SISTEMA REPRODUCTOR. Cambios en la fisiología ovárica-uterina por estímulos hormonales

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1 TRABAJO PRACTICO N 5 SISTEMA REPRODUCTOR Cambios en la fisiología ovárica-uterina por estímulos hormonales Coordinador: Lic. Lilian Ferré INTRODUCCION Las hormonas sexuales en los vertebrados (esteroides derivados del colesterol) incluyen los estrógenos (predominantes en las hembras), los andrógenos (predominantes en los machos) y la progesterona. La producción y secreción de estos esteroides, gonadales, esta bajo control de la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), liberadas por la adenohipófisis en respuesta a Gn-RH (hormona hipotalámica liberadora de gonadotrofinas). A su vez, la secreción de las gonadotrofinas hipofisarias está modulada por la retroalimentación de las hormonas gonadales. Los mecanismos neuroendocrinos desempeñan un papel importante en la regulación del ciclo sexual y reproductivo. Las interacciones entre las gonadotrofinas y los esteroides proporcionan la base de la ciclicidad o ritmicidad sexual que es muy acentuada en la hembra de los mamíferos. En el caso de la hembra de mamíferos, el ciclo reproductivo (estral) a nivel del ovario y del útero, consiste en 3 fases fundamentales: 1. fase folicular (ovario) o fase proliferativa (útero), 2. Ovulación (ovario), 3. fase lútea (ovario) o fase secretora (útero). La duración de estas fases del ciclo varía en los distintos grupos de mamíferos. Este ciclo estral está basado en las relaciones endocrinas y niveles de concentración de gonadotrofinas y hormonas ováricas. El ciclo estral en la rata-ratón de laboratorio se estudia mediante un frotis vaginal, que se caracteriza por cantidades relativas y específicas de distintos tipos celulares del epitelio vaginal. El ciclo en estos roedores se repite cada 4 o 5 días y consisten en los siguientes estados: diestro (fase luteolítica y de crecimiento folicular), proestro (fase de maduración folicular y preovulatoria), estro (ovulación) y metaestro (fase luteogénica). En el diestro de la rata, los niveles hormonales permanecen bajos durante la mayor parte del ciclo, mientras ocurre un gradual incremento de estrógenos, liberados por el folículo ovárico en desarrollo. En el proestro, se produce el pico de FSH y LH debido al aumento significativo de estrógenos. En el estro se desencadena la ovulación y los niveles de LH y estrógenos bajan a sus niveles mínimos basales. En el metaestro (fase lútea temprana) comienza a detectarse un aumento en los niveles de progesterona (producida por el cuerpo lúteo). La fisiología ovárica y uterina puede ser influída por factores hormonales externos, no dependientes del ciclo hormonal endógeno, tales como: disruptores endocrinos (ej.: contaminantes ambientales, tóxicos, drogas), hormonas exógenas (ej.: inducción de la superovulación por la administración de gonadotrofinas), intervenciones quirúrgicas de órganos reproductivos (ej: cirugía de ovario u ovariectomía), estimulación mecánica del cuello cervical, entre otros. Según sean los casos y los efectos, se puede alterar el ciclo estral, presentándose variaciones en las proporciones relativas de las células del frotis vaginal, lo cuál será indicador directo de alteraciones del ciclo ovárico y uterino. Un claro ejemplo de estos cambios fisiológicos hormonales en el ciclo reproductivo de mamíferos es la estimulación mecánica del cuello cérvico-uterino por manipulación del animal o por apareamiento de la hembra con un macho estéril, lo que provoca la inducción de cambios hormonales característicos del estado de pseudopreñez, similar al estado hormonal inicial de una verdadera gestación en la rata. Ambos estados se caracterizan por el mantenimiento del cuerpo lúteo que permite el mantenimiento de la secreción de progesterona durante los 12 días de pseudopreñez. En el caso de una verdadera gestación (cuando ocurre la fecundación y la implantación de los embriones) el cuerpo lúteo es mantenido por las gonadotrofinas de la placenta para la continua secreción de progesterona. En los dos casos, en el frotis vaginal se encontrará un estado de metaestro-diestro, característico de este estado fisiológico. La inducción de pseudopreñez en la rata es muy utilizada en el laboratorio para el estudio de diferentes procesos reproductivos (gestación temprana, control hormonal, cuerpo lúteo y luteólisis, implantación embrionaria). Como método experimental de inducción de pseudopreñez es comúnmente empleada la administración de hormonas, formas similares u otros compuestos relacionados, utilizando protocolos adecuados

