TEST DE GERMINACIÓN in vitro PARA DETECTAR MALEZAS RESISTENTES A HERBICIDAS.

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1 TEST DE GERMINACIÓN in vitro PARA DETECTAR MALEZAS RESISTENTES A HERBICIDAS. Jorge Díaz S., N. Espinoza N. y R. Galdames G. INIACarillanca, Casilla 58D, Temuco, Chile. jdiaz@inia.cl Resumen: Los herbicidas constituyen la principal herramienta de control de malezas en los cultivos extensivos, sin embargo, la variabilidad genética y presión de selección por la continua aplicación tiene como consecuencia el desarrollo de malezas resistentes (biotipos R). Este fenómeno de características evolutivas, estaría afectando en diferentes magnitudes a unas ha en Chile con biotipos R de ballicas (Lolium multiflorum Lam., L. rigidum Gaudin), avenilla (Avena fatua L.) y cola de zorro (Cynosurus echinatus L.). Los herbicidas a los que se está generando resistencia son a diclofop y clodinafop (inhibidores de ACCasa), iodosulfuron y flucarbazone (inhibidores de ALS) y glifosato (inhibidor de EPSFs). La prevención mediante una precisa y oportuna detección es el primer y más importante paso en el manejo de los biotipos R, orientando las estrategias de control y evitando su diseminación. Diversas metodologías han sido desarrolladas, las que consideran evaluaciones de la planta entera, pasando por determinadas estructuras vegetativas y reproductivas, midiendo la actividad de la enzima blanco del herbicida hasta modernas técnicas biotecnológicas, todas ellas con el fin de agilizar el diagnóstico de biotipos R. En este trabajo, se discuten y comparan las principales bondades de cada uno de los métodos, prestando especial atención a bioensayos que utilizan semilla. Este último ha permitido detectar respuestas diferenciales entre biotipos sensibles y resistentes en un período corto para varios grupos de herbicidas. Se describen los principales aspectos en el desarrollo y puesta punto de un test de germinación in vitro para ballicas, avenilla y cola de zorro. Los factores considerados fueron viabilidad, dormancia, condiciones de germinación de la semilla, y su respuesta a concentraciones de herbicidas y su correlación con la respuesta en planta. Finalmente, se concluye que el test cumple con ser preciso, rápido, simple de ejecutar y evaluar, características apropiadas para constituirse como un servicio de detección de biotipos R en un número importante de herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs. Palabras clave: bioensayo, biotipos R, ballica, avenilla, cola de zorro. Summary: Seed testing for detect weeds resistant to herbicides. Herbicide constitutes the main tool of weed control in the cereal crops, nevertheless, the genetic variability and pressure of selection by the continuous application has consequently developed resistant weeds (biotypes R). This phenomenon of evolutionary characteristics, is affecting in different magnitudes around 100,000 has in Chile with biotypes R of ryegrass (Lolium multiflorum Lam., L. rigidum Gaudin), wildoat (Avena fatua L.) and crested dogtailgrass (Cynosurus echinatus L.). The herbicides to which resistance is being generated are diclofop and clodinafop (inhibiting of ACCasa), iodosulfuron and flucarbazone (inhibiting of ALS) and glyphosate (inhibiting of EPSFs). The prevention by early detection is the first and more important stage of biotypes R management, orienting the control strategies and avoiding its dissemination. Diverse methodologies to detect its presence have been developed, those that consider evaluations of the whole plant, vegetative and reproductive structures; others that determined the activity of target enzyme

