UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DETECCIÓN DE VIRUS DE PAPILOMA HUMANO DE ALTO RIESGO MEDIANTE CAPTURA DE HÍBRIDOS EN MUJERES DE LA REPÚBLICA MEXICANA TRABAJO PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO P R E S E N T A : OSCAR GABRIEL SÁNCHEZ MANRÍQUEZ ASESORES: M en C ANA LAURA VÁZQUEZ MARTÍNEZ Dr. ALEJANDRO GARCÍA CARRANCÁ CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉX. 2009

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3 AGRADECIMIENTOS AL DR. ALEJANDRO GARCÍA CARRANCÁ DIRECTOR GENERAL DEL LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS MOLECULAR S.A. DE C.V. POR LA GRAN OPORTUNIDAD QUE ME BRINDO PARA REALIZAR ESTE TRABAJO, ASÍ COMO LA ASESORÍA, APOYO, POR LA MAGNIFICA PERSONA Y SOBRETODO ESTUPENDO SER HUMANO QUE ADMIRO Y APRECIO TANTO. A LA M EN C ANA LAURA VÁZQUEZ MARTÍNEZ POR SU ASESORÍA, PACIENCIA Y CONOCIMIENTOS QUE COMPARTIÓ CONMIGO. A LOS SINODALES DE ESTE TRABAJO, QUIENES CON SUS ACERTADOS COMENTARIOS Y SUGERENCIAS, ENRIQUECIERON EL CONTENIDO Y MEJORARON LA PRESENTACIÓN FINAL, PARA QUE ESTA FACETA EN MI FORMACIÓN ESTE FINALIZANDO. A FABIOLA LÓPEZ SÁNCHEZ POR SU INVALUABLE APOYO Y AMISTAD.

4 Dedicatorias A MI MADRE POR SU INFINITO APOYO, AMOR, COMPLICIDAD, CONSEJO Y POR INSPIRARME A SER LA PERSONA QUE AHORA SIGUE EN CONSTRUCCIÓN. A MI PADRE QUE PENSÓ QUE NO LLEGARÍA EL MOMENTO Y ME AYUDO DE DIFERENTES Y PECULIARES FORMAS. A MIS HERMANOS: RAMÓN, MONY, ANGELICA Y VICTOR POR SU APOYO EN LA CERCANÍA Y A DISTANCIA, SU AMOR, Y TODAS ESAS COSAS QUE LOS HACEN ESPECIALES EN MI VIDA. A FELI JOSÉ LUIS, JUANA Y LUIS SÁNCHEZ QUE ME INSPIRAN DE GRAN MANERA Y QUIERO TANTO. A TODOS AQUELLOS QUE DE UNA U OTRA FORMA ESTÁN EN MI CORAZÓN Y FORMAN PARTE DE MI VIDA. Y ESPECIALMENTE A TI QUE FUISTE, ERES Y SERÁS SIEMPRE PARTE IMPORTANTE DE MI VIDA, GRACIAS INFINITAS.

5 Índice Página I Introducción Historia del virus de papiloma humano 2 2 Virus de papiloma humano Las proteínas virales del papiloma humano.. 5 a) Las proteínas E1 y E b) Las proteínas E5, E6 y E7. 6 c) Las proteínas L1 y L2 9 d) La región larga de control Ciclo de vida del VPH La fase proliferativa Amplificación del genoma La síntesis del VPH La integración de ADN La regresión de las lesiones y latencia del virus Respuesta inmune contra el VPH a) Respuesta inmune innata Cofactores en la oncogénesis Manifestaciones clínicas Alteraciones celulares del epitelio Diagnostico. 23 a) La citología convencional (Papanicolaou).. 23 b Citología líquida lectura en monocapa celular c) Colposcopía d) Diagnostico molecular de VPH e) Captura de híbridos 2 (CH2).. 25 f) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Tratamiento.. 29 II Objetivos.. 31 III Justificación

6 IV Desarrollo a) Procedimiento de la técnica b) Desnaturalización de las muestras c) Hibridación d) Captura de Híbridos. 35 e) Detección de Híbridos f) Lavado. 36 g) Amplificación de la señal 36 h) Análisis de datos V Resultados 38 VI Discusión VII Conclusiones 45 VIII Anexo IX Citas bibliográficas... 54

7 Lista de Abreviaturas VPH Virus de Papiloma Humano ADN Acido desoxirribonucleico CH2 Captura de Híbridos2 PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa nm Nanómetros pb Pares de bases LCR Región Larga de Control IFN's Interferones ETS Enfermedades de Transmisión Sexual NIC-CIN Neoplasia Intraepitelial Cervical CIS Carcinoma in situ LSIL Lesión Intraepitelial Escamosa de Bajo grado HSIL Lesión Intraepitelial Escamosa de Alto grado ASC-US Atipia Escamosa Cervical de Indeterminada Significancia Pap Papanicolaou TDL Tratamientos Destructivos Locales µl Micro litros URL Unidades Relativas de Luz CV Coeficiente de Varianza IVPH Infección por Virus de Papiloma Humano LIAG Lesión Intraepitelial de Alto grado LPBG X VHP Lesión Probable de Bajo Grado por Virus de Papiloma Humano

8 Índice de Figuras No. Figura Titulo Página 1 Esquema del modelo tridimensional del virus del papiloma humano 4 2 Ejemplo de la organización del genoma viral Interacción de E6 y E7 en el ciclo celular. 8 4 Organización de ciclo de Vida en infección productiva por tipos de HPH 11 5 Oncogénesis por VPH y su interacción con las proteínas E6 y E Ciclo viral en el epitelio estratificado Células superficiales Coilocitos 15 8 Esquema que muestra la progresión de un epitelio normal hacia displasia y carcinoma in situ y las clasificaciones según Richart y el sistema Bethesda Estuche de diagnóstico de CH Ejemplo de procesador automático para captura de híbridos Muestras analizadas de Mayo 2005 a Mayo Porcentaje de muestras positivas de mayo 2005 a mayo de Frecuencia de edad en 600 pacientes que se realizaron la detección de ADN de VPH Porcentaje de muestras positivas por edad en 600 pacientes Porcentaje de muestras positivas en algunos estados de la República Coeficientes de Varianza de controles negativos en las pruebas de Mayo 2005 a Mayo Coeficientes de Varianza de controles positivos en las pruebas de Mayo 2005 a Mayo Tasa Nacional mortalidad 2005 Cáncer cervicouterino y por Entidad Federativa por cada 100,000 mujeres, Secretaria de Salud 53

