DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO (VPH) EN UN GRUPO DE PACIENTES CON SOSPECHA CLÍNICA Yl0 ANATOMO-PATOLÓGICA DE INFECCIÓN POR VPH

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1 Vol. 4, N 2, Año 2000 DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO (VPH) EN UN GRUPO DE PACIENTES CON SOSPECHA CLÍNICA Yl0 ANATOMO-PATOLÓGICA DE INFECCIÓN POR VPH Maritza Alvarez (1), Anna Chiarello (2), Elio Espinal (3), Aldo Reigosa (4), Miguel Marrero (5). RESUMEN En el presente estudio se realizó la detección y tipificación del Virus Papiloma Humano (VPH) en un grupo de mujeres (n=48) con sospecha clínica, citológica y/o histopatológica de infección por VPH. Estas muestras llegaron al laboratorio provenientes de diferentes consultas de Ginecología del Estado Aragua y fueron tomadas en los meses de Enero-Mayo Para el estudio se utilizó el kit PVHfast que permite la detección y tipificación de una gran variedad de cepas virales clínicamente significativas mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR siglas en inglés) y análisis del fragmento amplificable por enzimas de restricción. Se detectó ADN de VPH en 38/48; 79,1 %. Se detectaron los siguientes genotipos: VPH genotipo 11 en 10/38; 26, 3 de los casos, VPH genotipo 33 en 9138; 23, 60, genotipo 6 en 6/38; 5, 7%, genotipo 45 en 5/38; 13,1 Yo, genotipo 16 en 31 38; 7,8% y el genotipo 31 en 2138; 5,2%; los genotipos 30, 53 y 57fueron identificados en una sola muestra cada uno. Se detectó infección mixta en una paciente pero sólo se pudo identificar el VPH genotipo 11. De acuerdo a los resultados obtenidos predominaron ligeramente los genotipos de «riesgo alto e intermedio» para cáncer 52,6% (20138), con respecto a los de «bajo riesgo» 44.7% (17138). Consideramos que estos resultados pueden ser muy útiles desde el punto de vista médico, ya que combinándolos con los hallazgos clínicos y los resultados histopatológicos obtenidos por la prueba citológica y la biopsia, constituyen un complemento importante en una estrategia terapéutica y de seguimiento clínico a cada paciente que permitirá reducir la mortalidad por cáncer de cuello. Palabras claves: VPH, genotipificación, PCR. ABSTRACT DETECTION AND TYPIFICATION OF THE HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) IN A GROUP OF PATIENTS WITH CLINICAL ANDIOR ANATOMOPATHOLOGICAL INDICATIONS OF HPV INFECTIÓN

2 The Human Papillomavirus (HPU) was detected in a group of women (n=48) with clinical, histological and/or cytological antecedente of papillomavirus infection by HPV. All the samples carne from different gynecological services of Aragua State, Venezuela, and were taken between January and May This study was done using PVHfast, a kit which allows detection and classification of the most clinical relevan strains of HPV by Polymerase Chain Reaction (PCR) and restriction endonuclease analysis. HPV was detected in 3814; 79,1%. The following genotypes were characterized: genotype 11 in 10138; 26,3Yo, genotype 33 in 9138; 23, 6%, genotype 6 in 6138; 15, 7%, genotype 45 in 5138; 13.1 %, genotype 16 in 3138; 7, 8% and genotype 31 was detected in 2138; 5,2% the HPVgenotype 30, 53 and 57 were identified in only one sample of each type. Mixed infection was detected in one patient but only HP V genotype 11 was identified (1), (2), (5); Laboratorio Genomik C.A. Maracay, (4) Laboratorio IPAP y (3) Laboratorio Citología Maternidad del Este Valencia, Venezuela. Dirección postal: (1) Maritza Alvarez, Laboratorio Genomik CA, Urb. Calicanto, Edif "Rincón de los Toro" Piso 4, Oficina 46, detrás de la Maestranza, Maracay, Estado Aragua. Tela (043) Cel: Tel fax: Correo:genomik@cantv.net Fecha Recibido: Enero Fecha de Aprobado: Marzo 2000 According to the results, high and medium risk HPV genotypes were detected for cancer, 52, 6% vs. (20/38) 44.7%, as compared with the low risk 44,7 (17/38). Detection and typing are very useful medical tools which, along with clinical and histopathological results from regular cytology and biopsy, constitute a valuable complement to a therapeutic strategy involving a clinical follow-up of each patient in order to reduce mortality from cervical cancer. Key words: HP V, genotypipng, PCR. INTRODUCCIÓN El más importante descubrimiento en los últimos 50 años en patología cervical es la fuerte asociación entre la infección del virus papiloma humano (VPH) y el cáncer cervical (1,2). Estudios recientes señalan que la adquisición de una infección por VPH precede y puede predecir la aparición de una lesión intraepitelial escamosa (LIE) o un carcinoma invasor, existiendo una correlación de causa-efecto entre esta infección y la enfermedad cervical (3). Existen mas de 80 genotipos de VPH conocidos y alrededor de 30 de ellos infectan el tracto genital, según la clasificación de Schneider (4) se consideran VPH de «alto riesgo» los genotipos 16, 18, 24 y 56, que están relacionados principalmente con lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado y carcinoma cervical invasor. De «riesgo intermedio» los genotipos 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59 y 60, que están asociados con lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado y menos frecuentemente a carcinoma cervical invasor. De «bajo riesgo» los genotipos 6, 11, 40, 42, 43, 44, y 57, se encuentran en los condilomas acuminados y lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado, no en el carcinoma cervical invasor.