2 of herbicide up to biotechnological techniques, all of them with the purpose of making make agile the diagnosis of biotypes R. In this work, characteristics of the methods is discussed and compared, rendering special attention to seed biotests. This last one has allowed the detection of differentials answers between susceptible and resistant biotypes in a short time for several herbicides groups. The main aspects in the development of germination test for ryegrass, wildoat and crested dogtailgrass are described. The factors considered were viability, dormancy, conditions of seed germination, and their answer to concentrations of herbicides and their correlation with plant response. Finally, it is concluded that the test fulfills the following attribute precise, fast, simple to execute and to evaluate, and appropriate to be used in a routine service for biotypes R detection in important number of ACCase, ALS and EPSPs inhibitors herbicides. Key words: bioassay, biotype R, ryegrass, wildoat, crested dogtailgrass. Introducción Para los agricultores es trascendente el oportuno y adecuado control de las malezas, siendo los herbicidas una de las principales herramientas por su eficacia, fácil aplicación, bajo costo y flexibilidad agronómica. Sin embargo, un inadecuado manejo de esta herramienta esta favoreciendo el desarrollo de malezas resistentes a los herbicidas (biotipos R), particularmente a malezas gramíneas (DÍAZ et al., 2006; ESPINOZA et al., 2006). Trabajos realizados por INIA Carillanca han constatado una cantidad próxima a 50 biotipos de malezas gramíneas resistentes a diversos herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs (DÍAZ et al., 2005; DÍAZ et al., 2008a; DÍAZ et al., 2008), y que están afectando una superficie agrícola en torno a las ha dedicadas principalmente al cultivo de trigo (ESPINOZA & DÍAZ, 2005). En este contexto, la detección es considerada un paso fundamental en el manejo de los biotipos R para adoptar medidas preventivas y correctivas en el uso y manejo de los herbicidas, pero también como una herramienta de monitoreo en la distribución y propagación geográfica del problema. En la actualidad se han desarrollado diversos bioensayos basados en el estudio de planta entera, órganos vegetativos, parte de tejidos, semilla, polen, actividad y mutación de la enzima blanco de los herbicidas. Cada uno de estos métodos muestran ventajas para determinadas situaciones, pero lo más importante es que deben ser precisos, rápidos y de bajo costo. En este trabajo se revisan y comparan los diversos métodos de diagnósticos, y se presenta los principales aspectos en el desarrollo de un test rápido con semilla para detectar biotipos R de malezas gramíneas. Métodos de Detección Uno de los métodos más empleado consiste en medir las diferencias en el desarrollo de las plantas sometidas a diferentes dosis de herbicidas. Estos estudios de dosisrespuesta han representado, en muchos casos, el paso inicial en la determinación de biotipos resistentes. El estudio se inicia con la colecta de semilla, para luego obtener plantas que se hacen crecer bajo condiciones de invernadero o campo, cuantificando el efecto del herbicida varias semanas después de su aplicación (MOSS, 1995; BECKIE et al., 2000). Si bien es un método preciso tiene como principales desventajas el largo tiempo de respuesta, altos requerimientos de espacio físico, muy demandante en mano de obra, y consecuentemente de alto costo.

3 También se han desarrollado métodos a partir de plantas enteras o de órganos vegetativos que han sobrevivido al tratamiento de control en campo, las que son trasplantadas a macetas para luego ser sometidas a evaluación con diferentes herbicidas (VALVERDE et al. 2000; BOUTSALIS, 2001). Si bien son métodos que requieren un equipamiento simple, son laboriosos y demoran aproximadamente unas 4 semanas en la respuesta. Otras técnicas están basadas en determinadas estructuras de la planta como el polen y hoja. El polen, para lo cual se debe esperar a la floración de las plantas, se hace germinar en un medio de cultivo que contiene herbicida (LETOUZÉ & GAZQUEZ, 2000). Es un método que requiere de tiempo y de personal con mayores habilidades técnicas en comparación a los anteriores. El bioensayo que utiliza tejido foliar sólo detecta resistencia al herbicida glifosato (SHANER et al., 2005), teniendo como principales limitaciones el ser aplicable a un tipo de herbicida, requiere de