Aplicación de los Marcadores moleculares en el área pecuaria: avances, retos y perspectivas

Transcripción

1 Aplicación de los Marcadores moleculares en el área pecuaria: avances, retos y perspectivas Dra. Ana M. Sifuentes Rincón Lab. de Biotecnología Animal Centro de Biotecnología Genómica-IPN

2 Qué es la Biotecnología? Combinar los organismos vivos o partes de éstos con tecnología para producir o mejorar productos. El desarrollo de bienestar y servicios a partir del conocimiento de los genomas

3 Aplicaciones de la Biotecnología Animal - Mejoramiento Genetico Asistido por marcadores - Desarrollo de Animales transgenicos para: *Mejorar la productividad de los animales *Aplicaciones medicas para, producir proteinas valiosas en la leche, sangre u orina de los animales. *Desarrollar modelos animales de enfermedades del humano

4 Porqué DNA? Prácticas: Hacerlas mejor Productos: Usar herramientas y tecnologías nuevas e innovadoras Genética: Incrementar los rasgos deseados en plantas y animales Food Economics and Consumer Choice (Jeff Simmons, 2008)

5 La Genómica en los animales de importancia pecuaria La industria pecuaria representa del 30 40% de las actividades agropecuarias Los animales de granja representan una de las principales fuentes de proteina en la dieta de los humanos Desde el 2005 se iniciaron diferentes proyectos de secuenciación de los genomas de los principales animales de granja que incluyen a los cerdos, bovinos, ovejas y pollos

6 Estrategias para el Mejoramiento Genético Apareamientos Objetivos de Selección Registros (Gen. y Prod). Tecnologías moleculares Bioinformática Selección Mejoramiento Animal Estimación de Parám. Estructura de Población Técnicas Reproductivas EPD s Kinghorn, B.P., Van der Werf, J. and Ryan, M. 2000

7 Qué es un genoma? El término genoma se usa para denotar la totalidad de genes y cromosomas que se encuentran en el núcleo de una célula.

8 Análisis de genomas de especies Uno de los principales objetivos del análisis de los genomas de especies de interés pecuario es encontrar aquellas variaciones en la secuencia de ADN que explique los cambios fenotípicos.

9 El genoma del bovino

10 Tipos de variación en la secuencia de DNA - Diferencias en el número de copias de secuencias repetitivas Secuencias de DNA repetido en tandem: DNA minisatélite (VNTRs) Microsatélites (repeticiónes cortas de di-,tri-, tetranucleotidos) - Inserciónes/Deleciones - Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)

11 MARCADORES DE ADN Es una región especifica del DNA donde se han encontrado variaciones que se asocian con efectos positivos o negativos en una característica de interés. Variantes alélicas o génicas A G A A T C T G A A T.T G A A C A C T C A G A A T G T G A A T.T G A A C A T T C 316 G T 4751 C C 316 G T 4751 C C Dura suave dura suave

12 Pruebas de ADN Es un análisis en el que por medio de marcadores de ADN se determina en un animal, de cual o cuales variantes génicas es portador

13 Diagnóstico molecular en ganado bovino Las pruebas de ADN en animales, tienen una amplia gama de aplicaciones y específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para: Identificación de individuos Diagnóstico de enfermedades genéticas reconstrucción de linajes estimaciones de consanguinidad Casos forenses Estudios de trazabilidad

14 IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS

15 Pruebas de paternidad Las pruebas de paternidad es un análisis que han tenido mucho impacto en la industria pecuaria. Específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para: Determinación de paternidad cuando un animal cambia o intercambia su progenie con otra madre En la determinación de paternidad cuando una hembra se aparea por empadre múltiple verificación de registros de hato

16 Pruebas de paternidad Durante las últimas dos décadas los marcadores microsatélites han sido los marcadores de elección para los análisis de paternidad/identidad y trazabilidad en animales y humanos, sin embargo, los resultados obtenidos con estos marcadores entre los diferentes laboratorios no son siempre comparables debido a las dificultades técnicas para su análisis, principalmente los errores en la determinación de los tamaños alélicos.

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18 Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) Los SNPs son el tipo más común de variación genética y son los marcadores mas populares para los diferentes estudios de genómica en bovinos Los SNPs son mutaciones de un solo par de bases en un locus específico, por lo general constan de dos alelos donde la frecuencia del alelo mas raro es 1% (MAF).

