APLICADAS A LA ECOLOGÍA MICROBIANA

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1 TÉCNICAS MOLECULARES APLICADAS A LA ECOLOGÍA MICROBIANA

2 Áreas de estudio tradicionales en la Ecología Microbiana: - Estudio de la diversidad microbiana, incluye aislamiento, identificación y cuantificación SÓLO EL 1% DE LOS MICROORGANISMOS PUEDE AISLARSE CON LOS ACTUALES MEDIOS DE CULTIVO - Estudio de la actividad microbiana: que es lo que los microorganismos hacen en su hábitat y como sus actividades contribuyen al mantenimiento de la diversidad biológica y a los ciclos biogeoquímicos, su papel funcional.

3 HERRAMIENTAS MOLECULARES EN ECOLOGÍA MICROBIANA Muestra ambiental METAGENÓMICA Generación de librerías genómicas con fragmentos de DNA de todos los microorganismos de la muestra Amplificación del fragmento de DNA requerido Extracción DNA PCR Hibridación DNA/RNAm FISH MicroArrays CLONAJE Separación de las distintas secuencias SECUENCIACIÓN Comparación de secuencias e identificación. Filogenia DGGE Separación en gel de las distintas secuencias. Patrón de bandas comparable con otros os sistemas ste o temporalmente Corte de bandas PCR ARISA Permite ver si hay alguien que nosotros buscamos CUANTOS hay DONDE están Permite ver que genes se están EXPRESANDO

4 PCR (Polymerase chain reaction)

5

6

7 Mezcla de secuencias Mezcla de secuencias diferentes del mismo gen, por ejemplo del 16S rdna

8 CLONAJE Colonias azules: contienen el vector sin el inserto, son resistentes a la ampicilina e hidrolizan el x-gal Colonias blancas: contienen el vector con el inserto, son resistentes a la ampicilina pero no hidrolizan el x-gal

9 SECUENCIACIÓN

10

11

12

13 EL ÁRBOL DE LA VIDA ARNr 16S/18S Champignons Animaux Eukarya a Plantes Archaea Halobactériaceae Bacteria Cianobactéries

14 Nuevos linajes eucariotas en los oceanos Plankton <5 μm 250-3,000 m depth 18S rrna López-García et al. Nature (2001)

15 Euglena terricola 1 µm

16 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Diversidad microbiana de una muestra Cambios de la comunidad a lo largo del tiempo Comparación de la diversidad de diferentes comunidades

17 Massana et al. 2005

18 ARISA: automated rrna intergenic spacer analysis Diversidad microbiana de una muestra a nivel muy fino Técnica más rápida que la DGGE

19 Permite ver que es lo que hay Permite ver que es lo que hay Cuanto de eso hay Como se distribuye en el espacio Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH)

20 Salinibacter ruber haloarchaea

21 El misterio del metano CH 4 + 2H 2 O CO 2 + 4H 2 Anaerobic methane oxidizing consortium: Archaea in red, Sulfate Reducing Bacteria in green. Microscopic image shows a consortium after fluorescent in situ hybridization (CARD-FISH). The samples are taken from deep sea sediments off the coast of California, Monterey Bay. Source: Annelie Pernthaler/UFZ Anaerobic methane oxidizing consortium Source: Annelie Pernthaler/UFZ

22 MicroArray

23 Muestra ambiental Metagenómica DNA Clonaje directo fosmidos/cosmidos BACs Libreriai genómica SCREENING: SCREENING: Búsqueda de actividades de interés 16/18S (ej: rdna enzimas) CARACTERÍSTICAS DEL GENOMA Distribución de genes Densidad génica Intrones Contenido en GC EXPRESSED GENES Clusters / operones Secuencias Secuenciación repetitivas de los genes Biotecnología para mejorar la expresión GENES Marcadores filogenéticos Genes transferidos horizontalmente Genes relacionados con el metabolismo Diversidad

24 Un nouveau type de phototrophie Rhodopsin-based Phototrophy Béjà et al. Science (2001)

25 Aprovechamiento masivo : 'shot-gun sequencing' 1045 billon de pares de bases (Mbp) Al menos 1800 species diferentes 1.2 millones de genes desconocidos

26 Genes de rhodopsina en el mar de los Sargazos IBEA (Institut for Biological Energy Alternatives)

27 Métagenómica comparativa Tringe et al., Science 2005

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