9 Índice de Tablas No. de Titulo Página Tabla 1 Equivalencias entre las diversas nomenclaturas usadas en citología Comparación entre Captura de Híbridos 2 y PCR Resultado de las pruebas de Mayo 2005 a Mayo Coeficientes de Varianza controles negativos y positivos Coeficientes de Varianza controles negativos y positivos Coeficientes de Varianza controles negativos y positivos Frecuencia de edad en 600 pacientes que se realizaron detección de ADN de VPH 51 8 Porcentaje de muestras positivas por edad en 600 pacientes 52 9 Porcentaje de muestras positivas en algunos estados de la República Mexicana de Enero de 2006 Mayo de

10 I. Introducción Hablar de Virus de Papiloma Humano (VPH) es La historia que no termina 1 debido a su relación con el cáncer cervicouterino y con otros tumores del tracto anogenital femenino. Cientos de investigadores, médicos, citólogos, alrededor del mundo buscan la forma de combatir esta enfermedad desde diferentes campos, previniendo, diagnosticando y encontrando nuevas metodologías además de herramientas moleculares para la detección temprana y oportuna, así de esta manera poder salvar a más mujeres diariamente. Una fracción considerable de las infecciones por VPH es sub-clínica; el varón puede ser portador y vehículo de la infección. 4 Las infecciones por los VPH representan una de las enfermedades de transmisión sexual más común en la mayor parte de los países del mundo. 4 La infección cervical ocurre probablemente cuando el pene del varón infectado con virus entra en la capa basal del epitelio escamoso. Aunque el contacto genital durante cópula sexual sea probablemente la forma dominante de transmisión de VPH, existe evidencia de que la infección genital se puede adquirir por medio de fómites u otros medios no sexuales, los órganos más susceptibles de infección con potencial de iniciar una transformación neoplásica son el cuello uterino (zona de transformación) y la línea pectínea del canal rectal. El cáncer cervicouterino es un grave problema de salud pública, es la segunda causa de muerte a nivel mundial por neoplasias malignas en la mujer, con unas muertes al año. 1 En México para el periodo de 1990 a 2000 se reportaron oficialmente un total de 48,761 defunciones por cáncer cervicouterino iniciando en 1990 con 4280 muertes en el año y terminando con 4,082 en el 2006, lo que representa en promedio 12 mujeres fallecidas cada 24 horas, las mujeres que viven en el área rural tienen 3.07 veces mayor riesgo de mortalidad por este cáncer, en comparación con las mujeres residentes en el área urbana, está situación se encuentra íntimamente relacionada con factores como la falta de escolaridad, el desempleo, el bajo nivel socioeconómico y la falta de acceso efectivo a los servicios de salud. 2 Las infecciones por VPH se encuentran frecuentemente en capas del epitelio, en cuyos casos el ADN viral puede recuperarse del cuello, vulva, vagina y del canal anal. Estimaciones recientes sugieren que, en las edades de mayor actividad sexual, la 1

11 prevalencia de infecciones sub-clínicas por VPH pueden afectar hasta un 40% la población femenina con tasas de infección de 10-15% anual. En los grupos de mujeres mayores de 30 años, la prevalencia se reduce a un 5-10%. La duración media de las infecciones por VPH ha sido estimada en 8-10 meses, la resolución de la infección parece ofrecer un cierto grado de protección frente a reinfecciones por VPH. Nunca imagino George Nicolas Papanicolaou el alcance que tendría cuando introdujo la citología diagnóstica de frotis vaginal en 1940, ya que es una prueba de tamizaje de bajo costo y de aplicación masiva que ha permitido la detección del cáncer cervicouterino y las lesiones precursoras reduciendo significativamente la mortalidad. A finales de la década de los años 70 s, tendría algunas implicaciones técnicas, por lo cual, se ha tenido que modificar en lo que hoy se llama Citología en base liquida que permite resolver problemas como: 1) captura de la totalidad de la muestra, 2) fijación deficiente, 3) distribución aleatoria de células anómalas, 4) existencia de elementos perturbadores, 5) calidad del frotis. 5 aunque esta metodología solo nos sirve eficazmente siempre y cuando están presentes anormalidades en las células, esto presenta una limitante muy importante, gracias a los avances en biología molecular y de nuevas técnicas de tamizaje podemos contar con métodos mas simples para detectar la presencia del VPH como son: La Captura de Híbridos2 y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingles). Estas metodologías son muy sensibles y específicas detectando desde muy pequeñas cantidades de copias del virus, aunque los costos no son del todo accesibles a toda la población ya que recordemos que casi el 85% de las muertes por cáncer cervicouterino se presenta en países en vías de desarrollo. 1. Historia del virus de papiloma humano. El VPH tiene un papel muy importante en el cáncer cervicouterino, que ha sido bien establecido biológica y epidemiológicamente. 3 aunque se sabe que es necesario pero no suficiente para que se pueda formar una lesión. 6 esto que quiere decir que; el adquirir una infección por virus de papiloma humano no significa que tendremos cáncer y que va a morir el paciente, simplemente que hay factores determinantes conocidos de la progresión como son: el tipo viral, la persistencia de la infección en exámenes repetidos y 2

12 probablemente la carga viral por unidad celular, otro co-factor es el uso prolongado de anticonceptivos hormonales, inicio de relaciones sexuales a temprana edad, múltiples parejas sexuales, tabaquismo, estado hormonal, deficiencias en el sistema inmune y posiblemente la coinfección por Chlamydia trachomatis entre otros. Los casos en los que la detección de ADN viral es persistente constituyen el grupo de alto riesgo para la progresión neoplásica. 4 Con la ayuda de la microscopia electrónica la revolución en la documentación de los virus dio un vuelco en la investigación en la década de los 50. Las verrugas genitales son conocidas desde la más remota antigüedad, aunque se sospechaba desde finales del siglo XIX que eran producidas por virus, hasta 1969 se logró aislar partículas virales. La primera asociación entre VPH y el cáncer cervical corresponde a la década de los 70 y a partir de ese momento se inicia una serie de estudios donde se consigue la clonación del genoma de papiloma virus en bacterias. El concepto de que algunas verrugas pueden progresar a la malignidad fue establecido por estudios de Shope, Rous en 1933, donde estudiaron la transmisión de verrugas que aparecen de manera natural en los conejos comúnmente llamados cola de algodón. Ellos descubrieron que las lesiones formadas en conejos domésticos, después de inocularlos con extractos de verrugas de los conejos de cola de algodón eran sensibles a la progresión maligna. 1 El hallazgo más importante lo hizo en 1974 el Dr. Zur Hausen al ser el primero en investigar la relación del cáncer cervicouterino con la presencia de DNA de VPH por medio de experimentos de hibridación con verrugas genitales. 7 Los primeros tipos de papiloma humano aislados directamente de biopsias de cáncer cervicouterino VPH16, VPH18 fueron clonados in 1983 y 1984 y después de esto empezó la expansión en los estudios rápidamente. 8,9 2. Virus de papiloma humano. Anteriormente se agrupó a los Papilomavirus en la familia Papovaviridae por la similitud en su material genético que es circular de doble cadena y su cápside no envuelta. Finalmente se reconoció que las dos familias de virus cuentan con diferente organización y tamaño geonómico y no comparten ninguna similitud en la secuencia de sus nucleótidos. 3

