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1 Nuevos marcadores para la detección temprana y predicción de sobrevida en blancos terapéuticos. A principios de los años ochentas el desarrollo de nuevas tecnologías para la identificación del ADN del VPH en células cervicales tuvo auge, por lo que se incorporó a la biología molecular como prueba auxiliar en el diagnóstico de IVPH, de la misma manera se despertó el interés por el desarrollo de vacunas preventivas de la enfermedad. Hace más de 50 años que el Dr. George Papanicolaou empleo la citología cervical como método diagnóstico de lesiones pre y cancerosas del cérvix, sin embargo por su baja sensibilidad (reportada por diferentes autores entre %, relacionada con defectos en la recolección de la muestra), se han desarrollado nuevos métodos para mejorar la eficiencia en el diagnóstico. A diferencia de las bacterias y los parásitos que son seres vivos formados por una sola célula que cuentan con su propio metabolismo, fisiología y mecanismos de reproducción en ambientes adecuados; los virus son microorganismos que no pueden reproducirse en forma autónoma, dependen de un huésped que les permita introducirse a sus células, convirtiéndose en parásitos intracelulares obligados. La partícula viral madura denominada virión consiste en un bloque de material genético rodeado de proteínas que lo protegen del medio ambiente, son partículas pequeñas sin envoltura, con simetría icosaédrica. Cada virión está formada por 72 capsómeros y cada uno contiene 5 moléculas de la proteína mayor de la cápside denominada L1. El genoma viral está formado por una molécula de ADN de doble cadena asociado a nucleosomas. Las diferencias genotípicas entre los tipos de papilomas vienen marcadas por los diferentes aminoácidos que constituyen la proteína L1 (proteína estructural del virus con efecto antigénico). Las características de esta proteína son las que hacen que el virus pueda ser tratado como de bajo o alto riesgo y su genotipo específico es el que se usa para poder clasificar a estos virus. El genoma del VPH 16 contiene 6 genes de expresión temprana (E1 E2 E3 E4 E5 E6) y dos de expresión tardía denominados L1 y L2.

2 Durante la infección en el epitelio de la mucosa los viriones deben alcanzar la células basales no diferenciadas, entran a ellas por endocitosis, una vez en el interior, el genoma viral es transportado al núcleo e inicia una replicación del ADN en un número de copias entre 50 a 100 genomas virales por célula; cuando las células basales se dividen y los genomas virales se reparten a partes iguales entran las células hijas (replicación vegetativa). Cuando las células basales entran en proceso de diferenciación que las convertirán en queratocitos, a medida que migran hacia las capas superiores del epitelio, se produce la expresión de genes tardíos L1 y L2, que son las proteínas estructurales que encapsulan los genomas virales amplificados. El ensamblaje de los viriones hijos tiene lugar en el núcleo, liberándose cuando se descaman las células muertas del epitelio del huésped de manera que el ciclo de vida viral continúa. Los oncogenes virales E6 y E7 modifican el ciclo celular consiguiendo mantener el queratinocito diferenciado en un estado propicio para la replicación del genoma viral y la expresión tardía de los genomas estructurales, utilizando la célula del huésped. La replicación tiene lugar en los queratinocitos diferenciados induciendo la síntesis del ADN celular siendo la función de la proteína viral E7. La proteína diana más importante de E7 es el producto del gen supresor tumoral denominado prb que es uno de los principales reguladores del ciclo celular. E7 se une a prb inactivándolo de manera que la célula entre en fase S del ciclo celular y se activa la replicación ADN que es necesaria para la amplificación del genoma viral. Los productos del gen E7 de los tipos de alto riesgo de VPH 16 y 18 se unen a prb con mayor afinidad que los de bajo riesgo. El gen E6 de los tipos 16 y 18 se caracterizan por su capacidad de mediar la destrucción de la proteína p53 que es el producto de otro gen supresor tumoral y su función se centra en reparar el ADN dañado y la activación de la apoptosis o muerte celular, para mantener la integridad del genoma humano y destruir las células dañadas potencialmente cancerígenas. Por lo que la acción conjunta de E7 inhibidor de prb y E6 bloqueador de p53, producen efecto sinérgico en la activación del ciclo celular del virus y en la proliferación de células infectadas. Las células infectadas adquieren por lo tanto ciertas ventajas idóneas para iniciar una lesión cancerosa.