2 de estimulación. La medroxiprogesterona (MP), análogo de la progesterona, anticonceptivo y terapia de algunos carcinomas, induce pseudopreñez actuando a nivel hipotalámico-hipofisario por supresión de la síntesis o liberación de LH. OBJETIVOS DEL TRABAJO PRACTICO. Conocer el ciclo estral de mamíferos.. Observar e interpretar los cambios en el ciclo estral y en el aparato ovárico-uterino inducidos por análogos de la progesterona.. Conocer métodos experimentales para el manejo hormonal de la hembra de ratón de laboratorio. MATERIALES A UTILIZAR Gonadotrofinas PMSG (pregnant mare s serum gonadotrophin) y hcg (human chorionic gonadotrophin), acetato de medroxiprogesterona (MP), instrumental de cirugía, portaobjetos con cubre, pipetas Pasteur de plástico, alcohol, algodón, papel metálico, batería de tinción, balanza. Ratones hembras adultas (60 días de edad). DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGIAS 1. TRATAMIENTO IN-VIVO. Grupo Tratado: para lograr observar el efecto de la progesterona sobre el ciclo estral y la morfología uterina, se utilizará la medroxiprogesterona (MP), que será inyectada en el día del estro. El estado de estro se inducirá con la administración de gonadotrofinas (PMSG y hcg). Se seguirá el siguiente protocolo: - Ratones hembra adultas (2-3 meses) se inyectarán con 10 UI/hembra de PMSG y 48 hs. después con 10 UI/hembra de hcg. - Entre 16 y18 hs. postinyección de hcg (al día siguiente por la mañana) se inyectarán 20 mg/kg de animal de MP (día 1 de MP).. Grupo Control: un grupo de ratones hembra será inyectado con el vehículo de las hormonas utilizadas a los mismos tiempos que el grupo tratado. 2. ESTUDIOS Y PROCEDIMIENTOS DEL TRABAJO PRACTICO Se sacrificarán los animales por dislocación cervical al día 7 de la inyección de MP. A. CICLO ESTRAL Se determinará el ciclo estral del ratón utilizando la técnica de citología vaginal exfoliativa con posterior coloración por la Técnica de Papanicolaou (modificada por Iodice y col., 1988). El procedimiento a seguir será: Sujeción del ratón Toma de la muestra mediante lavado vaginal Extendido del material obtenido sobre portaobjeto limpio y desengrasado Fijación durante 1 minuto en Metanol. Coloración de las muestras mediante la técnica descripta a continuación. Técnica de tinción para frotis vaginal: 1. Pasaje por alcohol 70% 2. Lavado con agua destilada. 3. Coloración con hematoxilina (de Mayer, Carazzi) durante 2 minutos. 4. Lavado con agua corriente. 5. Pasaje por agua destilada. 6. Pasaje por alcohol 96%.

3 7. Coloración con Orange G. 8. Pasaje por alcohol 96% 9. Coloración con Eosina (EA 36- EA 50). 10. Pasaje por alcohol 96%. 11. Pasaje por alcohol 100% 12. Pasaje por xilol 13. Colocar medio de montaje en el cubreobjetos y sellar el porta.. Lectura, interpretación y cuantificación de las observaciones. Observar los extendidos bajo microscopio con aumento 40X. a. Análisis cualitativo: identificar y esquematizar los siguientes tipos celulares según sus características morfológicas y tintoriales: Células parabasales Células intermedias Células superficiales Células superficiales queratinizadas Leucocitos (neutrófilos, linfocitos, etc) b. Caracterización del estado o fase del ciclo estral Para establecer en qué fase del ciclo está la hembra de ratón, se estimará la fase del ciclo estral del animal Control y Tratado tomando en cuenta las proporciones relativas aproximadas de los tipos celulares hallados. Para ello, se contarán los diferentes tipos celulares y se establecerán sus proporciones relativas, contando unas 30 células en el frotis vaginal. En el mismo, también es común encontrar leucocitos. En las tablas se indicará su presencia o ausencia, anotando la cantidad relativa como muchos o pocos (no contarlos). 1. Tabla del grupo Expresar el recuento del número de cada tipo de células como % sobre un total de células contadas (30) y determinar, en base a esos porcentajes, la fase del ciclo estral. Grupo Parabasales Intermedias Superficiales Queratinizadas Leucocitos Fase del ciclo (*) Control Tratado (*) Pueden ser estados intermedio, como metaestro-diestro. 2. Tabla general de datos de las fases del ciclo, para animales controles y tratados. Una vez determinada la fase del ciclo de cada animal, se anotará el número total (de los tres turnos) de ratones (controles y tratados) que se encuentra en cada fase, en la siguiente tabla. Expresar los resultados como % de ratones que se encuentran en cada fase del ciclo. Grupo Proestro Estro Metaestro Diestro Otros (*) (*) Pueden ser estados intermedio, como metaestro-diestro.