13 Esto fue establecido en 2004 por el Comité Internacional en la Taxonomía de los Virus (ICTV) separándolos en dos familias diferentes, Papillomaviridae y Polyomaviridae. 10 Ciento ochenta tipos de papilomavirus han sido completamente descritos, (Figura1). Se han clasificado por grupos que incluye su importancia en la patogénesis. 10 Están ampliamente distribuidos en la naturaleza, en su mayoría se encuentran en mamíferos, aves y reptiles, muchos detectados en humanos, por la importancia medica en las patologías que estos provocan han sido estudiados mas ampliamente. 11 Los papilomavirus aislados son descritos como tipos, esto fue basado en el aislamiento de su genoma completo, alrededor de 40 tipos afectan el tracto anogenital, por su importancia y con base en su asociación con el cáncer cervicouterino y sus lesiones precursoras y su riesgo oncogénico se clasifican en: Tipos de Alto Riesgo VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59. Probable Alto Riesgo VPH 26, 53, 66, 68, 73, 82. Bajo Riesgo HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, CP6108. Los cuales están perfectamente adaptados al tejido de su hospedero natural, en el humano por lo general es más común encontrarlo como tumores benignos llamados verrugas cutáneas, ya que son específicos de epitelios queratinizados y mucosas, distribuidos en el cuerpo. 10 Figura 1. Esquema del modelo tridimensional del virus del papiloma humano. 4

14 Las partículas virales del papiloma humano constan de 8000 pares de bases (pb), con un ADN de doble cadena circular y una cápside de 72 capsómeros (60 hexámeros y 12 pentámeros), con diámetro aproximado de 55nm y que alberga al genoma viral dividido en tres regiones: la región que se compone de proteínas que se expresan tempranamente (Early), E1, E2, E4, E5, E6, E7, y la región que corresponde a las proteínas tardías (Late), L1, L2, cuya expresión genera las proteínas involucradas en la producción de la cubierta viral la cápside y una región larga de control (LCR), de aproximadamente 1000pb que no codifica para ninguna proteína, pero contiene cis-elementos requeridos para la regulación de la expresión de los genes y replicación del genoma. 3 Figura 2. Ejemplo de la organización del genoma viral. Muñoz et al. Vaccine 24S3 (2006) S3/1 S3/10 3. Las proteínas virales del papiloma humano a) Las proteínas E1 y E2 Los VPH replican su genoma como ADN episomal usando dos proteínas virales, E1 y E2. 12 Las proteínas E1 y E2 actúan recíprocamente formando un complejo en el origen viral de replicación (Ori) y cooperativamente activan la maquinaria de la replicación celular del genoma viral. 13 5

15 E1 tiene una longitud casi de 2000pb aproximadamente, es de gran importancia en la investigación por ser una de las proteínas mas conservadas en los papilomavirus esto hace que muchos de los métodos de detección se basen en esta región especifica, E1 se divide en tres regiones: un dominio amino terminal, que se sospecha regula las actividades de E1, la segunda es una región espaciadora de longitud variable y una región carboxilo terminal, relacionada con una función de ATPasa y helicasa. 1 Por otra parte el producto del gen viral E2 es una proteína multifuncional que controla la trascripción y replicación del genoma viral a través de su interacción con complejos celulares. 14 Algo muy importante en el mecanismo de E2 en las infecciones por VPH es que modula de manera negativa la expresión de los oncogenes E6 y E7, 15 por su capacidad de regular de la trascripción viral, en un mecanismo de represión del promotor temprano, el cual dirige la síntesis de los oncogenes antes mencionados. Y así detener el crecimiento de las células tumorales. En estudios donde se investigó la presencia de E2 en células HeLa provoca la detención del ciclo celular e induce apoptosis. 16 b) Las proteínas E5, E6 y E7 Dentro de la función de la proteínas tempranas mencionamos por su interés tres genes que poseen actividad en la estimulación de la proliferación: E5, E6 y E7. E5 parece ser importante en el curso temprano de infección, estimula el crecimiento de la célula formando un complejo con el factor de crecimiento de la epidermis. E5 también ha mostrado características para prevenir la apoptosis posterior al daño al ADN. 17,18 La proteína E5 es expresada en infecciones productivas, el rol en estas infecciones es mantener el fenotipo de la malignidad en células cancerosas representada por una proteína hidrofóbica que se encuentra en el aparato de Golgi y en la membrana plasmática o haciendo complejos con una variedad de proteínas transmenbranales como el receptor del factor de crecimiento epidermal y el receptor de estimulación colonial factor-1. E5 en VPH16 posee una actividad transformante e induce a la proteín-cinasa K (PKC) que es trascendente en la inducción de las células 3T3 en ratones o en la inmortalización de queratinocitos humanos, resultando en la supresión del inhibidor ciclin-dependiente de 6

