbo et al. (1993), mencionan que el 98 % de las plantaciones son de palmas altas o criollas y solo el 2 % de palmas enanas. El mayate prieto del cocotero, Rhynchophorus palmarum L. (Coleoptera: Curculionidae) es una plaga en México y todo el mundo, que atacan a las palmeras, que tienen de 3 a 10 años de edad (Chinchilla, 1988). El daño directo es causado

2 por las larvas que se alimentan de los tejidos del tronco y en la región del cogollo; provocando la muerte de la palmera, sin embargo la mayor importancia del insecto radica en que es el principal vector del nematodo que causa la enfermedad del anillo rojo [Bursaphelenchus cocophilus Cobb (Tylenchida)] (Griffith, 1987). Lezama- Gutiérrez et al., (2006) reportan que los daños provocados en el estado de colima por R. palmarum y B. cocophilus son de 45% al inicio de la floración del cultivo. Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Tabasco. CEVESTAB (2012) menciona que existen reportes donde se establecen que el uso de insecticidas químicos para el control de R. palmarum ocasionan la muerte de otros organismos atraídos por los cebos alimenticios, además de que contaminan el medio ambiente cuando se desechan junto con el cebo en cada renovación, o cuando se producen lluvias que disuelven los tóxicos que se vierten hacia el exterior de las trampas, así mismo su inadecuada utilización genera resistencia por parte del insecto y esto implica una desventaja económica; por los costos elevados de adquisición de los productos químicos. Una de las razones más importantes para restaurar y/o mantener la biodiversidad en la agricultura, es la aplicación del control biológico por medio de la aplicación de organismos, utilizando las siguientes alternativas: introducción, colonización, liberación inocularía, liberación inundativa y manejo del agroecosistema (Lecuona, 1996). Hasta el momento se han descrito más de 750 especies de hongos entomopatógenos dentro de los más utilizados a nivel mundial como bioinsecticida se encuentran Metarhizum anisopliae (Metsch.) Sor. (33.9%), Cordyceps (=Beauveria) bassiana (Bals.) Vuill. (33.9%), Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown y Smith (5.8%) y B. brongniartii (Saccardo) Petch (4.1%) (De Faria y Wraight, 2007). Los hongos entomopatógenos M. anisopliae y C. bassiana se encuentra en la naturaleza, en rastrojos de cultivos, estiércol, en el suelo y plantas etc., logran un buen desarrollo en lugares frescos, húmedos y con poco sol; este grupo de hongos son los que tienen la mayor importancia en el control biológico de insectos plaga, principalmente en los chupadores o succionadores; por su parte M. anisopliae ataca naturalmente a más de 300 especies de insectos de diversos órdenes, los cuales son 2

3 cubiertos por micelio, que inicialmente es de color blanco, pero que se torna verde una vez que el hongo esporula (Sandino, 2003). Osorio y Lezama (1991) reportan que el mayate prieto del cocotero es susceptible al hongo entomopatógeno, M. anisopliae. En campo este hongo ha sido evaluado mediante aspersión de sus conidios donde se ha observado una disminución significativa en la densidad de poblaciones de mayates con respecto al testigo (Lezama-Gutiérrez et al., 2006). Ferreira y Lima, (1996) mencionan que la técnica de inoculación de machos, bañados con el hongo C. bassiana a una concentración de 1x10 9 conídios/ml bajo condiciones de laboratorio tiene una tasa de infección del 84.59%. PREGUNTA CIENTÍFICA Cuál será el efecto de la liberación de adultos de R. palmarum inoculados con M. anisopliae y C. bassiana, sobre su densidad y daño, en C. nucifera en campo? HIPÓTESIS La liberación de adultos de R. palmarum inoculados con M. anisopliae es más efectivo que C. bassiana para el control de la densidad y daño, en C. nucifera en campo. OBJETIVO Evaluar la efectividad de la liberación de adultos de R. palmarum inoculados con M. anisopliae y C. bassiana sobre su densidad y daño, en C. nucifera en campo. REVISIÓN DE LITERATURA Las plagas más comunes que atacan a este cultivo son: el picudo del cocotero o mayate prieto R. palmarum (Chinchilla et al., 1990), el acaro rojo Raoiella indica Hirst (Acari: Tenuipalpidae) (Carrillo et al., 2011). La chicharrita Myndus crudus Van Duzee (Homoptera: Cixiidae) (Howar y Gallo, 2006) y el escarabajo rinoceronte de las palmeras, Strategus aloeus L. (Coleoptera: Scarabaeidae) (Chinchilla, 1997). El ciclo de vida de R. palmarum consta de cuatro estados biológicos, huevo, larva, pupa y adulto; el huevo dura 3 días de incubación; las larvas entre 40 y 70 días y pueden 3