3 El desarrollo de la citopatología que describe un amplio rango de lesiones en la clasificación de Papanicolau,utilizando raspados cervicales y vulvares y los estudios con biopsias son considerados estrategias importantes en la prevención del cáncer cervical. En citología, para describir las células anormales han sido utilizados varios términos como la Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) y las displasias;pero actualmente el Sistema de Bethesda (5), que reporta las condiciones precancerosas divididas en Lesiones Intraepiteliales Escamosas (LIE) de bajo grado y LIE de alto grado está siendo mas difundido en los laboratorios de citopatología. La mayoría de las LIE de bajo grado (VPH y NIC-1) pueden retornar a la normalidad, pero en un grupo de casos progresan a LIE de alto grado y a carcinoma invasor. Debido a la alta frecuencia de genotipos de VPH de alto riesgo que se han detectado en el cáncer cervical (6,7), se hace necesario realizar la tipificación del VPH con el objetivo de detectar las pacientes con esta infección, mantener una vigilancia de las mismas y conducir un tratamiento adecuado para detener la progresión de las lesiones hacia un carcinoma cervical invasor. Debido a la imposibilidad del VPH para multiplicarse en los sistemas celulares, el diagnóstico de esta infección fue un problema complejo durante muchos años; con el desarrollo de las técnicas de biología molecular se han creado métodos de detección para este importante patógeno. Una de las técnicas mas utilizadas es la reacción en cadena de la polimerasa (conocida por las siglas en inglés de PCR) que ha tenido una gran aceptación debido a su sensibilidad, especificidad y posibilidades de automatización (8,9,10). En el presente estudio se realiza la detección y tipificación de VPH utilizando el kit comercial PVHfast que utiliza la técnica de reacción en cadena de la polimerasa combinada con análisis por enzimas de restricción para la tipificación de VPH, en muestras recibidas en el laboratorio provenientes de pacientes que asistieron a consultas ginecológicas con sospecha clínica y/o citología o biopsia con cambios histopatológicos sugestivos de infección por VPH. Muestras clínicas MATERIALES Y MÉTODOS Se estudió un grupo de muestras que llegaron al laboratorio provenientes de mujeres que asistieron a consultas ginecológicas privadas y urbanas del estado Aragua, en los meses de enero a mayo de 1999, con sospecha clínica de infección por VPH y/o citología anormal o cambios histopatológicos en biopsia que indicaban infección por VPH. Se estudiaron muestras provenientes de 48 pacientes, de los cuales en 38 se obtuvieron células cervicales exfoliativas tomadas con hisopos de algodón estériles y colocadas en tubo de 1.5 ml estériles, en 2 pacientes se obtuvieron biopsias de la región sospechosa de infección, éstas fueron colocadas en una solución lisis que consiste en Tris base 10 mm, 5 mm EDTA y 1% de SDS mantenidas a 4 C y trasladadas al laboratorio siguiendo las instrucciones recomendadas. En resumen, para el hisopado se debe hacer un barrido de la superficie sospechosa sin provocar sangrado de la lesión, no tomar la muestra cuando se ha usado alguna solución para identificar las lesiones, ni cuando exista una lesión sangrante. Se recogieron datos generales como edad, síntomas clínicos y resultados de citología y biopsia.