16 cinasas p21cip1, aunque la contribución de E5 en las infecciones es aun pobremente entendida. 23 La propiedad oncogénica ha sido atribuida a las oncoproteínas E6 y E7 ya que muchos estudios se han realizado en este tema, contribuyen a la inmortalización celular por medio de su efecto en proteínas que regulan el ciclo celular. Las proteínas de E6 de los tipos de alto y de bajo riesgo son aproximadamente de 150 aminoácidos con pb. Las proteínas de E6 de alto riesgo se distribuyen en el núcleo y el citoplasma, se ha reportado que se han encontrado más de 12 uniones a diferentes proteínas, ha mostrado tener función en la regulación de la trascripción, incremento en la vida celular por la sobre activación de la telomerasa, de igual forma incluye la inmortalización de células primarias con queratinocitos junto con E7, 19 transformación en la estabilidad en líneas celulares y tumorgénesis, altera la trascripción de genes celulares por su interacción con p300 y CBP, bloqueando la apoptosis ya que esta ligada en daño a la proteína supresora de tumores p53, por la vía de la ubiquitinación, dando lugar a la proteólisis. 19 De las primeras observaciones en la acción de E6 que se han estudiado es su interacción con p53 que es un supresor de tumores bien caracterizado que regula la expresión de proteínas involucradas en el control del ciclo celular, incluso también con el inhibidor de ciclin-cinasas p21, en la exposición al daño del ADN, p53 se activa e induce altos niveles de expresión de p21, mientras que se produce el arresto del ciclo celular y apoptosis. Una vez que las células son infectadas actúa para prevenir contra los virus en las células vecinas por la activación de vías apoptoticas. Muchos virus han desarrollado mecanismos para bloquear la inducción de la apoptosis y de esta manera permitir el desarrollo de malignidades. 25 Para superar la actividad proapoptótica de p53 y permitir la progresión del ciclo celular, E6 se liga al p53 en un complejo ternario con una unión ubiquitin-ligasa llamada E6-AP. (esta proteína reemplaza a Mdm2, que en células normales no infectadas es quien degrada a p53). La formación de este complejo produce la ubiquitinación de p53 y la degradación subsecuente por los proteosomas 26S, mientras que se lleva a una reducción en la vida media de p53 de varias horas a menos de 20 min en los queratinocitos, E6 también puede disminuir la regulación indirectamente en la actividad de p53 de a través de su asociación con p300/cbp que es un co-activador de p53. 7

17 p53 regula los puntos de control G1/S y de G2/M del ciclo celular, su producción rápida produce abrogación de estos mandos, mientras que se llevan a cabo duplicaciones cromosómicas y anormalidades en el centrosoma. 25 (Figura3). La mayoría de las proteínas de VPH de bajo riesgo no se unen a p53 o lo hacen débilmente y no lo degradan. 1 La proteína E7 de aproximadamente pb codifica para una proteína de 100 aminoácidos, tiene la mayor capacidad transformante, 20 está ligada a la inactivación de la proteína supresora de tumores que forma parte de la familia retinoblastoma prb que controla la replicación celular y proteínas relacionadas como p107 y p E7 está localizada en el núcleo de las células infectadas. 20 Lo que hace interesante en la unión entre E7 y prb es que conduce a la liberación de los factores de trascripción de la familia E2F dependientemente de la presencia de factores de crecimiento externos, promoviendo el progreso de la fase S del ciclo celular y por lo tanto la replicación celular. 1 E7 está compuesta por tres dominios: el primero es un dominio N-Terminal (CR1), seguida por 21 aminoácidos (conocidos como CR2) y un C-Terminal. El dominio que contiene la CR2 tiene una secuencia LxCxE, esencial para la integración con prb y las proteínas relacionadas p107 y p Una serie de experimentos sugieren que E7 puede directamente inducir alteraciones fundamentales en el metabolismo celular incluidos procesos glicolíticos y la regulación del ph intracelular, así como su habilidad para inducir anormalidades en el centrómero y como modulador mitótico ya que puede directamente contribuir en la generación de cambios cromosómicos en el hospedero que son necesarios para la progresión a la carcinogénesis. 21 Figura 3. Interacción de E6 y E7 en el ciclo celular. López -Saavedra Cancerología 1 (2006):

18 c) Las proteínas L1 y L2 Las proteínas L1 y L2 han sido de gran utilidad en el estudio para la identificación de los VPH y estudios filogenéticos, esto por su alto grado de conservación en sus secuencias, 21 además de ser importantes en el desarrollo de vacunas. L2 es la proteína en menor proporción de la cápside viral, L1 ocupa casi el 80% de la cápside y se expresa después de L2, esta se acumula en estructuras nucleares llamados dominios oncogénicos de la proteína de leucemia pro-monocítica (PLM) que durante el ensamblaje del virus atrae a L1 hacia estos dominios, se ha sugerido que estos cuerpos PLM son el sitio de la replicación del ADN viral y que las proteínas de la cápside se acumulan en este sitio para facilitar el empaquetamiento, 1 son sintetizadas en el retículo endoplasmático de las células del hospedero, para ser posteriormente transportadas al núcleo donde se lleva a cabo su ensamblaje. 16 d) La región larga de control La región larga de control (LCR), dependiendo del tipo viral mide aproximadamente 1000pb ocupando entre el 7 al 11% del genoma del virus, no codifica para ninguna proteína, pero contiene cis-elementos requeridos para la regulación de la expresión de los genes y replicación del genoma, se divide en tres partes: el promotor temprano, el amplificador o enhancer, de alrededor de 230pb y la región mas alejada del 5, en donde diferentes factores celulares y virales interaccionan en esta región, entre los cuales se encuentran E1 y E2 donde modulan la actividad transcripcional y la replicación del virus, así como receptores de glucocorticoides que modulan positivamente la trascripción. El complejo proteico que se ensambla en el enhancer, conocido como el enhanceosoma, interacciona con las proteínas del aparato basal de trascripción, que se une en la región promotora hacia el extremo 3 del LCR, aumentando así la actividad transcripcional del promotor y por ende la expresión de los genes tempranos. 1 9