19 Ventajas de los SNPs como marcadores para pruebas de paternidad Aunque en términos de informatividad los SNPs podrían ser considerados no tan óptimos (son bialélicos) comparados con los microsatelites, presenta las siguientes características: Amplia abundancia Estabilidad en mamíferos, baja tasa de mutación (10 8 ) en comparación con los microsatelites (10 3 ) nomenclatura mas simple, posibilidades de automatización del proceso de tipificación y de interpretación de los datos. Los SNPs son también ampliamente usados para el descubrimiento de QTLs y en los estudios de asociación de genes con rasgos productivos específicos

20 Porqué verificar el pedigrí de los hatos? Un paso esencial en las estrategias de mejoramiento genético es la selección de los animales con mayor mérito genético. Los productores consideran el pedigrí del animal como un indicador muy importante de su valor genético, tomando en cuenta a sus progenitores como ejemplo del potencial racial que adquieren e invirtiendo grandes sumas de dinero por aquellos que lo ameritan Actualmente los valores genéticos son expresados en forma de Diferencia Esperada en la Progenie y es la forma más exacta de analizar la productividad de un animal y/o un hato y por lo tanto es utilizada como una herramienta muy útil en las desiciones de selección

21 Importancia de las Pruebas de paternidad Los errores de paternidad desvían los valores estimados de heredabilidad, valores genéticos, parámetros genéticos, predicciones de ganancia genética y por ende deprimen la tasa de progreso genético dada la selección errónea de los animales superiores. Ventajas: * Certificación genética. Evaluación de germoplasma y animales de pie de cría, producto de inseminación artificial. * Control genético. Caracterización genética precisa del pedigrí de los animales de registro en las Asociaciones Ganaderas * Mejoramiento genético. Determinación precisa del valor genético de los animales dentro de un hato.

22 ASIGNACIÓN Y VERIFICACIÓN DE PATERNIDAD EN UN HATO DE GANADO CHAROLAIS 32 familias 3 Padres candidatos Inseminación Artificial Genotipificación con 10 microsatelites

23 Linajes encontrados en un hato de ganado Charolais H I

24 PATERNIDAD % 38-H 65% % 250-I 13 % I. A. 3 EXCLUSIONES X 38-H OBSERVACIONES: Dominancia del semental 38-H Verificación de paternidad por inseminación artificial

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26 Verificación de maternidad y paternidad En un reciente análisis asignando paternidad con un panel de SNP s, se encontró un 33% de error en la asignación de paternidad en toda la población estudiada. Para los hatos de Nuevo León los porcentajes de error en la verificación de paternidad fueron del 0 al 19%, en Sonora del 11% y en Tamaulipas del 37%. Para poner en contexto este resultado se ha reportado que en bovinos de leche (donde la inseminación artificial es el principal método reproductivo) los porcentajes de error en la asignación de la paternidad de los individuos pueden alcanzar el 11.7% siendo las principales causas, errores en la identificación de las pajillas de semen así como errores humanos en el registro del semen utilizado durante la inseminación.

27 Perspectivas de la prueba en México En México han existido diferentes iniciativas para la implementación de programas de verificación de paternidad, sin embargo es hasta este inicio del 2014 que se ha modificado el estatus de estas verificaciones y ahora son un requisito de registro de los animales. Esta nueva normativa es un gran paso para la ganadería en México, ya que el uso de las herramientas moleculares deberá ser de ahora en adelante no solo un requisito para la obtención de apoyos, sino también debería ser, si se dirige de manera ordenada y basada en los estándares internacionales (como por ejemplo iniciar con sistemas de identificación basados en SNPs mas que en microsatélites), una oportunidad para aterrizar y hacer uso de las ventajas de incluir estas tecnologías como apoyo de las estrategias de mejoramiento genético de los hatos de esta raza.

28 Diagnóstico Molecular de enfermedades genéticas

29 En animales domésticos, actualmente, se conocen las bases moleculares de un número creciente de enfermedades hereditarias monogénicas, lo que hace posible la detección molecular directa de los individuos portadores. Ibeagha-Awemu E et al.,2008

30 Diagnóstico molecular de portadores La detección de portadores hace posible su exclusión o manejo adecuado dentro del hato y/o razas de ganado, de tal manera que se logra mantener la salud y productividad del mismo. Artrogriposis Múltiple en el ganado Angus o síndrome de becerro contraído, es una rara enfermedad congénita que causa múltiples contracturas y se caracteriza por debilidad muscular y la fibrosis. En 2008, la asociación Angus hizo un llamado de alerta ya que se detectó que sementales elite eran portadores del gen asociado a este síndrome.