personal altamente calificado y de un equipamiento más sofisticado que las técnicas mencionadas anteriormente. De forma paralela se han desarrollado bioensayos que miden la sensibilidad de la enzima blanco de los herbicidas. Los herbicidas resultan letales para las plantas debido a que actúan sobre un sitio de acción primario, generalmente una enzima de especial relevancia biológica para el desarrollo y crecimiento de la maleza. En esta relación tan específica entre enzima y herbicida, cualquier modificación en la estructura de la enzima (mutación), resulta en una pérdida de afinidad por su sitio de acción y consecuentemente una disminución en la eficacia del herbicida. En estos bioensayos se considera la extracción y evaluación in vitro de la actividad de enzimas como la acetolactato sintasa (ALS) y la enolpiruvil shiquimato sintasa (EPSFs) (SIMPSON et al., 1995; LOVELL et al., 1996; SINGH & SHANER, 1998). La aplicabilidad de estos bioensayos con fines prácticos tiene la desventaja de ser muy específico en el análisis del mecanismo de resistencia. Últimamente se está desarrollando mediante marcadores moleculares la detección de mutaciones en la enzima blanco de los herbicidas, técnica que se describe en otro capítulo del libro. Bioensayos con semilla para detectar biotipos R. Como alternativa a los métodos y técnicas anteriores se han desarrollado bioensayos con semilla que se caracterizan por su relativa rapidez y bajo costo operativo. La semilla se dispone sobre un sustrato inerte impregnado del herbicida, y se determina la respuesta midiendo parámetros como longitud de coleoptilo (HEAP & KNIGHT, 1986; BOURGOIS et al., 1997; SIXTO et al., 1997; DÍAZ et al., 2005), longitud de raíz (BECKIE et al.; 1990; COLLAVO et al., 2008), longitud del primordio foliar o de hoja (DE LA CARRERA et al., 1999; LETOUZÉ & GAZQUEZ, 1999; PÉREZ & KOGAN, 2002; DÍAZ et al., 2005), combinación de parámetros (TAL et al., 2000); sobrevivencia o germinación (MURRAY et al., 1996; PÉREZJONES et al., 2007). Estos bioensayos han demostrado ser una importante herramienta para un numeroso grupo de malezas y herbicidas, considerándose su alto potencial para utilizarse como un servicio de detección de malezas resistentes (DÍAZ et al., 2005). En los Cuadros 1, 2 y 3 se presenta una revisión a nivel mundial de bioensayos con semilla en malezas gramíneas, para detectar biotipos resistentes a herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs. Para los inhibidores de ACCasa existe información para unos 7 herbicidas de un total de 16 productos técnicos (HRAC, 2000) en especies del género Avena y Lolium, dando cuenta de las concentraciones que permiten discriminar entre un

4 biotipo sensible (S) del biotipo R, de los parámetros de medición y tiempos de respuesta que no superan las dos semanas (Cuadro 1). En el caso de los inhibidores de ALS, grupo conformado por 47 productos técnicos (HRAC, 2000), la información para especies del género Lolium, indican las concentraciones que permiten discriminar entre biotipo S y R para 3 productos, los parámetros de medición, y tiempos de respuesta que no superan los 10 días (Cuadro 2). Para L. multiflorum y el herbicida glifosato (Cuadro 3), también se cuenta con antecedentes de las concentraciones del herbicida, parámetros y tiempos de respuesta que permiten discriminar entre un biotipo R del S. Es importante destacar que en relación a los tiempos de respuesta, no está señalado o considerado tratamientos para la ruptura de dormancia de la semilla. Cuadro 1. Principales características de bioensayos con semilla para detectar resistencia de malezas gramíneas a herbicidas inhibidores de la ACCasa HERBICIDA MALEZA CONCENTRACIÓN DISCRIMINATORIA Parámetro Tiempo respuesta REFERENCIA Cantidad Basado en (μm) Fenoxapropp A. fatua 10 DL biotipo S Sobrevivencia S/I Murray et al, 1996 Setoxidim A. fatua 5 DL biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Clethodim A. fatua 1,5 >80% inh. biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Clodinafop A. fatua 3 >80% inh. biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Tralkoxidim A. fatua 5 >80% inh. biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Clodinafop A. sterilis 1 CL 50 Raíz 13 días Collavo et al Pinoxadem A. sterilis 0,5 CL 50 Raíz 13 días Collavo et al Clethodim A. sterilis 0,25 CL 50 Raíz 13 días Collavo et al Fenoxapropp Avena spp 21 No indica Brote 14 días Moss, L. rigidum 31 Umbral de 20 mm Coleoptilo S/I Letouzé et al, 1997 Letouzé & Gasquez 1999 Diclofopácido. Diclofopácido. L. rigidum 29,1mg/L CL 50 Raíz y brote S/I Tal et al., 2000 Clodinafopácido L. rigidum 0,06 mg/l CL 50 Raíz y brote S/I Tal et al., 2000 tralkoxidim L. rigidum 1,15 mg/l CL 50 Raíz y brote S/I Tal et al., 2000 Diclofop L. multiflorum 32 No especifica Brote > 1 cm 14 días Moss, 2000 Clodinafop Lolium spp 1 CL 50 Sobrevivencia 10 días Collavo et al., 2008 Pinoxadem Lolium spp 0,2 CL 50 Sobrevivencia 10 días Collavo et al., 2008 Clethodim Lolium spp 0,05 CL 50 Sobrevivencia 10 días Collavo et al., 2008 DL: Dosis Letal; CL 50 : Concentración Letal media; S/I: sin información Cuadro 2. Principales características de bioensayos con semilla para detectar ballicas resistentes a herbicidas inhibidores de ALS. HERBICIDA MALEZA CONCENTRACIÓN DISCRIMINATORIA Parámetro Tiempo respuesta REFERENCIA Cantidad (μm) Basado en Sulfometuron L. rigidum 0,027 >DL biotipo S hoja > 1cm No indica Burnet et al., Iodosulfuron L. multiflorum 0,9 mg /L CL 50 Coleoptilo 610 días Díaz et al, 2005 Flucarbazone L. multiflorum 3,6 mg /L CL 50 Coleoptilo 610 días Díaz et al, 2005

5 Cuadro 3. Principales características de bioensayos con semilla para detectar resistencia en L. multiflorum al herbicida glifosato (EPSFs). CONCENTRACIÓN DISCRIMINATORIA PARÁMETRO Tiempo respuesta REFERENCIA Cantidad (mg /L) Basado en 31,56 39,4 CL 50 Longitud Brote 8 días Pérez y Kogan, ,1 CL 50 Longitud hoja 610 días Díaz et al, ,8 160,3 CL 50 Germinación 7 días PérezJones et al, 2007 Estudios realizados para desarrollar un test de germinación in vitro. En la puesta a punto del método se debieron considerar varios aspectos críticos relacionados con la semilla, tales como la viabilidad, dormancia, condiciones de germinación, y relacionar la respuesta en semilla a los herbicidas con estudios en planta. Estudios en planta. Primeramente se caracterizó la respuesta de un amplio número de biotipos sospechosos de resistencia en ballicas, avenilla y cola de zorro colectados entre la VIII y X Regiones. Estos estudios se realizaron en invernadero con herbicidas inhibidores de ACCasa (diclofop y clodinafop), inhibidores de ALS (iodosulfuron y flucarbazone) e inhibidor de EPSFs (glifosato). Los herbicidas se aplicaron en una cabina de aplicación experimental a dosis crecientes de 0, X/2, X, 2X, 4X y 8X (X = dosis técnica de campo). La respuesta se evaluó entre los 18 a 21 días (Figura 1), determinándose el peso seco de la parte aérea (60 C durante 72 h). Los datos se analizaron con el modelo loglogístico (SEEFELDT et al., 1995), para determinar los valores de DL 50 (Dosis Letal media) para el biotipo resistente y sensible, y los factores de resistencia (FR = DL 50 R/ DL 50 S). Los resultados (Cuadros 4, 5 y 6) arrojaron un total de 8 biotipos R en ballicas al herbicida diclofop, 7 a clodinafop, 8 a idosulfuron, y 4 a glifosato. En avenilla se determinaron 2 biotipos R a diclofop y clodinafop. En cola de zorro 3 biotipos R a diclofop y clodinafop y 1 a flucarbazone. Con estos biotipos caracterizados se procedió a la ejecución de los estudios de germinación en semilla. Figura 1. Curvas de dosisrespuesta del biotipo R de ballica (LM20) y sensible (cv. Tama). Estudios en semilla. Para estos estudios se requiere de semilla viable y sin dormancia. Una semilla es dormante cuando no tiene la capacidad para germinar en un periodo específico de tiempo bajo cualquier combinación de factores físicos ambientales normales que sean favorables para su germinación. La semilla de malezas no escapan a esta situación y es conocida la dormancia innata de duración variable en especies del género Avena y Lolium. En la literatura se describe varios tipos de dormancia, como fisiológica, morfológica, morfofisiológica y física (FINCHSAVAGE & LEUBNERMETZGER, 2006), y para lo cual existen diversos tratamientos químicos y físicos con el fin de