4 presentar de 8 a 9 mudas; la pupa tiene una duración de 16 a 30 días y los adultos tienen una duración comprendida 11 a 57 días y el ciclo completo tiene una duración 73 a 101 días (Morón y Terrón, 1988; Coto y Saunders, 2004). Las técnicas más utilizadas para el control del mayate prieto en cocotero son la eliminación de las palmas atacadas; esto con el fin de reducir los sitios de reproducción del insecto (Chinchilla y Oehlschlager, 1992). Moura y Delabie (1993) mencionan que R. palmarum tiene como enemigo natural al parásito Paratheresia menezesi (Diptera: Tachinidae) (Moura y Delabie., 1993; Ferreira et al., 2002). También se emplean trampas que contienen feromonas sintéticas y residuos de tejidos vegetales de palma, piña, bananas y caña de azúcar ayudan a atraer a los insectos adultos (Rochat et al., 1991). También se reporta el aislamiento del hongo C. bassiana de adultos de R. palmarum (Moura y Delabie., 1993; Ferreira et al., 2002; Mora-Ceballos, 2007). Este hongo ataca alrededor de 700 especies de insectos de diferentes órdenes (Monzón, 2001); se caracteriza por presentarse formando colonias con micelio blanco de aspecto algodonoso y una superficie semielevada; el conidióforo se forma desde una base hinchada adelgazándose hacia la porción que sostiene la célula conidiófora, las conidias se forman en cada punto de flexión, son hialinas, ovoides, globosas, unicelulares y pequeñas (Gómez, 1999; Bustillos, 2001). Charnley y Collins (2007) mencionan que los hongos entomopatógenos tienen mecanismos de invasión que les permiten atravesar de forma directa el exoesqueleto o pared del aparato digestivo de los insectos. El desarrollo de la enfermedad en el insecto está dividido en tres fases: (1) adhesión y germinación de la espora en la cutícula del insecto, (2) penetración e invasión a través del hemocele y (3) desarrollo del hongo dentro del insecto, al producirse este fenómeno generalmente provoca la muerte del insecto (Vilcinskas y Götz, 1999). Osorio y Lezama (1991) reportan que la cepa del hongo M. anisopliae Ma 4 a la concentración de 1x10 9 conidios/ml causa una mortalidad del 90% y un tiempo letal 50% (TL50) de 36 días en adultos de R. palmarum. En campo, Hernández-Martínez et al., (2001) evaluaron la efectividad de este hongo en el control de la densidad de 4