19 4. Ciclo de vida del VPH Los VPH inducen la formación de verrugas en una amplia serie de vertebrados incluyendo el ser humano, en la mayor parte de casos se trata de infecciones asintomáticas aunque en los últimos años se ha demostrado su capacidad oncogénica. El ciclo vital del virus del papiloma se produce de forma coordinada con la diferenciación y división celular del epitelio escamoso, al iniciar la infección se requiere el acceso de partículas virales en las células básales del epitelio escamoso a través de microlesiones que exponen dicha capa al virus. 11 Para algunos tipos de VPH se piensa que requiere un rompimiento en el epitelio estratificado, tales rompimientos no están claros y puede ocurrir bajo condiciones dónde la piel esta expuesta o desgastada o se sujeta a otros ambientes dónde las microlesiones se puedan desarrollar. Se ha sugerido que para una lesión pueda ser mantenida, el virus debe infectar una célula madre stem cell del epitelio en las células superficiales cutáneas o dentro del folículo piloso que pueden representar un sitio importante de entrada, varios estudios han mostrado ADN de virus que han sido aislados en estos lugares. La producción de viriones maduros no ocurre hasta la capa exterior del epitelio, sin embargo, está ligada a la replicación viral y al patrón normal de queratinización y diferenciación celular. 11 Para los virus de alto riesgo como VPH16 la formación de lesiones cervicales en la mucosa, puede facilitarse por la infección de células del epitelio columnar que subsecuentemente llegan a la capa basal del epitelio estratificado y al epitelio de la zona de transformación. La controversia existe acerca de la naturaleza del receptor de la superficie celular que permite la unión inicial del virus a la célula. Un trabajo reciente sugirió que la entrada de los viriones es limitado ya que es un proceso lento con una vida media de horas en lugar de minutos y eso ocurre a través de la endocitosis. Si la transformación viral en la expresión de las proteínas E6 y E7 en las células de la capa basal no es cierta según algunos autores, aunque parece que la infección inicial continua por una fase proliferativa que produce un incremento en el número de las células básales con el ADN viral en forma episomal, se ha sugerido que el genoma viral se mantiene en la capa basal en alrededor de copias por célula y las proteínas virales tempranas (E6, E7, E1 y E2) se expresan en un nivel bajo. La contribución de E6 y E7 en la proliferación celular basal durante la infección in vivo es actualmente incierto y ha sido sugerido que la 10

20 expresión de E1 (y posiblemente también E2) sea suficiente para el mantenimiento basal de los episomas virales así como facilitar la segregación correcta de genomas durante la división celular. 11 (Figura4). Figura 4. Organización de ciclo de Vida durante la infección productiva por tipos de HPV. J. Doorbar / Journal of Clinical Virology 32S (2005) S7 S15 (A) Representación de la piel para revelar el modelo del VPH16 y la expresión de los genes cuando la célula infectada emigra hacia la superficie del epitelio, virus como HPV2 y HPV11 sigue un patrón similar. Después de la infección (en este caso a través de un corte), el genoma viral se mantiene de forma episomal con un numero bajo de copias, durante la diferenciación del epitelio, el promotor de p97 dirige expresión de los genes E6 y E7, que son necesarios para la entrada de la fase-s (rojo). El promotor del p670 es sobre regulado en las capas más altas del epitelio, y las proteínas de la replicación viral (E1, E2, E4, E5) aumentan en abundancia (verde), facilitando la amplificación de genomas virales (azul). Los cambios en el splicing del ARNm permiten a E4 persistir en las capas superiores del epitelio dónde se encuentran las proteínas de la cápside viral (amarillo). (B) La amplificación del genoma viral empieza una vez en las células básales pero estas pierden su habilidad de expresar las proteínas de la fase-s. Aunque la amplificación del genoma viral puede ser detectada a lo largo de las capas superiores del epitelio, células que son activas en el apoyo de la amplificación del genoma parecen confinadas a una región dónde la expresión de E7 coincide con el incremento de la expresión de E4, y probablemente también, un aumento en la abundancia de E1 y E2. 5. La fase proliferativa Las células básales que no han sido infectadas del epitelio, terminan el ciclo celular y emigran poco después a la capa suprabasal y sufren un proceso de diferenciación terminal. Los cambios incluyen el entrecruzamiento de filamentos de queratina, la 11

21 secreción de lípidos que permiten la aparición del epitelio para formar una barrera física contra el ambiente durante la infección del VPH, la proteína E7 (y presumiblemente también E6) se expresa en estas células, la progresión del ciclo celular y la diferenciación terminal normal está bloqueada, se piensa que E6 y E7 trabajan para lograr estos efectos juntos y en lesiones causadas por los tipos de VPH de alto riesgo (como VPH16), las proteínas E6 y E7 se expresan con funciones que estimulan la progresión del ciclo celular y se pueden asociar con reguladores del ciclo celular y con los miembros del la familia de la proteína prb. (Figura 5). Figura 5. Oncogénesis por VPH y su interacción con las proteínas E6 y E7. Documentos del consenso Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (SEGO) La infección por papilomavirus SEGO 2002 p La proteína prb es un regulador negativo del ciclo celular que normalmente previene la entrada de la fase-s asociada con la familia de la proteína E2F que esta involucrada en factores de la trascripción, E7 ligada al prb desplaza a la proteína E2F, independiente de la presencia del factor de crecimiento externo y lleva a la expresión de proteínas necesarias para la replicación del ADN, E7 también se puede asociar con otras proteínas involucradas en la proliferación celular, incluso con las histonas. La capacidad de E7 para estimular la progresión de la fase-s se limita al subconjunto de células diferenciadas con niveles bajos de p21/p27 o que expresan altos niveles de E7, para superar el bloqueo de entrada a la fase-s, la proteína E6 complementa el papel de E7, se piensa que previene la inducción de apoptosis en respuesta a la entrada de la fase-s no 12

22 programada mediada por E7. E6 también se puede asociar con otras proteínas preapoptóticas como Bak y Bax, como consecuencia, la presencia de E6 es considerada un factor para la predisposición en el desarrollo de cáncer VPH-asociado, permitiendo de esta manera la acumulación de errores en el ADN de las células del hospedero. La proteína de E6 de tipos de VPH de alto riesgo también puede estimular independientemente la proliferación celular de E7 a través de su C-terminal. El dominio en la unión E6-PDZ es suficiente para mediar la proliferación celular en la capa suprabasal contribuyendo al desarrollo de tumores metastáticos, rompiendo la adherencia celular normal Amplificación del genoma Para la producción de viriones infecciosos, los VPH deben amplificar su genoma viral y debe empaquetarlos en las partículas infecciosas, esto ocurre en las capas intermedias o superiores del epitelio, seguido por un aumento en la actividad del promotor tardío. El promotor tardío reside dentro del el marco abierto de lectura (ORF) de E7 y se piensa que su regulación lleva a la expresión de proteínas involucradas en la replicación del ADN viral (es decir, E1, E2, E4 y E5) sin afectar directamente la expresión de las proteínas E6 y E7 que son necesarias para la entrada a la fase-s. La amplificación de los genomas virales inicia en un subconjunto de células proliferativas y requiere la expresión de productos de genes tempranos incluso E4 y E5, a lo largo del ciclo de vida del virus, los niveles relativos de proteínas E1 y E2 de diferentes virus, permiten un aumento en el número de las copias virales en las capas superiores del epitelio, aún no se entienden bien los mecanismos moleculares que llevan a la activación del promotor tardío y a la regulación de expresión de E1/E2 y es posible que este promotor sea constitutivamente activo en todas las fases durante el ciclo productivo, los modelos actuales sugieren que un aumento en la activación del promotor durante la diferenciación pueda llevar a un aumento en el nivel de E1 y E2 (y también de E4 y E5), además un incremento subsecuente en el número de copias del genoma. Los genomas recientemente replicados servirían como templados para la expresión de E1 y E2, que facilitarían la amplificación adicional de genomas virales y a su vez, expresión en la replicación de las proteínas E1 y E2. 1 (Figura 6). 13