6 incrementar la germinación (ISTA, 1976; ELLIS et al., 1985; CFIA, 1997; DÍAZ et al., 2007). La viabilidad de la semilla se determinó mediante el test de tetrazolium (ISTA, 1976; AOSA, 2000). Los resultados indicaron índices de viabilidad de 92 a 100% para la semilla de ballica, avenilla y cola de zorro. La Figura 2 presenta una semilla de avenilla viable (embrión coloreado) y otra inviable (embrión no coloreado). Posteriormente, se evaluó la germinación, determinándose que en semilla colectada durante la temporada fue la que presentó los mayores porcentajes de dormancia. Para la ruptura de la dormancia de la semilla se evaluaron diferentes tratamientos físicos (frío y descascarado) y químicos (KNO 3 y ácido giberélico) (ISTA, 1976; ELLIS et al., 1985; CFIA, 1997). Se lograron adecuadas respuestas para todas las especies, cuando se utilizó una combinación óptima en base a un pretratamiento físico seguido de otro químico que fue coaplicado durante la prueba de germinación. Estos ensayos se realizaron en una cámara de germinación calibrada con ciclos térmicos, fotoperiodo y humedad, descritos en la literatura para ballicas y avenilla; y para cola de zorro se utilizaron los de ballica (ISTA, 1976; CFIA, 1997). Figura 2. Test de tetrazolium en avenilla, mostrando semilla (cariópside) viable con embrión de color rojizo (izquierda) e inviable con embrión sin coloración (derecha). Resuelto los aspectos más críticos de la germinación, se procedió a la ejecución de los bioensayos, evaluándose una amplia gama de concentraciones (8 a 10 en progresión geométrica) de los herbicidas diclofop, clodinafop, iodosulfuron, flucarbazone y glifosato. Las evaluaciones se realizaron en dos momentos, 6 y 10 días en ballica, 10 y 15 días en avenilla, y 10 y 21 días en cola de zorro. De cada semilla se evaluaron la longitud del coleoptilo y raíz, ajustándose los datos al modelo de regresión loglogística (SEEFELDT et al., 1995), cuya expresión matemática es Y=C+((DC)/1+(x/ CL 50 ) b ). Para estimar los parámetros del modelo, los datos se sometieron a un análisis de regresión no lineal con un intervalo de confianza de 95% que incluía al cero y los coeficientes de determinación (R 2 ) de cada regresión (programa SigmaPlot 8.0). El factor de resistencia se calculó mediante el cuociente de la concentración requerida para lograr una reducción del 50% (CL 50 ) del parámetro evaluado versus la requerida para lograr este mismo efecto en el biotipo sensible (FR = CL 50 R/ CL 50 S). Se estableció como limite un valor igual o superior a 1,5 en el factor

7 de resistencia para designar a un biotipo como resistente. En los Cuadros 4, 5 y 6 se presentan los factores de resistencia obtenidos en planta y semilla, comprobándose la concordancia entre ambos tipos de estudio para detectar biotipos R. Los resultados obtenidos indican que las condiciones que se dieron para el manejo de la dormancia (4 días con un pretratamiento de frío), y posteriormente durante la germinación con un tratamiento químico para ruptura de dormancia junto a condiciones de temperatura, humedad y fotoperiodo, permitieron detectar biotipos R frente a determinadas concentraciones de herbicidas. El tiempo requerido por el test en ballica fue de 14 días para los herbicidas diclofop, clodinafop, iodosulfuron y glifosato; en avenilla el tiempo de respuesta alcanzó a 19 días para los herbicidas diclofop y clodinafop, y de 25 día en cola de zorro para los herbicidas diclofop, clodinafop y flucarbazone. En la Figura 3 se presenta un flujo con las principales etapas del test de germinación in vitro. Figura 3. Flujo del test de germinación in vitro: pretratamiento de frío (1); cámara de germinación con semilla de biotipo R y S en placas petri (2); evaluación (H: hoja; C: coleoptilo) (3) y análisis estadístico (4).