31 El gen Miostatina como marcador de ADN

32 DOBLE MÚSCULO La doble musculatura o hipertrofia muscular es una anomalía genética que ha sido reconocida y seleccionada por los criadores desde 1807.

33 El fenotipo doble-musculatura se debe a un crecimiento anormal del tejido muscular, que es causado enteramente por un aumento del tamaño de las células existentes. El crecimiento anormal en la hipertrofia muscular bovina produce un aumento de la masa muscular en aproximadamente un 20%.

34 Arthur, 1995 Fenotipo DM selección negativa Menor Fertilidad (dificultad reproductiva) Mayor Incidencia de distocia (dificultades en parto) Mayor Susceptibilidad a enf. Respiratorias Desventajas cardiovasculares selección positiva Mayor masa muscular con menos grasa Reducción en el alimento ingerido Aumento en conversión alimenticia Normal Doble musculatura

35 Identificación del gen mh McPherron et al., 1997, usando la técnica de "knock out" inactivaron el gen de la miostatina y en ratones de laboratorio (MSTN_GMO), obteniendo animales con un fenotipo similar a la doble musculatura bovina. Esto permitió postular a la miostatina como el gen candidato para mh en bovinos

36 Conservación del gen MSTN en vertebrados Oveja Texel Raza de perros whippet He mas rápidos que Ho

37 Importancia de MSTN en la especie Bos taurus -Miostatina se ha analizado en más de 30 razas bovinas. -Mutación o polimorfismo: hipertrofia, hiperplasia muscular, doble musculatura - Productividad: Calidad y cantidad de musculatura

38 Diversidad alelica de MSTN Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura Descripción Tipo de mutación Raza inserción/deleción en la posición 418 Corrimiento en el marco de lectura Belgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubrac transición C T en la posición Sin sentido - terminación 610 prematura de la proteína Charoláis transversión G T en la posición 676 Sin sentido - terminación prematura de la proteína Maine-Anjou, Parthenais Belgian blue, Corrimiento en el marco Deleción de 11 pb desde la Limousine, South de lectura - terminación posición 821 hasta la 831 Devon, Asturiana de los prematura de la proteína Valles transición G A en la posición Transversión consentido. 938 Cys Tyr en la proteina Piemontese, Gascon Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales transversión C A en la posición 282 Mutación consentido. Phe Leu en la proteina Limousine, Aubrac, Devon, Pirenaica transición C T en la posición 414 Transición silente sin cambio en la proteína Ampliamente distribuida

39 Impacto de MSTN en el mercado de carne Gracias a un gen específico una forma de miostatina natural en la raza Piedmontes, puedes tener todos los beneficios nutricionales y el sabor que es saludable, bajo en grasa, bajo en colesterol y suave, siempre

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41 La Raza Charolais en México Se rechaza la característica de DM Para manejar este problema, se pueden utilizar estrategias para identificar los portadores del gen.

42 Detección de portadores de alelos asociados al fenotipo mh Homocigoto mh/mh Homocigoto +/+ Heterocigoto mh/+

43 Evaluación de la prevalencia del alelo Q204X en ganado Charolais de México Se ha realizado la prueba para detectar las variantes del alelo Q204X en 44 muestras de semen comercializado por la Asociación HerdBook de México. Se ha encontrado que la frecuencia del alelo Q204X en 44 sementales que es del 17%.

44 Frecuencia del Alelo Q204X en hatos de registro En un estudio realizado en dos hatos del estado de Jalisco, se ha encontrado una frecuencia de 22.9% de portadores mh/+ (CT) y de homocigotos mh/mh del 4.16% (TT). El origen del material genético con el que se mejoran los hatos se relaciona con su frecuencia.