23 Figura 6. Ciclo viral en el epitelio estratificado. López -Saavedra Cancerología 1 (2006): La síntesis del VPH Los VPH codifican dos proteínas estructurales que se expresan en las capas superiores del epitelio infectado, cuando su genoma viral ha sido amplificado de forma completa, la proteína mayor de la cápside L1 se expresa, después L2 permite el ensamble de partículas infecciosas en las capas superiores del epitelio, la proteína L2 aumenta las estructuras nucleares conocidas como cuerpos de PML durante el ensamblaje del virus posiblemente a través de la asociación con el factor de la trascripción Daxx. Se ha sugerido que los cuerpos de PML puedan ser los sitios de replicación del ADN de los PV, y que las proteínas de la cápside se acumulan en este sitio para facilitar el empaquetamiento. La retención intracelular de antígenos de los PV hasta alcanzar las capas celulares mas altas del epitelio pueden comprometer la detección del sistema inmune al descubrir las partículas virales, particularmente como el virus tiene mecanismos moleculares que limitan la presentación de epítopos virales con el sistema inmune en las capas mas bajas del epitelio, se ha sugerido que la proteína viral E4 puede contribuir directamente a la salida del virus en la capa superior del epitelio, perturbando la integridad de la queratina afectando el ensamble de la cápside. 11 (Figura 7). En las lesiones cutáneas benignas, el virus está presente en forma de plásmido extracromosomal en el núcleo de las células y se replica por separado por vía extra cromosómica. A medida que las células emigran hacia los estratos superficiales y se diferencian, cesa la replicación, pero el genoma viral en algunos tipos de infección por VPH se amplifica en las células escamosas superficiales, hasta llegar a varios 14

24 miles de copias por célula, en ese momento se pueden activar los genes tardíos (L1, L2) y se produce la proteína de la cápside, con lo que aparecen viriones completos. Las células superficiales en las que se acumulan numerosos viriones completos muestran características peculiares recibiendo el nombre de coilocitos. (Figura7) Figura 7. Células superficiales Coilocitos Cortesía Dr. J.E. Carmona. 8. La integración de ADN El ADN del VPH normalmente se encuentra en forma extracromosomal o episomal en lesiones benignas o en lesiones precursoras. Sin embargo, en muchas células de cáncer cervical así como en líneas celulares y en queratinocitos humanos VPH-transformados in vitro, el ADN del VPH se integra en el genoma del hospedero. Los tejidos de cáncer pueden contener ambos tipos de ADN viral episomal o integrado al mismo tiempo, aunque la integración parece ocurrir más frecuentemente en VPH18 que en HPV16. Durante la integración de ADN del VPH, el genoma viral normalmente rompe la región de E1/E2. El rompimiento lleva a la pérdida de las regiones E1 y E2. La pérdida de E2 codifica para proteínas que incluyen la inhibición de la trascripción de las regiones de E6 y E7, resultando en un incremento en la expresión de las estas proteínas, llevando a la transformación maligna de las células del hospedero y la formación del tumor. La integración viral en ADN genómico del hospedero juegan un papel fundamental en la progresión en las lesiones de bajo y alto grado

25 9. La regresión de las lesiones y latencia del virus Aunque la amplificación del genoma y empaquetamiento son necesarios para la formación de nuevos viriones, la infección puede tener otros resultados, la inoculación experimental con papilomavirus de conejo cola de algodón ROPV, o la inoculación de perros con papilomavirus oral canino COPV generalmente llevan al desarrollo de lesiones que pueden persistir durante semanas en lugar de años. Lesiones producidas por ROPV y COPV se parecen en muchos aspectos a las producidas por los VPH y estos virus se han propuesto como modelos para estudiar la mucosa en la infección de VPH en los humanos entre 8 y 12 semanas, la infiltración de linfocitos y la regresión de la lesión tiene lugar en aproximadamente 16 semanas, el área infectada tiene la apariencia de un epitelio sin infección. La importancia del sistema inmune para controlar la enfermedad está bien establecida contra el VPH pero los pacientes con problemas en el sistema inmune son susceptibles a la infección y pueden desarrollar lesiones que reinciden para su tratamiento. Las infecciones de VPH, son un problema particular en personas que han recibido un trasplante renal asi como en otros pacientes inmunosuprimidos. La detección frecuente de ADN de virus tipo VPH16 en lesiones cervicales en ausencia de cualquier lesión obvia, puede explicarse por la presencia en estado latente por parte del virus en muy pocas células. Se piensa que el ADN del VPH permanece en las células basales del epitelio y se reactiva posteriormente. El modelo de expresión de los genes virales en las capas celulares basales durante la infección latente puede ser similar al modelo de la expresión durante la infección productiva. Se ha sugerido que la expresión de los genes latentes se restrinja a E1 y E2 y que durante esta fase del ciclo de vida del virus no se requieren los genes E6 y E Respuesta inmune contra el VPH Hasta el momento se desconocen muchos aspectos de la respuesta inmune contra los VPH, no obstante, se sabe que la respuesta inmune celular es crucial en la patogénesis de la infección por VPH, una de las ventajas que posee este virus, es que no produce lisis celular, por lo cual los antígenos virales no parecen estar disponibles para ser presentados por las células presentadoras de los antígenos y por lo tanto se limita la inducción de células T 16