5 adultos de R. palmarum, mediante espolvoreo del hongo sobre palmas híbridas, a razón de 25 g de una mezcla de esporas en arcilla por planta (a la concentración de 8.8x10 9 esporas por gramo) y no encontraron diferencias significativas con el tratamiento testigo (aplicación de insecticida) por lo que continuaron evaluando el efecto de este hongo en campo. Mora (2007) evaluó este hongo en condiciones de campo, mediante la aspersión mensual del hongo en palmas en condiciones de campo a la concentración 1x10 8 conidios/ml y reporta que el porcentaje de palmas atacadas por la plaga en el testigo (sin aplicación de hongo, ni insecticida) fue de 36.2%; en la parcela donde se aplicó el hongo M. anisopliae el porcentaje fue de 37.7%; en el tratamiento químico (permetrina) un 26.4% y con la mezcla hongo+permetrina un 23.3%. En estudios realizados se ha encontrado que el hongo M. anisopliae es también utilizado para el control de otras plagas del cocotero como el escarabajo rinoceronte Asiático, Oryctes rhinoceros L. (Coleoptera: Scarabaidae) (Gopal et al., 2005), el escarabajo rinoceronte, Scapanes australis Biosd. (Coleoptera: Scarabaidae) (Prior et al., 1985) y el picudo negro de las palmas, Rhynchophorus bilineatus Montrouzier (Coleoptera: Curculionidae) en otros países (Prior et al., 1985). Del mismo modo, se tiene información de que el hongo entomopatógeno, C. bassiana es un agente patógeno del picudo del cocotero, Pantorhytes plutus Oberthür (Coleoptera: Curculionidae) (Prior et al., 1988). MATERIALES Y MÉTODOS Lugar. El trabajo se realizará en dos etapas, una en el Laboratorio de Control Biológico no 1. de Patología de Insectos y Ácaros, de la DES: Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Colima, ubicado en el Km 40 de la carretera Colima-Manzanillo en Tecomán, Colima, México, entre las coordenadas LN y LO (Google earth, 2013). En donde se multiplicarán los hongos, y otra en campo, en donde se evaluará su efectividad en el control de la densidad de población de R. palmarum. Se utilizará 1 parcela establecida con cocotero híbrido Colima 2, con una superficie de 5 ha, ubicada en el municipio de Armería, Colima. 5

6 Los hongos entomopatógenos. Se emplearán los hongos entomopatógenos M. anisopliae cepa Ma 4 y C. bassiana cepa Bb 174, que forman parte de la colección de hongos entomopatógenos de la DES: Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Colima; M. anisopliae fue originalmente aislado de una larva del gusano barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis Fabr.), en el área de abasto del Ingenio Quesería. El aislado de C. bassiana fue aislado de un adulto de broca del cafeto, Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae) en Manzanillo, Colima. Multiplicación del hongo. Los hongos se multiplicarán en Sabouraud dextrosa agar (Becton, Dickinson and Company, Bioxon, México) con 1% de extracto de levadura (Becton, Dickinson and Company, Bioxon, U.S.A.) (Sun y Liu, 2006). y 500 ppm de cloranfenicol (Merck, México); se incubarán por 21 días a 25 ºC y 12 h luzoscuridad (Ibarra-Aparicio et al., 2005). Posteriormente se recolectaran los conidios en una solución de agua destilada estéril con Tween 80 (Hycel, México) al 0.1% (v/v) para romper la tención superficial y se agitará durante 3 minutos mediante un Vortex (Genie 2, Daigger, Bohemia, N.Y., U.S.A.). Lo anterior, para obtener inóculo suficiente para la posterior producción masiva del hongo. Producción masiva. La producción se llevará a cabo en grano entero de arroz, en bolsas de plástico, de alta densidad, siguiendo la técnica de Prior et al., (1988). El grano de arroz se lavará con agua corriente, para eliminar basura y polvo. Una vez lavado el arroz se remojará en agua con 500 ppm del antibiótico cloranfenicol, durante 30 min. Pasado ese tiempo se colocarán 200 g de arroz en bolsas de plástico y se esterilizará en una autoclave (Market Forge Indutries, New York) 120 ºC, durante 45 min y 18 libras de presión/cm 2. Las bolsas con el arroz esterilizado se inocularán con 10 ml de una suspensión de conidios de 21 días de edad a la concentración de 1x10 9 conidios/ml y se incubarán a 25 ºC durante 21 días. Recuperación de esporas. Una vez pasado los 21 días de incubación del hongo, los conidios se recuperarán en 250 ml de agua con 0.1% de Tween 80 ; para separar el grano de arroz de los conidios se pasarán por un cedazo y por un tamiz de 200 mallas. La suspensión de conidios obtenida se centrifugará en una centrifuga 6