8 Cuadro 4. Factores de resistencia (FR = DL 50 (R)/DL 50 (S)) en ballicas (LM: L. multiflorum y LR: L. rigidum) con herbicidas ACCasa, ALS y EPSFs. Biotipo Diclofop Clodinafop Iodosulfuron Glifosato FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) LM16 LM19 LM20 LM22 LM26 LM30 LM32 LM33 LM34 LM45 LM54 1,6 2,4 3,6 11,2 4,0 2,1 4,9 7,3 14,5 20,6 7,2 20,6 2,1 5,0 8,9 7,7 7,7 7,7 8,3 3,9 28,5 88,2 20,7 33,8 3,8 5,9 1,6 3,4 4,4 4,7 9,5 2,1 1,8 1,5 21,0 22,4 6,0 2,0 2,3 1,5 68,0 22,0 9,0 9,2 17,0 102, LR25 5,3 27,6 2,7 188,0 5,7 2,0 FR (P): factor de resistencia en planta; FR(S): factor de resistencia en semilla. Cuadro 5. Factores de resistencia (FR = DL 50 (R)/DL 50 (S)) en avenilla (AF) con herbicidas ACCasa. Biotipo Diclofop Clodinafop FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) AF1 AF2 10,6 8,2 2,7 3,3 2,7 2,2 14,9 10,7 FR (P): factor de resistencia en planta; FR(S): factor de resistencia en semilla. Cuadro 6. Factores de resistencia (FR = DL 50 (R)/DL 50 (S)) en cola de zorro (CE) con herbicidas ACCasa y ALS. Biotipo Diclofop Clodinafop Flucarbazone FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) CE3 CE4 CE10 17,2 12,9 9,2 14,9 17,4 6,8 1,8 7,8 3,2 11,9 81,0 71,0 1,5 1,8 FR (P): factor de resistencia en planta; FR(S): factor de resistencia en semilla. Conclusiones Para los biotipos de ballicas, avenilla y cola de zorro y herbicidas evaluados, se comprobó que existe una buena correlación entre la respuesta de germinación in vitro con la respuesta en planta para la identificación de resistencia. El test con semilla tiene un adecuado nivel de sensibilidad, dado que detecta biotipos con bajos niveles de resistencia en planta. También se comprobó la rapidez de respuesta, ya que se pudo identificar la resistencia en un plazo de 14, 19 y 25 días para ballicas, avenilla y cola de zorro, respectivamente. En consecuencia, se considera que este test cumple con las características de precisión, rapidez, simplicidad de ejecución y evaluación, y bajo requerimiento de espacio físico en comparación al bioensayo con planta. Todo lo anterior revela que este test incorpora características apropiadas para implementarse como servicio rutinario en la detección de ballicas, avenilla y cola de zorro resistentes a un número importante de herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs. Agradecimiento Este trabajo fue financiado por el Proyecto FONDEF D04I1022.