26 citotóxicas específicas. La expresión de las proteínas del VPH está cercanamente ligada al estado de diferenciación de la célula epitelial infectada, las proteínas E1 y E2 tienen un bajo nivel de expresión, además de que se localizan en el núcleo donde son difícilmente reconocidas por el sistema inmune. 11 Las proteínas E4, L1 y L2 se localizan tanto en el citoplasma como en el núcleo y se expresan a niveles importantes, pero sólo en los queratinocitos bien diferenciados, los cuales son rápidamente descamados del epitelio, impidiendo su adecuado reconocimiento por el sistema inmune, en las pacientes con infección cervical persistente por VPH16 se ha encontrado ausencia de respuesta a la proteína E6, lo cual sugiere un papel importante de la respuesta de las células T a E6 para la regresión de las lesiones. En general, la gran mayoría de péptidos o antígenos del cáncer son pobremente inmunogénicos. Las células tumorales frecuentemente sub-regulan la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad MHC-I o inducen mutaciones en el gen de la β2-microglobulina como estrategia para evadir su reconocimiento por parte del sistema inmune. 24 a) Respuesta inmune innata El principal mecanismo de defensa ante una infección viral requiere la integridad de las superficies epiteliales o endoteliales, una vez que se altera el mecanismo de barrera, se dispara una serie de mecanismos inespecíficos o innatos tales como la producción de interferones (IFN's), células asesinas (NK) y los macrófagos. La infección viral celular induce la producción de IFN-alfa (IFN-α) e IFN-beta (IFN-β), los cuales activan mecanismos antivirales en las células vecinas capaces de resistir la infección. El interferón gamma (IFN-γ), por otra parte, activa la función de las NK y macrófagos e incrementa la eficiencia de la respuesta inmune adaptativa mediante la estimulación de la expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo I y II (MHC-I, MHC-II)

27 11. Cofactores en la oncogénesis La capacidad de los diferentes tipos de VPH de alto riesgo para transformar e inmortalizar las células infectadas se ha establecido ampliamente. Sin embargo, también se pueden encontrar casos donde las infecciones tienen una regresión espontánea, incluso en casos dónde la infección persiste y las lesiones no aparecen hasta muchos años o más de una década después. La infección puede comenzar pero no necesariamente progresa a carcinoma cervical o sus lesiones precursoras. La influencia por otros factores, o cofactores, es necesaria para establecer una malignidad VPH-inducida. 26 Los factores más investigados han sido otras enfermedades de transmisión sexual (ETS). En estudios caso control, al estudiar la relación entre ETS y cáncer cervical, se encontró una débil asociación entre anticuerpos frente a Chlamydia trachomatis y el NIC3-carcinoma in situ y carcinoma cervical, pero solamente en aquellos casos en que la detección de VPH era negativa. Aunque este hecho podría ayudar a explicar los casos de cáncer en los que no se detectaron secuencias de VPH, se duda que exista este tipo de cáncer cervical. Mucho tiempo se pensó que herpes virus podría desarrollar un importante papel en la oncogénesis cervical, sin embargo, no se ha podido demostrar en estudios caso-control. 27 Aunque en 1994 se describió una asociación entre herpes virus 6 y cáncer cervical. 28 La inmunosupresión es un cofactor importante en el inicio y rápida progresión de la enfermedad, puede presentarse en pacientes sometidos a quimioterapia por neoplasias o a tratamiento inmunosupresor en casos de trasplante. El tabaquismo ha sido identificado en algunos estudios como un factor de riesgo independiente para el cáncer cervical, los anticonceptivos orales pueden tener un papel importante ya que se encontró asociación entre su uso prolongado y riesgo de carcinoma, pero solamente en las mujeres VPH positivas. Las mujeres que han utilizado 6 años o más anticonceptivos orales y están infectadas por un VPH de alto riesgo tienen un riesgo 4 veces superior de desarrollar un cáncer cervical, con respecto a las mujeres que no los utilizan y que también están infectadas. 4 18

28 12. Manifestaciones clínicas Uno de los retos de la medicina a lo largo del tiempo ha sido sin lugar a duda ganar la batalla al cáncer que hasta el día de hoy sigue siendo un problema de salud pública y social de primer orden, las formas de lucha más eficaces serían la prevención del mismo o bien su diagnóstico en fases tempranas, aquellas en que pueda ser curado después de un tratamiento adecuado. El análisis temprano de las lesiones preinvasoras no es nuevo, ya desde el siglo pasado algunos autores comentaron la existencia de anomalías morfológicas no invasoras del epitelio adyacente al tumor. En 1910, Rubin (Nueva York) habla de cáncer incipiente para nominar el concepto de transformación neoplásica confinada al espesor del epitelio. En 1912, Schottländer y Kermauner (Berlín) utilizan el término de carcinoma temprano para designar los cambios que observaban en el epitelio adyacente al carcinoma cervical invasor. Veinte años más tarde, Broders (Nueva York), basandose en su experiencia en dermatopatología, emplea el término de carcinoma in situ e invasor (CIS) al describir éste cuadro histológico. Otros términos utilizados fueron el de enfermedad de Bowen cervical por Lecéne (París), también en 1932, y el de carcinoma intraepitelial no invasor por Galvin y Te Linde (Nueva York), en Pese a la proliferación de estos y otros muchos sinónimos, el término acuñado por Broders es el que ha permanecido para designar estas lesiones caracterizadas por la completa sustitución del epitelio por células anómalas semejantes a las células del carcinoma invasivo. 29 De cualquier forma, también es sabido que antes de llegar al denominado carcinoma in situ, existen otras alteraciones morfológicas previas, con identidad propia, capaces de ser diagnosticadas tempranamente, con esta idea surgió en 1956 con Reagan el término de displasia cervical, 29 entendiéndose como tal a todo un espectro de anomalías morfológicas comprendidas entre el epitelio cervical normal y el del carcinoma in situ. La displasia del cérvix uterino es por tanto, el conjunto de cambios morfológicos del epitelio cervical que llevan a una desestructuración en la forma de las células escamosas, asociado a una atipia citológica, reflejada como una hipertrofia e hipercromásia nuclear. 4 Durante mucho tiempo se intentó separar el concepto de displasia, como lesiones capaces de regresar del carcinoma in situ o preinvasor. Aunque en un principio parecía entendible, pronto surgieron problemas de reproducibilidad y limitaciones a la interpretación 19