7 (Hanil Science Industrial, Korea) a 3,600 rpm, durante 15 min, con el fin de concentrar los conidios y separarlos del líquido. Una vez obtenidos los conidios, se secarán por ocho días en una cámara de flujo laminar (Labconco, Ks, U.S.A.) a 25 ºC, y se almacenarán a 5 ºC hasta su uso en campo. Determinación de la concentración de esporas. Para determinar la concentración de conidios/ml se tomará 0.1 g de conidios y se suspenderán en 100 ml de agua destilada estéril, con el auxilio de una cámara hematimétrica de Neubauer (Hausser Scientific, U.S.A) (Watson et al., 1995). Establecimiento del experimento. El experimento en campo se desarrollará en un huerto establecido de cocotero en el municipio de Armería, Colima. Se seleccionará una parcela de cinco hectáreas, establecidas con palma de coco de tres años de edad; esta se dividirá en cinco secciones de una ha cada una; en las secciones, uno, tres y cinco, se aplicarán los tratamientos: En el tratamiento uno, se instalarán un sistema de trampeo con cuatro trampas tipo (Colegio Superior de Agricultura Tropical) CSAT, cebadas con banano maduro y feromona de agregación para capturar a los adultos, e inocular a los machos atrapados con una suspensión de conidios del hongo M. anisopliae cepa Ma 4 a la concentración de 1x10 9 conidios/ml y mismos que se liberarán 24 horas después, el tratamiento dos, consistirá en instalar cuatro trampas cebadas, de las que se capturarán los adultos para inocular a los machos que se atrapen, con una suspensión de conidios del hongo C. bassiana cepa Cb 174 a la concentración de 1x10 9 conidios/ml y se liberarán 24 horas después, el tratamiento tres consistirá en instalar cuatro trampas cebadas para obtener datos como testigo (Ferreira y Lima 1996). Además, en cada parcela de una ha, se establecerá un sistema de trampeo, utilizando cuatro trampas tipo CESAT/ha y mediante el trampeo y registro del número de adultos capturados en cada tratamiento, se evaluarán los efectos de cada tratamiento. Un tratamiento será aplicado en una hectárea y las cuatro trampas se colocarán dentro de ella. El sistema de trampeo o colecta de los mayates adultos se realizará cada ocho días, durante el periodo experimental, que será de seis meses. Las hembras que se atrapen en cada uno de los tratamientos serán puestas en 7

8 observación en laboratorio, a fin de determinar el grado de infección por el hongo utilizado en cada tratamiento (Ferreira y Lima 1996) Variables. En todos los tratamientos se registrará el número de hembras, machos y el total de adultos (hembras + machos) capturados, cada ocho días. Además del número de plantas totales y el número de plantas muertas por ataque de mayate prieto. Del mismo modo, se registrará la temperatura ambiente y humedad relativa, con la instalación de un DataLoggers (HOBO Pro v2), que registrará los datos cada dos horas, dentro del experimento, esto se llevará a cabo durante el periodo de estudio, comprendido en los meses de Noviembre Abril de Análisis estadístico. Los resultados serán analizados, mediante un análisis de varianza y prueba de medias por Tukey al 0.5 de probabilidad y previa transformación de los datos, mediante la x+1 esto con el fin de normalizar los resultados obtenidos. Se utilizara el paquete estadístico SAS versión 1997 (SAS, 1997) del mismo modo se determinara la efectividad de los hongos en comparación con el testigo con cada una de las variables, con la fórmula: E = A-B x 100 A E= Efectividad; A= dato del testigo; B= dato del tratado (Goettel e Inglis, 1997). LITERATURA CITADA Bustillos, A Hongos en insectos y posibilidades de uso en el control biológico de plagas en Colombia. En: Seminario sobre uso de entomopatógenos en Colombia. Sociedad Colombiana de Entomología. Bogotá. p Chinchilla, C. M The red ring-little leaf syndrome in oil palm and coconut. Boletín. Técnico. Opo-CB 2: Chinchilla, C. M., Menjivar, R. y Arias E Picudo de la palma y enfermedad del anillo rojo/hoja pequena en un plantación comercial en Honduras. Truuialba 40:: Chinchilla, C. M Fauna perjudicial en palma aceitera. In: Memorias del Curso Aspectos Generales del Cultivo de la palma Aceitera. ASD de Costa Rica. 49p. Chinchilla, C. M. y Öhlschlager, A. C Captures of Rhynchophorus palmarum in traps baited with the male-produced aggregation pheromone. ASD Oil Palm Papers 5:

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