3 Se ha estimado que existe una incidencia entre 2 a 20% de la población mundial portadora oculta del VPH o bien que en algún momento de la vida se puede estar infectado hasta en un 70%. Sin embargo es bien conocido que un gran porcentaje de estas infecciones nunca presentarán expresión clínica e incluso las de alto riesgo remiten en forma espontánea antes de los 2 años y solo entre un 10 a 20% de las infecciones de alto riesgo persisten y son las que darán lugar al desarrollo de cáncer a partir de la integración del virus a las células epiteliales del cérvix produciendo sobreexpresión de 2 oncoproteínas (E6 y E7). Las pruebas de HPV de ADN fueron aprobadas en marzo de 2003 por la FDA para ser efectuadas en mujeres mayores de 30 años. Las nuevas pruebas para la identificación de los distintos genotipos de VPH permiten una estatificación del riesgo de desarrollar cáncer cervical. Para ello existen varios métodos de detección de virus entre ellos esta: Los métodos de sonda directa como el Southernblot para el análisis genómico; otra prueba que emplea sonda directa es el ISH que evalúa la presencia de ácido nucleico blanco o la expresión génica en un contexto histológico, estos métodos son poco sensibles, requieren mucho tiempo y necesitan grandes cantidades de ADN muy purificado. El de amplificación de la señal como la captura híbrida 2, aumenta la sensibilidad mediante la formación de capas multiméricas de moléculas informantes sobre sondas de ADN. Se utilizan también sondas de ARN específicas que son dirigidas hacia secuencias individuales del ADN, se emplea un anticuerpo que es dirigido contra híbridos ADN-ARN (captura), y para la posterior detección, marcado con una molécula informante y visualizada por un sistema quimioluminiscente. Según su grado de asociación con el cáncer cervical, los genotipos de VPH pueden ser agrupados en la Captura de Híbridos 2, como tipos de bajo riesgo, riesgo intermedio y alto riesgo. Los de Amplificación blanco como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la multiplicación in vitro de regiones únicas de ARN, facilitando su detección, cuantificación de carga viral, determinación de secuencias de ADN y análisis de mutación. Lamentablemente esta prueba está sujeta a contaminación ambiental proporcionando resultados falsos positivos. Se ha demostrado por estudios de investigación que las técnicas de sonda directa ofrecen menor sensibilidad para detectar secuencias específicas de ADN, mientras que la mayor sensibilidad se logra con la amplificación blanco y de éstas, la más sensible es la PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR).

4 Es importante mencionar que las pruebas de sonda directa y las de amplificación de la señal tienen tendencia a presentar reacciones cruzadas. Aunque la Captura de Híbridos es útil para distinguir entre las familias de VPH de bajo y alto riesgo, no proporciona información específica acerca del genotipo de VPH presente en un espécimen. Tanto la PCR como CH2 no son específicas ya que detectan una infección por virus transitoria en un grupo poblacional con alta tasa de incidencia de infección al virus, en este sentido en la actualidad se continúa en la búsqueda de nuevas tecnologías para marcadores moleculares que identifiquen la célula en proceso de transformación cancerosa. La incorporación de test virológicos representa un progreso considerable para los programas de detección oportuna aplicada a mujeres mayores de 30 años. En la actualidad existen 3 generaciones de test serológicos. 1.- Basado en la detección de anticuerpos frente a péptidos de las proteínas VPH (E2, E4, L1, L2, E6 y E7) de los virus 16 y Detección de anticuerpos frente a las proteínas transformadoras E6 y E7 expresados in vitro por transcripción y transducción. 3.- Basados en las estructuras proteicas conformacionales de la cápsula L1 y L2 desprovistas de ADN. Entre estos se encuentra el ONCOTEC que combina la citología más el biomarcador de VPH dando como resultado el aumento en la sensibilidad diagnóstica ya que cuantifica la expresión de las proteínas oncogénicas (E6 y E7), proporcionando información cuantitativa de alto valor diagnóstico, siendo positiva cuando es mayor o igual al 2% con una sensibilidad referida en la literatura cercana al 100%, fue aprobada para ser usada en mujeres mayores de 30 años como método de rutina, en donde con un resultado negativo del marcador y la citología, el seguimiento es confiable con un intervalo a 3 años. Otro test es el basado en estructuras proteicas conformacionales de la cápsula viral L1 y L2 desprovistas de ADN. La sensibilidad es baja entre un 50 a 70% comparadas con la detección del ADN mediante PCR. Desde 2007 laboratorio ROCHE lanzó al mercado un biomarcador específico CINTEC (P16INK4a) que indica la presencia o ausencia de cáncer cervical refiriendo no tener reacciones cruzadas con trichomonas, tiene alta sensibilidad y especificidad.

5 Lo que sí es claro, es que estas pruebas de ninguna manera desplazan a las convencionales como la citología cervical, colposcopia e histopatología, hasta que la carrera contra la mercadotecnia y la ciencia nos aporten algo nuevo pero confiable. Este mismo procedimiento de síntesis es en el que se han inspirado algunas de las preparaciones de vacunas por lo que el 8 de junio de 2006 la FDA aprobó Gardasil, una vacuna profiláctica contra VPH comercializada por el laboratorio MSD que muestra protección contra infección inicial para los genotipos 16 y 18, además demostró eficacia al 100% frente infecciones persistentes y protege contra genotipos 6 y 11 causantes del 90% de verrugas genitales, el rango de edad de la vacunación es de 9 a 26 años, (en México de 9 a 45 años en mujeres)con aplicación de tres dosis 0-2-6, sin previa exposición al virus; sin embargo en los últimos años se ha confirmado que aumenta la inmunidad hasta en un 50% en mujeres con previa infección viral y disminuye las recidibas. De igual manera Glaxo comercializó Cervarix que protege contra los tipos 16 y 18, recidiendo que aumenta el grado de inmunidad y disminuye el riesgo de recurrencia de la infección. Es importante referir a nuestros pacientes que no protege contra todos los genotipos y debe continuarse con seguimientos rutinarios de citología y colposcopia.

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