29 histológica que dieron lugar a subclasificaciones, no fácilmente entendibles. En la segunda mitad del siglo XX se comprobó que las características celulares tanto de la displasia como las del carcinoma (in situ o invasor) serían las mismas (población monoclonal; contenido aneuploide del ADN, etc.), dando por hecho que se trataría del mismo proceso sólo que en diferentes momentos del estadio de evolución. Con base en estos estudios biológicos, fue Richart quien propuso que todas estas alteraciones podían evolucionar a una invasión e introdujo el concepto de Neoplasia Intraepitelial Cervical, más conocido con la terminología de CIN o NIC, también se cuantificó el grado de lesión lo que permitió la subdivisión en diferentes grados de severidad. Así tendríamos NIC 1 o displasia leve, cuando las alteraciones morfológicas descritas hagan referencia al tercio inferior del epitelio; NIC 2 y NIC 3 cuando la lesión alcance respectivamente dos tercios o la totalidad del espesor del epitelio. 29 Las diferencias entre displasia severa y carcinoma in situ quedarían reflejadas por la existencia de una capa de elementos celulares aplanados en la superficie del epitelio. Esta clasificación, aunque todavía vigente, no está exenta de ciertas limitaciones y problemas de reproducibilidad en el momento de diagnosticar, se ha visto que no todas las lesiones de NIC evolucionan de la misma manera, más aún desde que se comprobó su asociación con los diferentes genotipos del VPH, capaces de conferir mayor o menor grado de agresividad. Esto hace que se replanten nuevos intentos de clasificación. En este sentido fue el mismo Richart quien sugirió clasificar como NIC-bajo grado y NICalto grado; el primero englobaría a lesiones de VPH y NIC 1 y el alto grado NIC 2 y 3. Otra modificación sería introducida por el sistema de Bethesda y propondría los términos de Lesión intraepitelial escamosa de Bajo grado (LSIL) y el de Lesión intraepitelial escamosa de Alto grado (HSIL). En el primero de los casos se incluirían los términos de alteraciones por papilomavirus humano (condilomas) y NIC 1, mientras que en el segundo grupo se incluiría el resto. Estos dos nuevos sistemas de reclasificación serían los mismos salvo que en el del sistema de Bethesda se prefiere el término de lesión al de neoplasia (Figura 8). 20

30 Figura 8. Esquema que muestra la progresión de un epitelio normal hacia displasia y carcinoma in situ y las clasificaciones según Richart y el sistema Bethesda. La clasificación del Sistema Bethesda del año 2001 ayuda a reconocer mejor las lesiones iniciales y facilita la reproducibilidad. En esta clasificación diferencia las alteraciones celulares según provengan del epitelio superficial o del glandular. 29 Esta nueva clasificación quedaría de la siguiente manera: 13. Alteraciones celulares del epitelio a. Del epitelio escamoso de superficie: Atipia de células escamosas: ASC De significado incierto. ASC-US Que no puede ser excluido Lesión intraepitelial de bajo grado (VPH-NIC 1). Lesión intraepitelial de alto grado (CIS, NIC2, NIC 3; sospechosos invasor. Carcinoma de células escamosas. b. Del epitelio glandular: Atipia: De células endocervicales. De células endometriales. De células glandulares. 21

31 Atipia: De células endocervicales en favor de neoplasia. De células glandulares en favor de neoplasia. Adenocarcinoma endocervical in situ Endocervical Endometrial Extrauterino No especificado de otra manera. Por otra parte la clasificación de Papanicolaou fue de gran utilidad por muchos años, está basada en números que denominaba clases, que describían los cambios celulares. Se dividen en cinco clases y enuncian en números romanos: I. Hallazgos celulares esencialmente normales II. Cambios celulares diversos, compatibles con alteraciones de tipo inflamatorio. III. Incluía cambios celulares inciertos, algunos correspondientes a alteraciones inflamatorias y cambios regenerativos, sin incluir células con cáncer, que se describen en la siguiente clase. IV. Células con cambios iniciales de cáncer, como el carcinoma in situ V. Células con cambios indudables de cáncer CLASIFICACION NOMENCLATURAS PAPANICOLAOU NORMAL (CLASE I) (CLASE II ) (CLASE III) (CLASE IV) (CLASE V) DISPLASIA (OMS) NORMAL LEVE MODERADA GRAVE CARCINOMA in situ NIC (RICHARD) NORMAL NIC I NIC 2 NIC 3 SISTEMA NORMAL LIE DE BAJO LIE DE ALTO GRADO BETHESDA GRADO Tabla 1. Equivalencias entre las diversas nomenclaturas usadas en citología. LIE: Lesión Intraepitelial Escamosa 22

32 14. Diagnóstico a) La citología convencional (Papanicolaou) La citología permite la detección de lesiones precursoras del cáncer de cuello uterino mediante una intervención inocua y de bajo costo. 31 El fundamento de la técnica radica en la localización de la mayoría de las lesiones en una zona fácilmente accesible, y en el reconocimiento del grado de maduración de las células atípicas que descaman de la superficie del epitelio. El procedimiento se ha aplicado durante los últimos cincuenta años con pocas variaciones. 4 La citología cervical está considerada como uno de los procedimientos más eficaces en medicina preventiva y probablemente como el más eficaz en prevención de cáncer, aunque se ha calificado como una prueba de rentabilidad subóptima, 30 ya que frecuencia de falsos negativos en la citología sigue siendo una de las limitaciones de los programas de detección y una de las mayores causas de litigio médico. 32 Puesto que la frecuencia de falsos negativos puede ascender hasta el 50% para las lesiones de HSIL y entre el 6 y el 45% para las de LSIL. Un tercio de dichos falsos es atribuible a una mala interpretación citológica, pero los otros dos tercios son una consecuencia directa de la obtención, proceso y calidad de la muestra. Para obtener buenos resultados con la citología es requisito fundamental que la toma sea correcta, obteniendo el material directamente del endocérvix y exocérvix, para mejorar la toma endocervical se usa un cepillo, que introducido en el interior del endocérvix se adapta bien a sus paredes y al rotarlo raspa la superficie, para la toma de ectocérvix se usa una espátula de madera. 30 b) Citología en base líquida lectura en monocapa celular En los últimos años se han desarrollado técnicas de proceso citológico en medio líquido, lo que permite una homogenización de la muestra para posterior extensión en monocapa celular, parece ofrecer una serie de ventajas sobre la citología convencional, especialmente al mejorar la lectura de los frotis al eliminar los grumos, sangre y otros artefactos, mejorando así la lectura microscópica, a su vez, esta técnica permite opcionalmente, la detección molecular de VPH sin necesidad nuevo muestreo