4 B. EFECTO HORMONAL SOBRE EL UTERO Colocar el animal en decúbito dorsal. Realizar diéresis de la piel por la línea media ventral con tijera. Realizar diéresis de la pared muscular subyacente por la línea alba (media) con tijera. Reconocer el tracto reproductivo dentro de la cavidad abdominal e identificar los distintos órganos que lo componen (ovario, oviducto, útero, cervix). Disectar todo el tracto genital en cápsula de Petri (con solución fisiológica SF) y separar el útero en su totalidad, extrayendo oviductos, ovarios, cervix y tejido graso. Colocar los cuernos uterinos sobre papel metálico y pesar (expresar en mg). Colocar los cuernos uterinos en la cápsula de Petri (con SF) para observarlos macroscópicamente y bajo lupa. Análisis cualitativo: describir el aspecto: coloración, volumen o cualquier característica externa observada. Análisis cuantitativo: Completar la siguiente Tabla Grupal: Grupo Peso útero (mg) Peso corporal (g) IUS (*) Fase del ciclo (*): Calcular el índice útero-somático (IUS) como mg peso útero / mg peso corporal. Se recogerán los datos de todos lo animales controles y tratados (de los tres turnos) y se agruparán en una tabla general, clasificándolos por fase del ciclo. C. EFECTO SOBRE EL OVARIO Colocar los 2 ovarios en una cápsula de Petri con medio, observar y distinguir bajo lupa: - folículos - cuerpos lúteos Observar la cantidad relativa de cuerpos lúteos (CL) en los ratones controles y tratados, expresando ésta cantidad como: muchos CL: 3 o más, pocos CL: 1, ningún CL: 0 Completar la siguiente tabla, en valores numéricos relativos: Grupo Estado del ciclo Muchos CL Pocos CL Ninguno Se reunirán estos datos individuales en una tabla general para los tres turnos, en la que se agruparán los datos de la abundancia de CL por estado del ciclo. De esta manera se analizará qué abundancia relativa de CL existe asociada a cada estado del ciclo.

5 INFORME Hipótesis y Objetivo/s: mencionar brevemente Metodologías y Procedimientos: Explicación breve de los procedimientos realizados. Resultados:. Análisis del ciclo estral: realizar esquemas de los distintos tipos celulares observados. Expresar los resultados en forma de gráficos de barras.. Análisis uterino: Describir las características de los úteros observados en cada grupo.. Analizar los datos agrupados en la tabla general (todos los animales, según el estado del ciclo, entre controles y tratados) en cuanto al promedio del IUS.. Análisis del ovario: de la misma manera que antes, agrupar los datos de la cantidad relativa de CL según el estado del ciclo, para animales controles y tratados, y analizar realizando un promedio de los valores relativos. Se puede expresar el resultado final como gráfico de barras. Discusión y Conclusiones: Interpretar los resultados y discutirlos en forma interrelacionada, analizando el estado del ciclo con lo observado en el útero y ovarios:. Según el estado del ciclo, relacionar con el estado hormonal o endocrino que tendría cada grupo de animales.. Relacionar y explicar los cambios morfológicos uterinos (aspecto y/o peso, tamaño) con el estado del ciclo del animal. Podría decir algo del peso corporal entre los dos grupos?. Enunciar brevemente las conclusiones obtenidas.