4 Para evitar contaminaciones en las amplificaciones se utilizaron tres áreas separadas: una para la preparación del ADN, otra para la preparación de las mezclas y el área para electroforesis; cada una con todo el material separado; además, se utilizaron puntas con filtro antiaerosoles y se cambiaron los guantes frecuentemente. Detección de VPH mediante el PVHfast. El Kit de PVHfast (PharmaGen S.A.) utilizado para la detección y tipificación de VPH amplifica un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L 1 del marco abierto ORF. Esta región del ácido desoxiribonucleico (ADN) del virus es muy similar entre los distintos genotipos de VPH. A pesar de que esta secuencia es común, entre los VPH presenta pequeñas variaciones entre un genotipo y otro. Para localizar estas pequeñas variaciones de secuencia, y por lo tanto para genotipificar los diferentes virus, se digiere el ADN amplificado anteriormente con enzimas de restricción. De este modo, la enzima cortará el producto amplificado de cada genotipo de VPH en distintos puntos, originando varios fragmentos de ADN. A1 separar por su tamaño estos fragmentos en un gel de agarosa, cada genotipo de virus presentará un patrón de bandas característico. El kit presenta un control interno que es un plásmido modificado para descartar los falsos negativos presentes que inhiben las polimerasas y que amplifica a una talla diferente a la específica del VPH. Para la realización del ensayo se siguieron las instrucciones recomendadas por el kit, es decir, se le añadió al tubo con el hisopo de muestreo un ml de solución salina al 0,9%, agitándose durante 1 minuto, y centrifugado por 10 minutos a rpm. En cada serie de ensayos fue incluido un control negativo, conteniendo solamente 1 ml de solución salina al 0,9%, procesándose igual que las muestras de los pacientes. El sobrenadante se eliminó con pipeta cuidando de no arrastrar las células y el precipitado se resuspendió en 95 Vil de solución de digestión (10 mm Tris base, 5 mm EDTA y 0,5% de Tween 20) y 5 Vil de proteinasa K (1 mg/ml). Se incubó a 60 C durante 3 horas, transcurrido este tiempo se inactivó la proteinasa K durante 10 min. a 100 C, posteriormente se tomó una alícuota de 5 ptl para hacer la reacción de amplificación, el resto fue guardado a -20 C. En el caso de las biopsias el procedimiento fue similar, utilizando 50 ~L1 del tampón lisis en el que se encuentra resuspendida la biopsia y 50 V,1 de la solución de proteinasa K incubándose 24 horas a 55 C, continuando el resto del procedimiento de igual forma que el realizado para los hisopados. Reacción de amplificación. Un tubo de reacción fue descongelado para cada muestra, añadiéndosele 5 pl del ADN extraído, se colocaron en un termociclador (PTC150 M.J. Research) incluyendo el control negativo con los siguientes ciclos de temperatura: 4 min. a 94 C; 35 ciclos de 1 min. a 94 C, 1,5 min. a 52 C y 2 min. a 72 C y finalmente 10 min. a 72 C. Visualización del producto amplificado. En un gel de agarosa al 2% preparado en solución 0,045 M Tris-Borato; 0,001 M EDTA ph 8,0 (TBE 1X) más bromuro de etidio a 0,5 pg x ml, se utilizan 10 pl del producto