45 IDENTIFICACIÓN DE LAS VIAS DE DISEMINACION DEL ALELO Q204X +/+ NECESSAIRE MELLARD *221/12 *125/23 +/+ mh/+ mh/+ +/+ mh/+ IMPERIAL *58/4 mh/+ +/+ ICARE mh/+ *496/65 mh/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ mh/+ ICARE mh/+ *496/65 mh/+ +/+ +/+ mh/+ +/+ +/+ +/+ +/+ mh/+ +/+ IJOUFFLU mh/+ +/+ +/+ *513/37 +/+ +/+ *Crías probadas/hatos, Asociación Charolais HerdBook de México (2009)

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47 Identificación de variantes génicas asociadas a características productivas

48 Selección asistida por marcadores (MAS) Es una herramienta que utiliza las pruebas de DNA para ajustar los valores genéticos (DEPs) de los animales medidos y genotipificados para un rasgo en particular para posteriormente usarlos en la selección. (Van Eenennaam, 2007).

49 Selección asistida por marcadores (SAM) Es aplicable para caracteres que: Tienen índice de herencia bajo (ej., resistencia a enfermedades y reproducción) Son difíciles o costosos de medir El animal tiene que ser sacrificado para cuantificarlo (canal, suavidad de la carne) (Van Eenennaam, 2012).

50 Marcadores de ADN asociados a calidad de la carne Suavidad: SNPs del sistema proteolítico de la calpaína (CAPN1) y calpastatina (CAST) sobre la suavidad de la carne de ganado Bos taurus 1, ganado Bos indicus y sus cruzas. Marmoleo: SNP ubicado en la región 5 no traducible del gen tiroglobulina (a -521 pb) y se denomina marcador TG5. (Page et al., 2002, 2004Casas et al., 2005; White et al., 2005).

51 Problemas en el uso de pocos marcadores Para SAM Los rasgos de calidad como la suavidad, marmoleo, crecimiento, reproducción, etc. son muy complejos, difícilmente son explicados por la variación en uno o varios genes y por lo tanto el uso de pocos marcadores no cubre el concepto de SAM.

52 Distribución de la varianza de los factores que influyen en el FENOTIPO

53 Se han desarrollado chips de ADN que permiten hacer pruebas de ADN no con uno o varios marcadores sino con miles de ellos.

54 Con los chips se acelera el descubrimiento de mutaciones causales que explican la variación genética entre razas

55 Selección Genómica (SAMgenómica) La selección Genómica Genomic selection (GS) es un método para estimar los valores genéticos con base a la tipificación del animal con un gran número de marcadores moleculares. Esto significa que a los métodos tradicionales que incluyen la información del pedigrí y fenotipo de un animal se le puede adicionar información que permite estimar valores de cría basados y ajustados con la información molecular.

56 Cuál es el valor de la integración de la información genómica en las Evaluaciones Genéticas? La inclusión de información sobre los marcadores en los cálculos EPDs tiene los siguientes beneficios : 1. Una mayor precisión en la selección de los animales jóvenes 2. Acortamiento del Intervalo generacional 3. Estimacion de EPDs para los rasgos nuevos (eficiencia, sanidad de del producto final, susceptibilidad a enfermedades)

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58 Evolución del diagnóstico molecular aplicado a la industria pecuaria 2003 Un marcador/un rasgo Adopción limitada 2008 Pruebas con diferentes marcadores reportadas en diferentes formatos ningún vínculo entre los resultados de las pruebas de ADN y las asociaciones nacionales de evaluación genética o raza EPDs-Potenciados por Genómica Genomic-enhanced EPDs 2012 paneles con miles de marcadores para muchos rasgos Resultados reportados en unidades para el rasgo Inclusión de la información de DNA en las evaluaciones genéticas nacionales 2020 presentación perfecta de los datos de genotipo a las asociaciones nacionales de evaluación genética / raza Información sobre el ADN utilizado para la trazabilidad, parentesco, defectos genéticos, selección, gestión asistida por marcadores, la diferenciación de productos odified from n Eenennaam GeneSeek 9/12/2012

59 Conclusión Las pruebas de ADN son una herramienta invaluable para la detección de alelos asociados a enfermedades genéticas y a rasgos de calidad y productividad. En el primer caso, esta herramienta es útil para disminuir o eliminar la frecuencia del alelo mutante; mientras que en el segundo permite incrementar o fijar la frecuencia de los alelos favorables para rasgos productivos específicos en los hatos ganaderos. Se propone que cada Asociación ganadera en México, considere el uso de las herramientas de diagnóstico molecular como una estrategia de monitoreo continuo de la salud, productividad y calidad genética de los hatos.

60 Gracias.