9 Bibliografía AOSA Association of official seed analyst. Tetrazolium Testing Handbook. Ed. J. Peters. Contribution Nº 29. New Mexico, USA. Disponible en (accesado en marzo 2009). BECKIE, H., HEAP, I.M., SMEDA, R.J. & HALL, L.M Screening for herbicides resistance in weeds. Weed Tech. 14 (2): BECKIE, H., HEAP, I., SMEDA, R. & HALL, L Screening for herbicide resistance in weeds. Weed Tech. 14 : BOUTSALIS, P. 2001; Syngenta quicktest : a rapid wholeplant test for herbicide resistance. Weed Tech. 15 (2): BURGOIS, L., KENKEL, N. C. & MORRISON, I. N Characterization of crossresistance patterns in acetylcoa carboxylase inhibitor resistant wild oat (Avena fatua) Weed Science 45: BURNET, M.W.M.; HART, Q., HOLTUM, J.A.M. & POWLES, S.B Resistance to nine herbicide classes in a population of rigid ryegrass (Lolium rigidum). Weed Science 42: CFIA Canadian methods and procedures for testing seed. Laboratory Services Division. Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canada. Disponible en (accesado en marzo 2009). COLLAVO, A., FREZZA, A.& SATTIN, M Rapid assay for detection of ACCaseinhibitor resistance in grass weeds: Avena sterilis, Lolium spp and Phalaris paradoxa. 5 th International Weed Science Congress. Vancouver, BC, Canada. DE LA CARRERA, N., VILLARROYA, M., CHUECA, M.C. & GARCÍA_BAUDIN, J.M Evaluation of Lolium rigidum biotypes resistance to chlorsulfuron: useful parameters. Brighton Crop Protection Conf. Weeds 1: DÍAZ, J., ESPINOZA, N., GALDAMES, R., RUIZ, E. Y DE PRADO, R. 2008a. Determinación de factores de resistencia en avenilla (Avena fatua) y cola de zorro (Cynosurus echinatus) con herbicidas inhibidores de ACCasa y ALS. XVIII Congreso de La Asociación Latinoamericana de Malezas (ALAM). 48 mayo de U. Federal de Ouro Petro, MG, Brasil. DÍAZ, J., ESPINOZA, N., GALDAMES, R., RUIZ, E. Y DE PRADO, R. 2008b. Curvas de dosisrespuesta en ballicas (Lolium multiflorum y L. rigidum) resistentes a herbicidas inhibidores de ACCAsa y ALS. XVIII Congreso de La Asociación Latinoamericana de Malezas (ALAM). 48 mayo de U. Federal de Ouro Petro, MG, Brasil. DÍAZ, J., ISLA, P., ESPINOZA, N. Y GALDAMES, R Estimulación de la germinación en malezas gramíneas resistentes a herbicidas. 58º Congreso Agronómico de Chile septiembre de U. De Tarapaca, Arica, Chile.