5 amplificado con 2 Vd de solución de carga, posteriormente se prepara cada mezcla colocándola en el gel y se incluye 0,5 p,g de marcador de peso molecular 100 pb DNA Ladder (Promega), corriéndose la electroforesis a 80 V por una hora, las bandas de ADN son visualizadas en un transiluminador de luz ultravioleta. En las muestras positivas aparece una banda de 450 pb correspondiente al genoma del VPH y una banda de 1200 pb del control interno, en las muestras negativas sólo aparece la banda del control interno. Genotipificación por digestión con enzimas de restricción A los tubos de reacción amplificados de las muestras positivas para VPH se les añadió 1 V1 de Enzima 1 de restricción resuspendiendo suavemente y 20 pil de cada uno fueron pasados a otro tubo estéril añadiendo 1 pl de Enzima 2 de restricción, se incubaron los tubos de Enzima 1 y Enzima 1 + Enzima 2 a 37 C durante 2 horas, posteriormente se añadió a cada tubo 3 p,l de solución de carga, colocándose esta mezcla en un gel de agarosa de alta resolución al 2,5% en TBE 1 X mas bromuro de etidio a 0,5 pg/ml. Se incluyó 0,5 Vg del marcador de peso molecular 100 pb DNA Ladder (Promega) para correr la electroforesis a 80 V durante 1 hora y se visualizaron las bandas de ADN en un transiluminador de luz ultravioleta. Interpretación de los resultados. La banda de amplificación de ADN de VPH de 450 pb se digerirá originando un patrón de bandas dependiendo del genotipo de virus y se analiza de acuerdo al patrón de restricción que aparece en las instrucciones del kit. RESULTADOS Todas las muestras estudiadas tuvieron ADN amplificables para el control interno del kit, por lo que fueron útiles para diagnosticar infección por VPH. Los médicos tratantes refirieron sospecha clínica de infección por VPH en el 75% de las pacientes, el 95,8% de las mismas refería citología con alteraciones celulares sugestivas de infección por VPH y el 64,6% refería en biopsias cambios histopatológicos que indicaban infección por VPH. Se detectó ADN de VPH en 38 de 48 pacientes para un 79,1 % de positividad. Todos estos casos fueron tipificados de acuerdo a los patrones de restricción enzimática del kit, obteniéndose los siguientes resultados: el VPH genotipo 11 fue el virus que se detectó con mayor frecuencia, presentándose en un 26,3% de los casos (10/38); el segundo en frecuencia fue el VPH genotipo 33, que se detectó en el 23,6% (9/38), seguido del VPH genotipo 6 en el 15,7% (6/38), el VPH genotipo 45 en 13,1 % de los casos (5/38), el VPH genotipo 16 se detectó en 7,8% (3/38) y el VPH genotipo 31 se detectó en 5,2% (2/38) de los casos (Figura 1), los VPH genotipo 30, 53 y 57 se identificaron en una sola muestra y en una paciente se detectó una infección doble, en la cual se pudo identificar un VPH genotipo 11 y el otro genotipo no se pudo determinar según el método empleado. En la figura 2 se muestran algunos de los patrones de restricción obtenidos. Productos de PCR después de la electroforesis en gel de agarosa al 2.5% teñido con bromuro de etidio. En la linea 1 se encuentra el marcador de peso molecular 100pb Ladder,

6 de la línea 2 a 5 se observan casos negativos con la banda del control interno del Kit, la línea 6 es un caso positivo con la banda de 450 pb del ADN de VPH y la banda de control interno, en la línea 7 una digestión con la enzima de restricción 1 y en la línea 8 en la enzima Según el patrón de restricción enzimático descrito en el Kit es un VPH genotipo 30. A1 clasificar los genotipos de VPH de acuerdo al riesgo, predominaron ligeramente los genotipos de «riesgo alto e intermedio» para cáncer, con un 52,6% (20/38), los VPH de

7 «bajo riesgo» con un 44,7% (17/38). En los datos obtenidos de las pacientes había dos clasificadas como NIC III, en una fue detectado VPH genotipo 16 y en otra VPH genotipo 31, otra paciente con NIC 11 tenía una infección por VPH genotipo 33 y en otra paciente diagnosticada como NI C I se detectó infección por VPH genotipo 16. En 3 casos que venían con diagnóstico de condilomas se identificaron VPH genotipo 11, en el resto de las pacientes, a pesar de que se recogió el dato de sospecha clínica y/o citología o biopsia alteradas, no se precisó la lesión ni el grado de alteración anatomo-patológica. En 10 muestras de pacientes con diagnóstico clínico y/o citología o biopsia con sospecha de infección por VPH no se encontró ADN de VPH, lo que representa el 20,9% de negatividad a pesar del diagnóstico realizado previamente. DISCUSIÓN La asociación entre Virus Papiloma Humano y cáncer cervical sugiere que la pesquisa de VPH representa una estrategia importante para identificar mujeres con alto riesgo de desarrollar una neoplasia cervical (11), además, el conocimiento de que la neoplasia cervical está relacionada a genotipos específicos de VPH denominados VPH de «alto riesgo», indican la importancia como valor pronóstico que tiene la tipificación del VPH (6,7,12). Los métodos moleculares han permitido la detección y tipificación del VPH, el mas tradicional es la hibridación por «dot blot» (13) y la hibridación por «Southern blot» (14), con la desventaja de que esta técnica requiere grandes cantidades de ADN (10~ig) y de alta calidad; otro procedimiento es la hibridación «in situ» que utiliza sondas marcadas específicas para detectar los diferentes genotipos de VPH, este método tiene como ventaja que da la localización celular del virus, pero no es muy sensible ya que para realizar un diagnóstico se necesita una alta concentración viral en las células (mas de 50 copias de virus por célula) (15). La PCR es un método muy sensible ya que amplifica fragmentos de ADN del virus a partir de pocas cantidades de ADN (menos de 1 ug), el ADN puede estar parcialmente degradado y puede ser utilizada para analizar un gran número de muestras en un tiempo corto (8,9,10). En el presente estudio, aplicando el principio de esta tecnología, utilizamos el kit de PVHfast. Se encontró ADN de VPH en el 80% de los casos, corroborando estos resultados los hallazgos de la citología y la biopsia al diagnosticar infección por VPH. En la mitad de los casos encontramos VPH de riesgo alto e intermedio, lo que nos indica que la circulación de estos virus es alta en nuestra población. En un estudio reciente conducido por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 22 países, en mujeres con carcinoma invasor confirmado (6), detectaron ADN de VPH en un 93% de los casos y en las 3/4 partes encontraron VPH genotipo 16, 18, 31 y 45, coincidiendo en tres genotipos con los mas frecuentes que predominaron en el grupo de pacientes estudiadas, es decir, los VPH genotipos 33, 45, 31 y 16. Es de hacer notar que en ninguna muestra detectamos VPH genotipo 18. De acuerdo a lo descrito en la literatura, en las cuatro pacientes que se obtuvo el dato que presentaron una NIC, los virus encontrados fueron de alto riesgo (6,7,16). En un estudio realizado en nuestro país por Azocar y cols. (17) en 1990, en mujeres que en la citología encontraron infección por VPH con cambios premalignos y malignos y utilizando