10 DÍAZ, J., ESPINOZA, N., Y GALDAMES, R Malezas resistentes a herbicidas. I. Encuesta a agricultores entre la VIII y X Regiones. 57 Congreso Agronómico de Chile octubre de U. Santo Tomás, Santiago, Chile. DÍAZ, J., ESPINOZA, N. y GUTIERREZ, C Ryegrass (Lolium multiflorum Lam.) biotype resistant to glyphosate, glyphosatetrimesium, iodosulfuron and flucarbazone Na in the main cereal area of Chile. Disco Compacto. 7th International Wheat Conference. Nov 27 Dec 2, Mar del Plata, Argentina. ELLIS R.H., HONG, T.D. & ROBERTS, E.H Seed technology for genebanks. Handbooks for genebanks Nº 3. Vol. 2. Seed technology for genebanks. International Board for Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. Disponible en (accesado en marzo 2008). ESPINOZA, N., DÍAZ, J. Y GALDAMES, R Malezas resistentes a herbicidas: II. colecta de ballicas en la VIII, IX y X regiones y respuesta a herbicidas selectivos 57 Congreso Agronómico de Chile octubre de U. Santo Tomás, Santiago, Chile. ESPINOZA, N. Y DÍAZ, J Situación de la resistencia de malezas a herbicidas en cultivos anuales en Chile. Seminario Taller Iberoamericano: Resistencia a herbicidas y cultivos transgénicos. 68 diciembre de Colonia Del Sacramento, Uruguay. FINCHSAVAGE, W. & EUBNERMETZGER, G Seed dormancy and the control of germination. New Phytologist 171: HRAC.2000.Herbicide Resistance Action Committee. The world of herbicides. Disponible en (accesado en septiembre 2009). HEAP, I. & KNIGHT, R The occurrence of herbicide crossresitance in a population of annual ryegrass, Lolium rigidum, resistant to diclofopmethyl. Australian Journal of Agricultural Research 37: ISTA Reglas internacionales para ensayos de semillas. 184 p. International seed testing association. Ministerio de Agricultura, Madrid, España. LETOUZÉ, A. & GAZQUEZ, J A pollen test to detect ACCase targetsite resistance within Alopecurus myosuroides populations Weed Research 40 (2): LETOUZÉ, A. & GASQUEZ, J A rapid test for screening aryloxyphenoxypropionic acid resistance within Alopecurus myosuroides and Lolium spp. populations. Weed Research 39: LETOUZÉ, A., GAZQUEZ, J., VACCARA, D., ORLANDO, D., LETERRIER, J.L., ROY, C. & BOUVARDDERIEUX, E Development of nuew reliable quick test and state of grassweed herbicide resistant in France. Brighton Crop Prot. Conf. Weeds 1:

11 LOVELL, S.T., WAX, L.M., SIMPSON, D.M. & MCGLAMERY M Using the in vivo acetolactate synthase (ALS) assay for identifying herbicideresistant weed. Weed Tech. 10: MOSS, S.R Techniques for determining herbicide resistance. Brighton Crop Prot. Conf. Weeds 2: MOSS, S.R The Rothamsted Rapid Resistance Test for detecting herbicide resistance in annual grass weeds. Weed Sci. Soc. Am. Abstracts 40:4243. MURRAY, B.G., FRIESEN, L.F. & BEAULIEU, K.J A seed bioassay to identify acetylcoa carboxilase inhibitor resistant wildoat (Avena fatua) populations. Weed Tech. 10:8589. PÉREZ A. & M. KOGAN Glyphosateresistant Lolium multiflorum in Chilean orchards. Weed Research 43:1219. PÉREZJONES, A., PARK, KW., POLGE, N., COLQUHOUN, J.& MALLORYSMITH, C.A Investigating the mechanisms of glyphosate resistance in Lolium multiflorum. Planta 226: SEEFELDT S.S., JENSEN, S.E. & FUERST, E.P Loglogistic analysis of herbicide doseresponse relationship. Weed Tech. 9: SHANER, D.L., NADLERHASSAR, T., HENRY, W. B. & KOGER, C. H A rapid in vivo shikimate accumulation assay with excised leaf discs. Weed Science 53 (6): SIMPSON, D.M., STOLLER, E.W. & WAX, L.M An in vivo acetolactate synthase assay. Weed Tech. 9:1722. SINGH, B.K. & SHANER, D.L Rapid determination of glyphosate injury to plants and identification of glyphosateresistant plants. Weed Tech. 12 (3): SIXTO, H., ESCORIAL C., GARCÍABAUDIN, J.M. Y CHUECA, M.C Efecto del herbicida glifosato sobre la germinación de semillas de cereales. Método rápido de selección. Actas Congreso SEMh Valencia. Pp:9396. TAL, A., KOTOULASYKA, E. & RUBIN, B Seedbioassay to detect grass weeds resistant to acetyl coenzyme A carboxylase inhibiting herbicides. Crop Prot. 19: VALVERDE, B., RICHES, CH. R. & CASELEY, J.C Prevención y manejo de malezas resistentes a herbicidas en arroz. Experiencias en América Central con Echinocloa colona. Costa Rica. 135 pp.