8 la técnica de hibridación para la detección de seis genotipos de VPH (6, 11, 16, 18, 31, 33 y 35), obtuvieron que en un 35% de las mujeres encontraron ADN de VPH y en los casos diagnosticados como NIC la positividad fue de 13%. En el presente estudio se obtuvo un alto porcentaje de detección de VPH (80%) comparando con el estudio de Azocar y cols (17) que obtuvieron un 35%, pensamos que puede deberse a que la PCR es un método mas sensible que la hibridación, necesita menor cantidad de ADN y puede estar parcialmente degradado y ser amplificado (8,9,13), además este kit utiliza cebadores que amplifican una región común y altamente conservada en los diferentes genotipos de VPH, por lo que permite detectar en una alta frecuencia cualquier genotipo de infección por VPH. La cuarta parte de los ADN de VPH fue VPH genotipo 11, incluyendo tres casos con condilomatosis diagnosticados clínicamente. La presencia de infecciones mixtas en un mismo paciente se ha descrito anteriormente en una paciente con carcinoma epidermoide, reportando VPH genotipo 613, 16, 18 y 33 (18). En otro estudio señalan que identificaron un 11 % de infecciones mixtas en mujeres sospechosas de infección por VPH, utilizando el método de ViraType (19). En este estudio encontramos un caso de infección mixta en el cual pudimos identificar el VPH genotipo 11 y otro VPH no determinado, de acuerdo a los patrones de restricción enzimática utilizados. El 20,9 % de los resultados fueron negativos al aplicar el PVHfast. No podemos afirmar que sean falsos negativos de la PCR, ya que existen otros factores que pueden estar influyendo; aunque el grupo de casos estudiados tenían criterios clínicos y anatomo-patológicos de infección por VPH, se señala que puede existir un sobre diagnóstico clínico (falsos positivos por la clínica) en un 20-40% de los casos. Así mismo, se han descrito remisiones espontaneas de infecciones subclínicas por VPH no tratadas en un 10-20% de los casos después de 3-4 meses de diagnosticadas (20). Además, es de destacar que aunque la prueba de Papanicolau ha sido el descubrimiento más importante en el diagnóstico y prevención del cáncer cervical (2,12), se ha señalado un margen del 20-50% de errores en la interpretación de los resultados (20,21), La aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa, en conjunto con los progresos realizados en la citología a partir de raspados cervicales y los resultados histopatológicos obtenidos por las biopsias, son un complemento importante para la detección y tipificación de VPH en mujeres con riesgo de desarrollar una neoplasia cervical. La posibilidad de tipificar el VPH nos permitirá en cada paciente realizar un seguimiento clínico y aplicar una estrategia terapéutica específica que permitirá reducir la mortalidad por cáncer de cuello uterino. AGRADECIMIENTO Agradecemos especialmente a los médicos que han enviado las muestras para ser diagnosticadas en nuestro laboratorio y que han constituido la base de este estudio. BIBLIOGRAFIA

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